文摘
淋病奈瑟氏菌(非政府组织)已经开发出多种免疫逃避机制包括先天和适应性免疫反应。最近的研究报告说,非政府组织降低了il - 1β人类monocyte-derived感染巨噬细胞(MDM)的分泌。在这里,我们调查的角色三磷酸腺苷(ATP)的生产和释放il - 1β在Ngo-infected MDM。我们发现Ngo-infected MDM ATP增加il - 1的接触β水平相比未曝光的十倍Ngo-infected MDM ()。然而,我们没有观察到任何变化inflammasome speck-like蛋白质包含半胱天冬酶转录激活域(卡)(ASC,招聘)和caspase-1 (CASP1,)。此外,ATP是无法修改Ngo-infected MDM但caspase-1活动能够增加pyroptosis ()。尤其是ATP治疗定义增加il - 1的阳性染色β用一种独特的细胞内的分布模式。总的来说,这些数据表明,ATP产生il - 1β分泌的机制与NLRP3 ASC / caspase-1轴,可能是代理的泡贩卖或孔隙的形成。
1。介绍
淋病奈瑟氏菌(非政府组织)或淋菌,革兰氏阴性双球菌,性传播细菌感染的病因代理人(STI)淋病。淋病是第二个最常见的性病在世界范围内,新的淋病病例总数在成年人估计有1.061亿例与STI(4.989亿1]。临床数据也表明,先前的淋球菌感染不改善再感染患者的免疫反应,这表明免疫记忆不是淋菌引起的2]。对淋菌无效的免疫反应是多因素疾病以来,它一直猜测它可能是不同的机制的总和。其中一个可能与生殖器组织属性,如免疫特权网站女性束(3,4),而其他可能涉及逃税机制本质上开发的细菌,如阶段和抗原的变化(5],抗原决定基拟态[6),和吞噬体subversion克服免疫防御7]。另一方面,非政府组织有几个逃避complement-mediated防御机制,如洛杉矶sialylation [8补体级联)和绑定PorB分子抑制剂因子H和补体因子4 b-binding蛋白质(C4BP) [9]。
目前的数据表明,非政府组织能够抑制保护各级天生的细胞免疫反应。尽管吞噬作用的中性粒细胞(中性粒细胞)通常是一个死胡同细菌,它已经表明,细胞内非政府组织细胞的数量和每个细胞内的细菌数量在中性粒细胞吞噬体随着时间的增加(10- - - - - -12]。此外,非政府组织使用多种机制来抵御其他活性氧;nonoxidative中性粒细胞抗菌因素必须作用于细菌,这意味着这些因素不足以明确感染(13]。(MΦ)另一方面,巨噬细胞和树突状细胞(DC)是至关重要的细胞的先天免疫反应;它已经表明,非政府组织强有力地抑制的能力antigen-primed从直流(BMDC)触发t细胞增殖,诱导免疫抑制细胞因子的表达和致耐细胞表面蛋白14]。最近我们实验室的研究表明,人类monocyte-derived巨噬细胞(MDM)诱导M2概要文件时感染了非政府组织。没有观察到显著差异在il - 1β水平相比gonococcus-treated巨噬细胞和M0-macrophages表明非政府组织可能引发il - 1不足β水平激活先天免疫反应,导致慢性炎症状态,没有破坏病原体(15]。
il - 1β被描述为一个至关重要的促炎细胞因子感染宿主防御反应和损伤(16]。il - 1β需要两个独立的信号适当活跃和发布功能:启动步骤,第一信号响应(PAMP时)诱发pro-IL-1病原体相关分子模式β表达式[17pro-IL-1)和第二个信号转换β在其成熟和函数形式(il - 1β适当的释放。第二个信号是由一个名为inflammasome的蛋白质复合体,这提示il - 1的激活β转换酶caspase-1 [18),虽然它已被证明在其他细胞和中性粒细胞,il - 1的生产β并不完全依赖于caspase-1和几个丝氨酸蛋白酶包括CG、NE和PR3还可以处理pro-IL-1吗β(19]。
在巨噬细胞,多个不同的细菌产品信号刺激NLRP3 inflammasome,导致的蛋白水解激活caspase-1 [20.- - - - - -22]。NLRP3有三重结构与PAMP时/危险相关的分子模式(潮湿)传感c端富亮氨酸重复(远程雷达),一个中央核苷酸绑定(或纳赫特)领域,和一个氨基端pyrin域(PYD) [23]。PYD域NLRP3新兵的衔接分子凋亡speck-like蛋白质包含半胱天冬酶招聘领域(ASC),这新兵pro-caspase-1并产生caspase-1激活(23]。
