文摘

目的。肺结节病与细胞内的microrna的表达特异表达有关。然而只有小细胞外microrna及其与疾病的联系信息在结节病。因此我们评估血清microrna在结节病分类根据洛夫格伦综合征的存在(LS)作为预后良好的标志与更先进的疾病过程。方法。rt - pcr是用来评估35 microrna在13个健康对照组和24结节病患者(12 x射线(CXR)阶段1和LS和12个阴险的发病和CXR阶段3)。结果。控制相比,我们持续观察mir - 146的表达特异表达,miR-16, mir - 425 - 5 - p,和mir - 93 - 5 - p在结节病组无论疾病。具体地说,病人没有LS特异表达的表情mir - 150 - 5 - p, miR-1, mir - 212相比,控制。患者LS表达miR-21-5p特异表达和mir - 340 - 5 - p控制相比。生物信息学预测持续“癌症通路”调制的患者改变配置文件/ LS。三个microrna (miR-21-5p, mir - 340 - 5 - p,和mir - 212 - 3 - p)不同患者之间LS和那些没有LS;他们的累积效应可能调节“TGF -β信号通路。”结论。进一步的研究应该关注可能的应用程序诊断血清microrna的随访和预后。

1。介绍

肺结节病是一种原因不明的炎性肉芽肿性疾病(s) (1]。结节病的病程和预后有很大区别。高速率的自发缓解患者在疾病早期的星座特性称为洛夫格伦综合征。另一方面,一个阴险的疾病的发作没有洛夫格伦综合征可能是紧随其后的是进步的纤维化(1]。

结节病进展还没有与任何特别具体的免疫参数虽然结节病炎症通常的特点是提高生产的蛋白水解酶,细胞因子和趋化因子配体/受体,和其他分子与免疫调节功能(1,2]。这些促炎因子的表达由miRNome调制,众多小单链组成(20 - 24核苷酸长)非编码rna称为microrna(别名小分子核糖核酸)。他们结合互补的信使rna序列中目标基因的表达是随后监管通过转录后的镇压3]。microrna的监管财产通常是与他们在细胞胞质积累(3]。

在肺结节病,细胞内的表达microrna在支气管肺泡细胞已被调查,外周血单核细胞,肺组织(4- - - - - -6]。此外,一些细胞内microrna已报告在结节病进展改变了表达(4,5]。

除了他们的胞内积累,然而,microrna已知存在于细胞外液(7- - - - - -9]。小细胞外microrna的信息只存在于结节病(7]。此外,稀疏的数据应该确认关于当前推荐正常化的细胞外microrna策略(7,10]。

因此我们调查在结节病血清microrna的表达稳定,然后比较血清microrna的表达在结节病病人分类根据洛夫格伦综合征的存在的特点相比,预后良好组患者更先进的疾病过程。

2。方法

2.1。主题

血清样本来自13个健康对照组和24肺结节病的患者根据标准协议(11]。肺结节病的诊断是根据标准at /人/ WASOG国际共识声明(12]。洛夫格伦综合征表现为结节性红斑,双侧肺门淋巴结病,发烧、多发性关节炎。所有洛夫格伦综合征患者胸部x光片(CXR)阶段≤1 (),所有患者没有洛夫格伦综合征CXR阶段3 ()。临床特点及支气管肺泡细胞概要文件提供了表1和2,分别。

所有患者的呼吸医学和确认,在奥大学医院,捷克共和国。研究了医学院伦理委员会批准的PU &大学医院,奥。使用匿名的知情同意所有的血清样本研究的目的是获得所有科目。

2.2。RNA隔离和rt - pcr

确保样品质量没有红细胞microrna污染,红血球溶解在所有水平的血清样本进行分光光度法(NanoDrop 1000,美国)11]。没有血清样本A414指数高于0.2的值(13]。

细胞外的RNA是孤立的从300年L血清用miRCURY™RNA隔离包biofluids (Exiqon、丹麦)。PCR条件和反应混合都是来自用户的通讯通过应用生物系统公司(协议创建自定义RT和前置放大池使用TaqMan®MicroRNA化验)。

