文摘

疱疹样皮炎(DH)和大疱类天疱疮(BP)与嗜酸性和中性渗入皮肤疾病相关。虽然趋化因子至关重要的选择性积累和激活各种白细胞的子集在炎症过程中,很少有研究涉及炎症细胞的凝血因子和生产起泡的疾病。皮肤活检患者来自14个DH, 27与英国石油(BP), 20个对照组。组织因子(TF)的定位和表达在皮肤损伤和perilesional皮肤通过免疫组织化学方法研究和证实了免疫印迹。此外TF的血浆浓度测定分析。D二聚体、纤维蛋白原和选定的凝固参数测量的常规方法。TF的表达在表皮和真皮炎症涌入细胞中检测出从BP患者皮肤活检。检查发现TF表达perilesional皮肤的BP患者。TF的表达没有观察到从健康人群和DH患者活检。这项研究的结果显示lesional组织因子的表达增加,perilesional皮肤大疱类天疱疮患者。 The difference in chemokine pattern expression and variations in the cellular infiltration in BP and DH cause variable expression of TF.

1。介绍

疱疹样皮炎(DH)是一个皮下自身免疫性大疱的疾病(ABD)的特征是皮肤和肠道病变。皮肤损伤包括多态爆发伴随着严重的瘙痒(1]。建立了DH诊断结果的基础上直接免疫荧光试验(DIF)和循环IgA的存在抗体针对肌内膜和/或组织和表皮转谷氨酰胺酶(tTG (eTG) [2,3]。皮肤损伤在DH组织学上表现为中性的渗透导致破坏基底膜带(BMZ)蛋白质,锚定纤维,和泡形成4- - - - - -6]。

大疱的类天疱疮(BP)是一种猛烈的疾病,表现为炎性浸润的真皮,免疫球蛋白和C3存款沿基底膜带,和循环免疫球蛋白自身抗体。自身抗体结合自身抗原(BPAG1和BPAG2)局部表皮的基底膜激活一系列的免疫和酶现象导致的破坏BMZ组件和锚定纤维和水疱形成在DH [7,8]。

超微结构的研究也证实了密集的存在炎性浸润在dermoepidermal结,以及破坏细胞外基质成分的BP和DH [9- - - - - -11]。

可用的文献中,很少有报告的表达促凝血的因素,激活凝血过程的异常,他们所扮演的角色的水泡。最近,主导作用的嗜酸性粒细胞炎性浸润在大疱的疾病是假定。因此,他们可能是一个重要的促凝血的来源组织因子(TF)给这一过程的科学依据来考虑自己的贡献在皮下形成大疱的疾病病变的发病机制。

最近的研究表明致命血栓事件的风险增加BP患者用糖皮质激素治疗(12]。确认这些并发症是D二聚体浓度的增加,在病人的血清凝血酶原活性阶段的疾病(13]。因此,重要的是定义促凝血的因素的作用在类天疱疮和基底膜的破坏活动的嗜酸性粒细胞和介质的这些细胞在皮肤损伤和正常皮肤以及疾病的血清在活跃的阶段。

在生理条件下,有一个平衡凝固和纤维蛋白溶解,但在病理状态这种平衡可能会恶化。大疱的疾病炎症破坏体内平衡系统,它对凝血状态。Rico et al。14)描述的主导地位Th2细胞因子在猛烈的疾病。Interleukin-5,主要由Th2淋巴细胞产生,是一个嗜酸性粒细胞的分化和激活的关键因素(14- - - - - -16]。

凝血系统的炎症细胞是重要的因素。英国石油公司的主要炎性细胞,嗜酸性粒细胞似乎血管内组织因子的主要来源(17]。TF是外在的主要激活凝血途径17,18]。

凝血通路的激活可能会导致粘附分子的表达和随后释放炎症介质和蛋白水解酶(10,19]。最近的实验研究也表明,这些过程也可能激活促凝血的因素导致血液凝块的发展,这是最常见的导致患者的并发症的英国石油公司(20.]。

特遣部队,除了证据确凿的凝血属性,在炎症过程中扮演着重要的角色。组成型表达特遣部队存在的成纤维细胞和上皮细胞,在单核细胞和巨噬细胞诱导抗原抗体复合物和补体激活产品和蛋白质以及炎性细胞因子(21,22]。