许多病原体不同的机制来扰乱inflammasome激活,因此il - 1β生产(24]。因此,搜索策略来克服这种破坏是需要解决的一个重要目标。迄今为止,三个模型的NLRP3激活微生物反应提出了配体:K+流出,溶酶体破裂,ROS生产25- - - - - -27]。此外,内源性抑制细胞外ATP等巨噬细胞产生各种细胞的影响,包括一个成熟和释放il - 1β由inflammasome激活(28]。ATP可以分泌在广泛的条件下,包括抗原表示和巨噬细胞与细菌或微生物等产品的有限合伙人(29日]。在体外研究表明,ATP的结扎P2X7还会杀死细胞内披衣菌、分枝杆菌感染巨噬细胞(30.- - - - - -32]。此外,牙龈上皮细胞感染p . gingivalis分泌il - 1β只有在刺激与细胞外ATP (33]。因此,我们测试的假设添加外源性ATP促进il - 1的来源β处理和释放在非政府组织在人类monocyte-derived感染巨噬细胞(MDM)。我们表明,ATP刺激增加il - 1的分泌β在Ngo-infected MDM。有趣的是,高水平的il - 1β不与激活inflammasome-mediated caspase-1,正如前面观察到在其他微生物(33- - - - - -35]表明ATP-induced il - 1β分泌可能是代理的机制与泡贩卖或孔隙的形成。
2。材料和方法
2.1。血液样本
人类淡黄色的外套是由志愿者知情同意后提供。这项研究是科学伦理委员会批准的医院Clinico智利大学(批准文号58)。样本收集、试验数量后被分配到每个捐赠者与他们的人口数据和数据库是匿名的。
2.2。细菌和培养条件
淋病奈瑟氏菌P9-17菌株用于本研究提供的请Myron Christodoulides博士(英国南安普顿大学)。淋球菌的瓶被从冻结的股票,镀上金缕梅马丁板块(LaboratorioLinsan、智利),和培养在37°C公司5%218到20个小时。单一的殖民地与公益诉讼+Opa+表型分离了后续实验。
2.3。Monocyte-Derived巨噬细胞(MDM)的一代
人类单核细胞从正常献血者巴菲外套通过两步梯度离心法紧随其后的是一个额外的步骤使用RosetteSep™人类单核细胞浓缩鸡尾酒(干细胞的技术)。Monocyte-derived巨噬细胞培养获得的(MDM)单核细胞CD14 (84%+)7天的RPMI 1640 (GIBCO,英杰公司公司)补充10%的边后卫(HyClone), 50 U /毫升青霉素、50μg / mL链霉素(Gibco表达载体),50 ng / mL - csf (MiltenyiBiotec) 6-well盘子2×10的密度6细胞每口井。
2.4。ATP的解决方案准备
必要数量的ATP(产品编号A6419 Sigma-Aldrich,密苏里州,美国)在埃普多夫管实验重。十分钟前细胞刺激,ATP是稀释在nonsupplemented rpmi - 1640中生成一个10毫米ATP的解决方案。然后使用注射器过滤器(ATP的解决方案是过滤孔径0.2μ米),立即添加到细胞浓度达到5毫米。
2.5。MDM感染和治疗ATP
细菌悬浮液准备在1毫升血清RPMI1640媒介。MDM感染了非政府组织在感染复数(MOI) 100 4小时37°C和5%的公司2。然后用庆大霉素(100文化治疗μg / mL)(英杰公司公司,卡尔斯巴德,CA)为2 h杀死细胞外细菌在37°C和5%的公司2。媒介取代nonsupplemented(无血清和不需抗生素)RPMI然后5毫米ATP(美国密苏里州Sigma-Aldrich)添加和孵化30分钟37°C公司5%2。最后,收集上层清液il - 1β,而细胞RNA提取的细胞溶解。
2.6。测量分泌il - 1β
il - 1β水平测定在上层清液30分钟后立即治疗与ATP酶联免疫吸附测定使用ELISA Ready-SET-Go !(美国eBioscience灵敏度2 pg / mL),根据制造商的指示。
2.7。实时定量PCR(存在)
总RNA提取(纯化)从MDM如前所述36]。逆转录(5μg)都使用了Transcriptor合成第一链cDNA工具包后,制造商的建议(罗氏应用科学,曼海姆,德国)。量化mRNA的表达il - 1β,NLRP3,ASC,CASP-1,50 ng cDNA放大定量实时PCR使用适当的引物和SybrGreen主混合(Fermentas) StepOne™实时PCR系统(应用生物系统公司™,加州,美国)。循环程序使用10分钟95°C,紧随其后的是40 95°C的周期15秒,60°C 30年代,30年代的72°C。