短暂,多路复用逆转录(RT)进行TaqMan微rna逆转录工具包(美国应用生物系统公司,CA)和RT底漆池由混合5 x RT TaqMan MicroRNA化验中提供引物(美国应用生物系统公司,CA)。preamplify所有测试MicroRNA在一起,TaqMan前置放大器主混合前置放大器使用底漆池准备从20 x TaqMan MicroRNA化验(美国应用生物系统公司,CA)。qPCRBIO探头混合No-ROX (PCR生物系统公司、英国)和20 x TaqMan MicroRNA化验(美国应用生物系统公司,CA)被用来执行单个MicroRNA的rt - PCR (Corbett RotorGene3000系统研究,悉尼,澳大利亚)。列出所有TaqMan MicroRNA化验补充材料(在线资源1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/1246129)。

2.3。数据分析和统计

二阶导数的方法,前面描述的在我们的实验室14),被用来评估Cq和rt - pcr的效率。选择特定的microrna是基于早期筛查数据发表在结节病(7,15)和我们的飞行员qPCR数据部分发表在欧洲呼吸学会2015年国会(16]。只有microrna效率在1.7 - -2.0 (microrna 27日)被用于后续的分析(17)(补充材料/在线资源1)。GeNorm和NormFinder算法被用来显示一个正常化的因素稳定性最高的(18,19]。

对于单变量统计分析,Mann-WhitneyU测试是用来检测可能相对microrna的表达差异研究团体。占较高的假阳性率可能造成3学习小组间的多重比较,修正的价值是由使用错误发现率(罗斯福)方法根据Benjamini和业务20.),期望和罗斯福等于5%价值0.03被认为是重要的。

多元分析与SIMCA P版本13.5.0(期刊Umetrics、AB,瑞典)利用主成分分析(PCA)和正交预测潜在的结构(OPLS)分析21]。分析进行、quantile-normalised mean-centered数据单元方差比例。模型性能报告为累积模型的相关系数(基于7倍交叉验证(),预测性能),旨在方差分析(CV-ANOVA)值OPLS-based组分离(22]。

2.4。路径分析

MiRSystem(版本。20150312)是用来评估可能的累积效应的microrna特异表达基因表达在结节病23]。褶皱的变化意味着改变microrna的(病人/控制)作为输入,包括京都基因和基因组的百科全书(KEGG)途径和一个期望的比例大于1.0。平衡的可靠性预测与可控数量的记录,一双同样数量的算法预测miRNA-gene交互设置三个算法,包括验证miRNA-gene对。只有生物功能/通路至少25基因和最多500个基因进行了分析。

3所示。结果

3.1。单变量分析的microrna在肺结节病

增加细胞外microrna qPCR数据的可靠性,几个正常化策略进行测试之前的统计分析比较可能的学习小组之间的区别。短暂,NormFinder和GeNorm算法始终显示几何平均数的23细胞外microrna的表达主题,最低的在所有样本中表达变化。

与健康对照组相比,我们持续观察表情的增加mir - 146 - 5 - p和miR-16-5p和减少的表达mir - 425 - 5 - p和mir - 93 - 5 - p在结节病的患者两组/没有洛夫格伦综合征(数字1(一)- - - - - -1 (d))。血清三个microrna的表达(mir - 150 - 5 - p miR-1和mir - 212 - 3 - p)在我们的病人减少不健康对照组相比洛夫格伦综合征(数字2(一个)- - - - - -2 (c))。血清miR-21-5p增加在我们的洛夫格伦综合征患者与健康对照组相比。相比之下,mir - 340 - 5 - p是减少在同一洛夫格伦综合征患者与健康对照组(数字3(一个)和3 (b))。病人没有洛夫格伦综合征降低了mir - 212 - 3 - p的表达和miR-21-5p增加mir - 340 - 5 - p的表达相比,那些洛夫格伦综合征(数字2 (c),3(一个),3 (b))。