本研究的目的是评估的活动促凝血的因素及其对炎症的影响渗透在BP和DH治疗。数据可能是一个重要的治疗指示允许减轻高死亡率类天疱疮患者接受皮质类固醇和确认治疗BP的一种新趋势。

2。材料和方法

2.1。病人

研究小组涉及41名患者,其中包括27个BP患者(15个女性和12个男性、年龄范围:58 - 84年,平均年龄:68.5岁)患者和14个DH(6妇女和8人,年龄:18 - 70岁,平均年龄:49.8岁)在活动阶段的疾病。对照组由20名健康受试者(5妇女和5人,年龄范围:50 - 80岁,平均年龄:71.6 BP患者和6妇女和4人,年龄范围:19-49年,平均年龄:42.0岁对DH病人)。DH患者直接免疫荧光测试结果显示颗粒的存在的IgA沉淀皮肤乳头状突起和间接免疫荧光试验阳性IgAEmA在所有患者(效价1:40 -:640年,平均1:80)。Anti-tissue转谷氨酰胺酶抗体测定使用一种免疫测定存在于7/10例(平均:5.1 IU /毫升(范围:0.0 - -186.3;国际单位/毫升))。

BP患者处于活跃阶段的疾病和平均分数BPDAI(大疱类天疱疮的疾病活动指数) 。根据病理结果阿克曼在所有情况下都充分发展。所有患者的直接免疫荧光试验显示免疫球蛋白/ C3线性沿着BMZ存款。盐分割测试存款观察表皮水泡的一部分。用间接免疫荧光试验循环免疫球蛋白抗体被发现在9/14的病人。ELISA试验显示,anti-NC16自身抗体存在于血清11 14个病人。

所有患者签署知情同意在进入学习和研究协议(# RNN / 93/03 /克)是当地伦理委员会批准的罗兹的医科大学。从研究中所有的病人组和健康对照组的血液收集一些样品。在所有的病人血液收集的活跃阶段没有任何疾病治疗。从皮肤损伤被皮肤活检组织病理学检查在学习小组和颈部区域的皮肤健康对照组。

2.2。免疫组织化学

石蜡包埋的部分被用于常规H + E染色和免疫组织化学与DAKO设想使用immunoperoxidase方法检测系统。以下主要使用单克隆抗体:anti-tissue因素从美国获得Diagnostica Inc .格林威治,CT,美国,根据制造商的指示。

2.3。形态测量学

组织学形态测量学是由图像分析系统的组成的PC电脑配备一个五角星形图形平板,Indeo快卡,由Indeo(台湾)和彩色电视摄像机松下(日本)耦合的卡尔蔡司显微镜(德国)。TF阳性细胞数在一系列连续7 - 10 400 x高功率的计算机图像领域,0.0047毫米2每一个。结果表示为TF阳性细胞的淋巴细胞百分比取决于他们的形态。

2.4。免疫测定

TF水平测量等离子体在所有患者和健康对照组进行皮肤活检。5毫升静脉血是来自ulnary静脉和离心分离血清后储存在−20°C免疫测定。酶联免疫测定是用来测量TF-IMUBIND组织因子酶联免疫试剂盒(美国Diagnostica Inc .)。D二聚体水平进行,使用光学测试STA紧凑(罗氏诊断);使用计时法测定纤维蛋白原水平的老人和浊度的方法;coagulogram是按照标准的程序;DD (D二聚体)、F2 (II)因素,F5 (V)因素、F7(因子VII),毒液(蛇毒因子V活化剂)被命运+ BP患者评估(Horiba ABX)。

2.5。免疫印迹

从冰冻的皮肤样品提取总蛋白里帕蛋白质提取缓冲,补充了蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。溶菌产物离心机在14000 g×20分钟和颗粒都被丢弃。BCA蛋白质测定蛋白质浓度测定的工具包(皮尔斯热科学、美国)。在SDS-NuPAGE凝胶电泳进行(加州生活技术),随后转移到硝基。膜被和孵化用鼠标单克隆anti-TF(美国Billerica默克密理博)。后来膜被TBST和孵化PBST包含山羊anti-mouse免疫球蛋白二次抗体共轭与碱性磷酸酶(美国默克密理博)。乐队是使用BCIP /电视台碱性磷酸酶底物(美国Billerica默克密理博),分析了ImageJ 1.34 s软件(Wayne Rasband国立卫生研究院,贝塞斯达),并表示为光密度(OD)。