引物序列如下:5′-CTTCCTTTCCAGTTTGCTGC-3′, 5′-TCTCGCAGTCCACTTCCTTT-3′逆转NLRP35′-AGTTTCACACCAGCCTGGAA-3′, 5′-TTTTCAAGCTGGCTTTTCGT-3′逆转ASC5′-GCCCAAGTTTGAAGGACAAA-3′, 5′-GGTGTGGAAGAGCAGAAAGC-3′逆转CASP-15′-CTGTCCTGCGTGTTGAAAGA-3′, 5′-TTGGGTAATTTTTGGGATCTACA-3′il - 1的逆转β向前,和5′-CTAACACGGGAAACCTCAC-3′, 5′-CGCTCCACCAACTAAGAACG-3′扭转为18岁。目标基因的表达的褶皱变化相对于内生控制被设定为18岁,ΔΔCt = (CtTarget−Ct18S)刺激−(CtTarget−Ct18S)如果。
2.8。保持酶的活性检测Caspase-1流式细胞术和细胞凋亡
一个FAM-FLICA caspase-1分析工具包(免疫化学技术)是用于检测caspase-1酶活性根据制造商的指示。FLICA稀释,添加到井含有感染,ATP-treated或参与细胞。4小时的细胞培养和MDM被收集并进行flow-cytometric分析(Facscalibur,正欲,圣地亚哥,美国)量化FAM-FLICA-positive MDM的百分比。MDM细胞凋亡测定用FITC膜联蛋白V凋亡检测设备与7-AAD (BioLegend)。数据分析使用WinMDI 2.8(免费)。
2.9。免疫荧光显微镜分析
巨噬细胞种植在12毫米的盖玻片24-well盘子和治疗使用先前描述的相同的细胞培养条件。30分钟后ATP的刺激,细胞上清液被和盖玻片洗两次与无菌PBS 1 x,然后和4%多聚甲醛固定细胞在100毫米管道缓冲pH值6.8中,包含40毫米KOH, MgCl EGTA 2毫米,2毫米230分钟。然后,细胞被洗了三次清洗解决方案(50 mMTris缓冲pH值7.6包含0.15 N叠氮化钠氯化钠和0.1%)和permeabilized 0.1% Triton x - 100在清洗解决方案10分钟,洗两次,然后用2%牛血清白蛋白阻塞了60分钟。细胞内il - 1β被染色的细胞评估与anti-IL-1吗βRb帕布1:100稀释(美国abcam ab2105),紧随其后的是一只山羊anti-rabbit免疫球蛋白(H + L)二级抗体,Alexa萤石®488共轭(A11008,生活技术)1:100稀释。核染色进行了使用DAPI (D9542 Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)。盖玻片是洗两次,安装在与DAKO荧光显微镜载玻片安装介质(美国北美DAKO Inc . CA)和样本可视化共焦显微镜(卡尔蔡司、模型LSM700)。
3所示。结果
3.1。n球菌诱导il - 1β但转录抑制il - 1β在MDM分泌
之前我们实验室的研究表明,il - 1β在上层清液从非政府组织——感染巨噬细胞在不同月没有明显不同于nonstimulated MDM (15]。在这些结果进一步探索,我们旨在检测il - 1的存在β从MDM感染了非政府组织在100莫伊。如图1(一)巨噬细胞感染非政府组织没有显示il - 1β比未感染巨噬细胞分泌。事实上,il - 1β巨噬细胞分泌的接触有限合伙人远远超过il - 1β由Ngo-infected巨噬细胞分泌。然而,当总pro-IL-1 mRNA水平β被qPCR评估,我们发现pro-IL-1吗βRNA水平高度诱导对淋球菌的感染(图1 (b)),这表明非政府组织能够触发信号通路pro-IL-1开始β合成。
(一)
(b)
3.2。ATP增加il - 1β在文化水平从Ngo-Infected巨噬细胞上清液
因为成熟的il - 1的合成β取决于激活NLRP3 inflammasome信号通路作为第二信号(37),我们旨在刺激NLRP3 inflammasome在Ngo-infected MDM使用同源受体激动剂(ATP) [38),建立淋菌是否修改NLRP3 inflammasome活动。我们的研究结果表明,低水平的分泌il - 1β从Ngo-infected MDM增加ATP(图的存在2)。ATP的使用能够产生类似的细胞因子的生产在LPS刺激Ngo-infected MDM MDM。它表明非政府组织显然能够防止inflammasome激活。
3.3。ATP不激活NLRP3 Inflammasome Ngo-Infected MDM RNA表达