3.2。多变量分析的microrna在肺结节病

多元分析探讨影响coexpression几个血清microrna特异表达的结节病(补充材料/在线资源2)。这两种多元分析的6和7 microrna在洛夫格伦综合征患者或特异表达没有洛夫格伦综合征的患者显示,OPLS造型提供了一种重要的分离我们的肺结节病无论疾病患者和健康对照组的72%和65%的预测能力(和和和;和基于7倍交叉验证(补充材料/在线资源2)。多元造型特异表达的三个microrna之间的单变量分析洛夫格伦综合征患者和那些没有洛夫格伦综合征表现出显著的分离与一个贫穷的再现性在我们的训练数据集导致可怜的预测力为44% (和;;补充材料/在线资源2)。

3.3。路径分析

揭示累积效应的microrna特异表达基因表达,与miRSystem数据库路径分析。“癌症”途径一直预测目标miRSystem得分最高的表达谱中特异表达/没有洛夫格伦综合征患者与健康对照组(和;辅料/在线资源3)。在这个通路,所有6 microrna (mir - 146 a - 5 - p, miR-16-5p, mir - 425 - 5 - p, mir - 425 - 5 - p, miR-21-5p,和mir - 340 - 5 - p)特异表达的洛夫格伦综合征患者实验验证的基础上预测了103年调节目标基因根据miRSystem(表3)。此外,所有7 microrna (mir - 146 a - 5 - p, miR-16-5p, mir - 425 - 5 - p, mir - 425 - 5 - p, mir - 150 - 5 - p, miR-1,和mir - 212 - 3 - p)特异表达的患者没有洛夫格伦综合征是实验验证的基础上预测了112年调节目标基因根据miRSystem(表3)。

“转化生长因子(TGF)β信号通路“KEGG通路中miRSystem得分最高的是预测显著影响(;补充材料/在线资源3)的累积效应三个血清microrna的表达之间的特异表达洛夫格伦综合征患者和那些没有洛夫格伦综合征。在这个途径,三个microrna (mir - 340 - 5 - p, mir - 212 - 3 - p,和miR-21-5p)目标25实验验证基因(表3)。

4所示。讨论

这项工作试图提供一个洞察细胞外微分表达式microrna在结节病病人分类根据洛夫格伦综合征的存在作为一个标志比较先进的疾病的预后良好。我们几何mean-normalised表达式表明,血清mir - 146 - 5 - p, miR-16-5p, mir - 425 - 5 - p,和mir - 93 - 5 - p特异表达,不管结节病预后,在我们的肺结节病的患者与健康对照组相比。具体来说,患者没有洛夫格伦综合征有特异表达的表情mir - 150 - 5 - p, miR-1, mir - 212 - 3 - p和洛夫格伦综合征miR-21-5p特异表达和mir - 340 - 5 - p与健康对照组相比。MiRSystem预测途径在癌症一直受到两个特异表达表达谱在结节病有/没有洛夫格伦综合征。三个血清microrna (miR-21-5p, mir - 340 - 5 - p,和mir - 212 - 3 - p)之间的不同结节病洛夫格伦综合征患者和那些没有洛夫格伦综合征。他们的累积效应可能调节“转化生长因子(TGF)β在结节病恶化信号通路”。

目前由于缺乏知识稳定表达的细胞外microrna在结节病的患者的血清,qPCR数据的最佳方法最早正常化了。所有细胞外microrna表达的几何平均数显示最好的稳定,因此用于正常化原始qPCR数据在随后的分析比较研究。几何mean-normalisation Jazwa等人不同,使用测量像我们的论文血清miR-16-5p表达式,mir - 146 - 5 - p和mir - 150 - 5 - p在结节病的病人7]。他们没有发现任何这些血清microrna特异表达于肺结节病。在与我们的观察,可以解释不同的正常化的方法结合不同表示CXR阶段中结节病病人的研究Jazwa et al。7]。