2.6。统计方法

所有的值被表示为±SEM。使用未配对学生的团体之间的差异进行了测试 以及进行评估的常态。的Mann-Whitney 测试是在适当的地方使用。被认为具有统计显著性结果 。与学生的免疫印迹的数据进行了分析 以及和Mann-Whitney 测试。列文的测试被用来评估方差的同质性。被定义为水平的意义 。

3所示。结果

3.1。免疫组织化学:组织因子

TF表达了在炎症细胞浸润(嗜酸性粒细胞)和角化细胞和水疱液(图1)。患者BP, TF的表达也是perilesional皮肤所示(17个27人)(图2)。BP患者皮肤损伤,高表达的特遣部队已经证明主要在角化细胞基底层的27个活检(20)以及其他层的表皮(27人)中的19个州以及阿布贾,发生了,但是表达不敏感性较低。


图1
TF在表皮的表达和细胞的大量涌入。皮肤损伤。大疱的类天疱疮。400 x免疫组织化学。

图2
TF在表皮的表情。Perilesional皮肤。大疱的类天疱疮。400 x。免疫组织化学。

的形态学分析显示更高的TF表达在皮肤损伤perilesional皮肤患者BP ( )(表1)。DH患者的研究并没有显示出显著的表达TF在组织病理改变的14个样本(TF出现在3)或perilesional皮肤(图3)。TF蛋白表达也活检标本中发现健康个体(在2 14)。因此,TF表达,在健康集团,明显低于在BP和病变与表达DH病变。

表1
的形态学分析TF表达在皮肤损伤和perilesional皮肤(角化细胞和浸润)患者的基点。免疫组织化学。

图3
缺乏TF的表情。健康的皮肤。100 x。免疫组织化学。
3.2。免疫印迹

利用免疫印迹技术和特定的抗体TF的表达明显高于我们发现TF BP患者相比DH患者( ),与健康对照组相比( )如图4和5。


图4
组织因子的蛋白质免疫印迹。

图5
平均光密度值(OD)的控制和DH背景和BP的蛋白质。星号表示意义的差异( )(均值±SEM), TF:组织因子;DH: Duhring疾病;英国石油公司:大疱类天疱疮。
3.3。免疫测定
3.3.1。组织因子

平均TF BP患者血浆水平 pg / mL患者相比DH ( pg / mL)和对照组, 英国石油(BP)和pg / mL 对DH pg / mL。这些结果表明显著更高的TF BP患者的血浆浓度与DH患者和对照组( )。

3.3.2。D二聚体

在治疗之前,BP患者D二聚体水平的上限内引用值27例(20)。意思是D二聚体水平 毫克/毫升(而参考值范围是0.33 - -2.9毫克/毫升)。7例这些水平升高在1.2和2.9毫克/毫升之间。这些值更高DH的病人和对照组相比。

在DH患者平均D二聚体值 毫克/毫升,在参考价值。对照组的患者中,用作参考集团BP患者,D二聚体水平在正常范围内(对照组的意思 毫克/毫升)。对照组的患者作为参照组患者DH, D二聚体水平在正常范围内;意思是 毫克/毫升。因此,有统计上的显著差异在D二聚体水平之间的DH和BP患者( )。也有统计上的显著差异在D二聚体水平之间的BP患者和对照组( )。

3.4。Coagulogram

英国石油(BP)患者凝血参数如下:凝血酶原时间的意思 证交会(参考价值:12 - 18秒),意思是凝血酶原指数的85.9%±0.8%(参考范围:70 - 100%),印度卢比的意思 (参考区间0.9 - -1.30),意味着APTT 31年代±1.0秒(参考范围:26-36秒。)。DH凝固参数如下:患者凝血酶原时间的意思 秒,意思是凝血酶原指数78.9%±0.6%,意味着INR值 ,意味着APTT 29秒±1.0秒(参考范围:26-36 sec)和平均的值29 s±1.0秒。