因为细菌病原体采取的策略之一是inflammasome subversion (21)和ATP的使用导致宿主免疫反应对细胞内的细菌,通过它能够刺激P2X7-dependent il - 1β分泌(29日),我们决定研究是否inflammasome组件NLRP3,ASC和caspase-1 (CASP-1)可能被修改的MDM ATP治疗感染。从4个独立的实验中获得的数据表明,ATP只修改了RNA的表达水平NLRP3在感染的MDM,的水平ASC和CASP-1与nonstimulated感染细胞无显著差异(表1)。
3.4。ATP Ngo-Infected MDM但不修改Caspase-1活动能够增加Pyroptosis
Caspase-1激活处理pro-IL-1是必要的β在成熟的il - 1β,但ATP是无法产生的转录激活CASP-1;因此我们评估是否能够修改ATP在Ngo-infected MDM caspase-1活动,使用荧光活性caspase-1酶抑制剂探针FAM-YVAD-FMK标签。获得的数据从3独立实验表明,ATP治疗Ngo-infected MDM无法诱导caspase-1在感染细胞(图的激活3)。激活caspase-1触发细胞死亡的一种形式,也称为pyroptosis [39]。虽然台盼蓝染色显示,大多数细胞可行的感染和ATP治疗后,我们进行了FITC膜联蛋白V (AV)与7-aminoactinomycin (7-AAD)细胞凋亡检测化验监测pyroptosis ATP-induced细胞。考虑到pyroptosis的特点是积极的染色与AV与消极7-AAD染色(40),我们比较AV的百分比+7-AAD−细胞。ATP能诱导细胞凋亡的早期阶段在gonococcus-infected MDM(图4)。
(一)
(b)
(一)
(b)
3.5。ATP影响il - 1的细胞内的分布β在Ngo-Infected MDM细胞
自从NLRP3 inflammasome并不参与ATP-induced il - 1β分泌gonococcus-infected MDM,我们旨在观察ATP的非经典数理il - 1诱导β分泌的微泡形成(41]。Ngo-infected MDM对待ATP观察il - 1细胞内分布的成熟β通过免疫荧光共焦显微镜。值得注意的是,ATP治疗Ngo-infected MDM定义增加il - 1的阳性染色β分布(图的一种独特的模式5 (c)对膜)作为焦点的形成。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
目前的数据表明,非政府组织产生缺乏保护性免疫反应的诱导巨噬细胞和树突细胞(14,15,42]。最近发现我们的实验室已经认识到MDM诱导M2概要文件时感染了非政府组织和il - 1没有达到显著差异βgonococcus-treated巨噬细胞之间的水平和M0-macrophages15]。在这项工作中,我们证实了低水平的il - 1β在人类Ngo-infected MDM(图1(一))。我们的数据与邓肯等人报道的不同表明,非政府组织可以促进NLRP3激活和il - 1β在人类巨噬细胞分泌THP-1细胞(43]。这种差异可能是由于THP-1细胞系的显著区别(单核细胞的性质)44和巨噬细胞。增加本构caspase-1激活(45)和随后的il - 1β由单核细胞分泌后TLR刺激很容易被识别,而巨噬细胞需要第二个信号(46]。此外,我们表明,巨噬细胞M1, M2的倾斜状态,当感染了非政府组织,有低水平的toll样receptor-4(地)15),已被证明能够起到关键作用诱导的炎症通路(47]。
细胞因子il - 1β是由两个检查点:转录和成熟和释放48]。我们的第一个结果显示低水平的成熟的il - 1β在人类Ngo-infected MDM上层清液。然而,当我们看着转录水平,显示相当感应的il - 1βRNA在淋球菌的感染(图1 (b))。il - 1的转录与翻译的差异β淋菌诱导的MDM细胞可能是由于中断inflammasome活动见其他病原体(20.]。因为对细菌细胞内ATP引起宿主的免疫反应通过刺激il - 1的能力β分泌(29日),我们表明,ATP gonococcus-infected MDM细胞的治疗可以恢复il - 1β分泌(图2),如牙龈上皮细胞感染所示p . gingivalis,它只分泌il - 1β刺激后细胞外ATP (33]。后建立了ATP对il - 1的影响β生产gonococcus-treated MDM,我们检查了mRNA的表达NLRP3 inflammasome-associated基因:NLRP3,ASC,CASP-1评估inflammasome转录活动存在ATP。只有NLRP3成绩单在Ngo-infected MDM调节细胞ATP(表处理1)。到目前为止,ATP的确切作用机制的转录inflammasome是未知的。然而,这并不奇怪的表情NLRP3是影响ATP,因为ATP释放可能作为危险信号动员胞内钙、进一步调制NF -κB通过P2Y受体激活代理/磷脂酶c /钙信号通路(49]。在这种背景下,NF -绑定序列的存在κ已经证明了B NLRP3启动子在小鼠巨噬细胞50]。