与健康对照组相比,失调4 microrna一直在结节病。然而,我们也观察到一些microrna与洛夫格伦综合征的存在或不存在的东西。通过这些差异,预测“癌症通路”一直被累积效应调制两肺结节病的血清表达式配置文件有/没有洛夫格伦综合征。值得注意的是,癌症的风险增加了结节病病人和结节病肉芽肿的存在已经报道在案例研究肿瘤患者(24- - - - - -26]。这种关系已经被其他作者也支持(27]。血清microrna在结节病病人的失调可能因此导致炎症、细胞凋亡和血管生成经常伴随各种恶性过程(28- - - - - -30.),它可能可能不是直接相关的存在/缺乏洛夫格伦综合征在结节病。

此外,一些“癌症通路”的特定目标基因确实已经表示在湿实验室特异表达的蛋白和/或mRNA水平在结节病31日- - - - - -36]。其中,WNT(无翼和integrase-1) 7, catenin-beta和转化生长因子- (TGF)β同时涉及到其他信号通路,包括WNT和TGF -β信号通路(23]。这两种信号通路已经曾预测调制的累积效应的几个细胞内microrna中特异表达的外周血淋巴细胞和肺组织获得从结节病病人6]。

符合细胞内miRNAs-based预测(6),“TGF -β信号通路”预测来受细胞外血清microrna (miR-21-5p, mir - 340 - 5 - p和mir - 212 - 3 - p)之间不同洛夫格伦综合征患者和那些没有洛夫格伦综合征。考虑profibrotic字符的TGF -β行动37),值得注意的是,“TGF -β信号通路”预测这里虽然只有两个患者纤维化改变(CXR阶段(四)参加本研究。除了他们之外,其他病人没有洛夫格伦综合征CXR III期在这工作。我们可能因此推测早期纤维化的过程,涉及转录后的调控开始之前CXR四期。另一方面,我们的患者CXR阶段3没有表达特异表达的miR-21高程与IPF(有关38]。

因此,比较在所有5 CXR阶段需要阐明获得一个整体了解疾病过程从胸内淋巴结向无形的异常的肺实质参与和肺纤维化在最先进的结节病1]。这甚至可以揭示关键管理球员主要是常见的疾病缓解(55 - 90%)在疾病早期(即在洛夫格伦综合征)而罕见的(10 - 20%)和缺席CXR第三和第四阶段,分别。

多元分析显示重要的分离我们的结节病患者和健康对照组。然而,三个microrna (miR-21-5p, mir - 340 - 5 - p和mir - 212 - 3 - p)没有提供好的模型分离我们的结节病病人根据存在/缺乏洛夫格伦综合征。缺乏深刻的两组之间的差异与结节病病人符合当前可怜的知识在任何足够敏感和特定疾病的血清概要文件(39]。这似乎不是为遗传背景站已报告的几个基因变异与洛夫格伦综合征(40- - - - - -42]。

应该注意的是,一些似是而非的microrna相关性为结节病发病机理没有调查,这可能代表我们的研究的一个限制。我们多路复用qPCR方法也不允许我们执行任何大规模筛选,尽管我们评估的血清microrna的数量高于先前的研究血清microrna在结节病7]。我们的选择是基于当前知识胞内microrna在肺结节病6,15]。考虑到不同的生物学性质,例如,广泛地讨论了处理在信息交流过程中,细胞内的microrna不太可能与细胞内表达特异表达(43]。因此,一个高通量筛查细胞外microrna结节病可能揭示新的血清生物标志物和疾病预后。

总之,我们报告几个血清microrna与肺结节病并进一步区别我们结节病病人根据存在分层/缺乏洛夫格伦综合征预后良好的一个特点。为了血清microrna与某些生物过程使用生物信息学工具,“癌症通路”的预测与肺结节病作为一个整体,而“鉴定及信号通路”是预测疾病相关课程。血清microrna和之间的复杂的相互作用的预测目标基因信号通路仍然是未来的重要试验研究获得详细的了解疾病的病理机制及其发展。

资金

LO1304拨款支持的工作项目,CZ.1.07/2.3.00/30.0004, 2016和2015 _030 IGA PU低频,_009。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

补充材料