在对照组用于BP患者比较,凝固参数如下:凝血酶原时间的意思 秒,意思是凝血酶原指数88.7%±0.4,意味着印度卢比 ,意味着APTT 30秒±1.0秒。对照组与DH病人用于比较,凝固参数如下:凝血酶原时间的意思 秒,意思是凝血酶原指数98.7%±0.2,意味着印度卢比 ,意味着APTT 28秒。±1.0秒。

没有区别在凝固参数之间的BP和DH群体和研究团体和健康的人。所有组的血小板水平是在参考范围内(BP患者:284.0±96.9×109/ L;DH病人:187.0±58.4×109/ L;和对照组:254.0±79×109/ L)。

3.4.1。纤维蛋白原水平

在英国石油(BP)患者中,纤维蛋白原水平 g / L相比 g / L的对照组。DH病人的意思是纤维蛋白原浓度 g / L相比 g / L的对照组。有一个统计上的显著差异( )患者组之间的DH和英国石油公司,以及英国石油公司之间的病人和对照组( )。

3.4.2。DD, F2, F5、F7和毒液BP患者由命运+系统测量

D二聚体水平明显高于BP患者组与对照组(312 ng / mL和96 ng / mL) ( )。所有凝血等因素F2、F5、F7,毒液在BP和DH患者和对照组在参考价值。以下之间的相关性被发现在BP患者:F2和DD ( , );F5和DD ( , );DD和毒液( , );F5和F2 ( , );F7和F2 ( , )。同样,他们发现:毒液和F2 ( , );毒液和F5 ( , );毒液和F7 ( , )(图6)。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
(g)
(g)
(h)
(h)
图6
F2、F5、F7、D二聚体和毒液:BP患者的相关性。

4所示。讨论

嗜酸性粒细胞在回应刺激分泌许多蛋白质包括嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)。高架ECP延长凝血时间,由于其对抗肝素和溶栓酶(23]。另一个蛋白质,凝固过程中起着重要的作用,是组织因子(TF),也由嗜酸性粒细胞。糖皮质激素不停止这些蛋白质的释放(24),但免疫抑制剂环孢霉素抑制分泌等项目从嗜酸性粒细胞。

马沙诺et al。13)在他们的研究评估了TF表达在BP患者和皮肤活检显示,免疫组织化学显示强劲TF活性BP的皮肤,和colocalization研究证实嗜酸性粒细胞的特遣部队。我们的结果显示一个统计上的显著差异价值之间的TF组患者的DH和英国石油公司和英国石油(BP)和对照组。

高浓度的凝血酶原片段 等离子体和水疱液BP患者在疾病的活跃阶段报告(13]。在缓解,凝血激活标记的浓度是正常的。凝血酶原片段的浓度 与免疫球蛋白针对BP180抗原的浓度(13]。

TF是外在的主要激活凝血途径,除了证据确凿的凝血属性在炎症过程中起着重要的作用[17]。这是一个公认的因素连接免疫系统与凝血系统。TF的表情出现在成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞,巨噬细胞是由抗原抗体复合物,补体激活产品,蛋白质,和促炎细胞因子(22]。我们的研究显示低水平TF表达DH病人和健康受试者,确认其本构生产。

Cugno et al。22)强调TNF和il - 6的作用,增加在英国石油(BP)的感应TF表达。BP的嗜酸性渗透皮肤可能激起海拔特遣部队集中在这个疾病。的形态学分析显示更高的TF表达在皮肤损伤比perilesional BP对DH和控制患者活检。在我们的研究中,我们证实,涌入激活TF在皮肤中具有非常重要的作用。

炎症和肿瘤过程的凝固和纤维蛋白溶解系统被激活,以应对当地的炎症细胞浸润和血管通透性增加18,22]。特遣部队增加了大量单核细胞炎症的网站(25,26),及其诱导单核细胞与T细胞可能取决于直接交互。几项研究已经证实炎症过程的影响在组织因子的过度生产27- - - - - -30.]。