有趣的是,我们没有发现任何转录水平的变化ASC和CASP-1在Ngo-infected巨噬细胞ATP(表处理1)。的nonchange的表达水平ASC和CASP-1可以解释,因为不像NLRP3,其转录调控与MyD88无关和NF -κB (51]。符合这一点,我们认为没有ASC转录水平的变化会影响caspase-1活动ATP,因为适配器的功能蛋白质ASC inflammasome启用caspase-1的激活。事实上,Asc−−/巨噬细胞分泌il - 1更成熟β比野生型同行美国沙门氏菌感染全身caspase-1激活模式52]。
虽然我们没有观察CASP-1转录水平的变化,我们评估了caspase-1活动Ngo-infected MDM细胞ATP处理。我们没有观察到任何更改caspase-1活动MDM感染细胞之间有或没有ATP。有趣的是,在我们的模型的MDM细胞,感染非政府组织不引起pyroptosis与未感染的MDM细胞相比,邓肯与所报道的et al .,谁表明,非政府组织感染促进NLRP3-dependent THP-1通过pyronecrosis[细胞死亡43]。然而,当感染MDM细胞ATP,对待我们观察到早期凋亡细胞(AV的感应+7法−)。尽管pyroptosis caspase-1-dependent,我们不抛弃其他诱导细胞凋亡的机制。所显示的以前的作品,细胞外ATP诱发凋亡信号在不同的细胞类型使用不同的通路链接purinergic受体诱导细胞凋亡和坏死53- - - - - -55]。
我们的结果表明,ATP是无法激活caspase-1 Ngo-infected巨噬细胞RNA和蛋白质水平(表1和图3)。自从pro-IL-1β和pro-IL-18基质在体外和在活的有机体内caspase-1 [56),我们假设il - 1βNgo-infected巨噬细胞分泌引起ATP可能从pro-IL-1在另一个层面β处理NLRP3 inflammasome。在最近的一份报告中学习Porphyromonas gingivalis -感染小鼠巨噬细胞il - 1β分泌抑制了病原体菌毛通过inflammasome独立P2X7R机制,表明,在这种病态的上下文,il - 1β没有是由于涉及P2X7R[未知分泌信号通路57]。
使用共焦显微镜,我们试图本地化的存在和分布成熟的il - 1β,清晰可见,Ngo-infected MDM诱导成熟il - 1的一个模式β安排染色点分散的细胞。这种分散的成熟的il - 1β彩色点改为集中和极化点(图5)。自分泌il - 1的机制β不符合经典的细胞因子ER-Golgi通路(58)及其分泌可能是由细胞内囊泡分泌溶酶体胞外分泌,或直接通过细胞膜(41),我们推测downmodulation il - 1的可能性之一β由淋菌分泌可能是由于一种机制与孔隙的形成有关。的确,细胞膜pyroptosis期间,毛孔开放,这种结构性变化将促进interleukin-1细胞释放β(39]。此外,如图所示,Pelegrin和Surprenant pannexin-1 (Panx1)可能是一个功能之间的联系P2X7R-activated大孔隙形成巨噬细胞和细胞因子释放。从这个意义上讲,P2X7-receptor的激活触发器的招聘辅助成孔机制(59,60];Panx1蛋白击倒和panx1-mimetic抑制肽能够阻止ATP-mediated il - 1β在老鼠和人类巨噬细胞(61年]。这个问题不是在这工作和评估还需要进一步的研究来调查这一现象。
5。结论
在这项工作中,我们证明了n球菌可能躲避宿主防御不激活NLRP3 inflammasome在巨噬细胞和显示,细胞外ATP可能采取行动的泡贩卖或孔隙的形成。更好的理解机制产生il - 1βdownmodulation通过淋菌将进一步促进知识的进步n球菌发病机制,让我们找到一个治疗淋菌感染的治疗策略。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
这项工作是支持格兰特FIOUCH捆扎003/2015 Direccion de Investigacion Facultad de Odontologia智利大学。作者要感谢胡安费尔南德斯先生从教师的语言和翻译服务请校对和检查拼写和语法。