对于类天疱疮和DH在我们之前的研究中,我们显示在皮肤损伤促炎细胞因子表达增加可能激活特遣部队的生产。然而,只有在英国石油(BP)表达式既增加:皮肤损伤和血。这可能是与嗜酸性渗透在英国石油公司和生产由这些细胞促凝血的因素(17]。

产品激活的TF,凝血酶,通过增加血管通透性的炎症细胞,导致白介素生产的释放和激活的粘附分子(22]。在早期的研究中,我们证实了增加的丰富和基质金属蛋白酶的表达,这可能是特遣部队的行动影响英国石油公司(31日]。

方面的描述结果,参与激活标记的嗜酸性粒细胞,肥大细胞激活,凝血因子在皮下层起泡一些疾病的发病机制似乎是特别有趣的(25,26]。

组织促凝血的因素的异常表达可能是负责英国石油(BP)的炎症过程和水疱形成。根据文献[32,33),多达25%的DH涌入细胞是嗜酸性粒细胞。此外,髓过氧化物酶,ECP,主要由嗜酸性粒细胞分泌碱性蛋白被发现在DH患者血清,这可能表明嗜酸性粒细胞炎症介质的DH的生产(33]。小TF表达在我们研究DH患者可能与这一事实有关的人口不多的嗜酸性粒细胞炎性浸润在这些病人。

这项研究显示,该集团的BP患者显示正常的意思是D二聚体的浓度,然而个人结果在参考范围的上限,和一些患者D二聚体水平升高。然而,在命运+的评价系统中,D二聚体的浓度明显高于BP患者组与对照组。应该注意的是,这些值测定用糖皮质激素治疗之前,加剧凝血过程。患者D二聚体DH的值是正常的,类似于健康受试者的水平。

英国石油(BP)患者的治疗,尤其是老年人,与当地类固醇或抗组胺药和免疫调制剂一直被假设34,35]。因此,似乎重要指示需要改变当前治疗的患者BP用皮质类固醇的标准治疗药物,不增加血栓性并发症的风险。在计划治疗预防并发症是很重要的。

类天疱疮的治疗中,我们使用许多药物作用通过不同的机制。由于自身免疫现象的关键作用,最常用的药物是糖皮质激素(gc),一个类的药物有特别强烈的影响稳态系统[36]。GCS thrombogenicity相关的影响可能与他们的直接影响凝血系统和代谢障碍与疾病的性质(37]。我们的研究也显示中纤维蛋白原水平升高的患者相比,BP与DH和对照组病人。一些临床研究表明,纤维蛋白原水平高于3.5 g / L值被视为导致血栓的风险增加,从而增加缺血性心脏病或中风的风险(38,39]。类天疱疮患者死亡的主要原因是类固醇治疗的并发症,这被认为是最有效的在这种疾病40- - - - - -42]。Rzany et al。43)强调栓塞并发症严重细菌感染是最常见的副作用的皮质类固醇整体年龄高于70年。其他作者也确认好结果当地疗法治疗大疱类天疱疮和减少不良事件的发生率与患者口服类固醇(44]。

到目前为止,没有数据的表达促凝血的因素和异常激活凝血过程的水泡的形成。然而,主导作用的嗜酸性粒细胞炎性浸润在英国石油公司最近透露,他们分泌组织因子提供了科学依据,考虑这一过程的贡献在皮下形成大疱的疾病病变的发病机制。演示D二聚体和升高患者的凝血酶原的活跃阶段疾病表明需要评估病人是否适合血栓栓塞并发症。增加死亡的风险由于中风患者BP用糖皮质激素治疗可能证实了这些发现。尽管存在这些风险,但是最新的共识的治疗天疱疮和大疱类天疱疮仍然建议使用糖皮质激素治疗的英国石油公司(45]。

我们的结果可能是有用的在临床实践和客观确定的疾病活动程度以及一个重要治疗显示可以减少高死亡率类天疱疮患者接受皮质类固醇和确认趋势与抗组胺药和非甾体类免疫调制剂治疗这种疾病。

利益冲突

作者没有利益冲突声明。

确认

这项研究是由罗兹没有医科大学的研究项目。503/1 - 152 - 01/503 - 01和波兰科学委员会批准号4746 / B / PO1/2009/37。