文摘

客观的。本研究是探讨L-THP的镇痛作用和骨癌疼痛引起的大鼠肿瘤细胞植入(TCI)。方法。热痛觉过敏和机械触诱发痛在不同时间点测量之前和之后的操作。L-THP(20、40和60毫克/公斤)是管理intragastrically术后的早期阶段(疼痛出现之前)和后阶段的术后疼痛后(外观),分别。肿瘤坏死因子-的浓度α,il - 1β,在脊髓的地震被酶联免疫吸附试验测定。免疫印迹被用来测试星形胶质细胞和小胶质细胞的激活在脊髓TCI治疗。结果。TCI治疗诱发显著的热痛觉过敏和机械触诱发痛。L-THP管理在高剂量显著预防和/或逆转骨癌症相关疼痛的行为。此外,TCI-induced活化的小胶质细胞和肿瘤坏死因子水平的增加α和地震被L-THP管理。但是,L-THP未能影响TCI-induced星形胶质细胞激活和il - 1β增加。结论。这项研究表明可能的临床效用L-THP治疗骨癌疼痛。L-THP在骨癌疼痛的镇痛效应可能潜在的抑制小胶质细胞激活和促炎细胞因子增加。

1。介绍

治疗骨癌疼痛仍然是主要的临床挑战。超过60%的原发性或转移性骨癌患者患有中度或重度疼痛(1]。迫切需要新的治疗策略骨癌疼痛。研究已经证明,骨癌疼痛的机制是独特的特点,包括炎症和神经性疼痛(2,3]。炎症在肿瘤部位和产品已经提出从肿瘤细胞和免疫细胞释放的主要触发骨癌疼痛。在我们之前的研究中,我们发现明显脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞的激活在骨癌痛大鼠(4,5]。星形胶质细胞和小胶质细胞,作为先天免疫系统的一部分,可以发布各种物质,包括肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子-α),il - 1β,地震可能引起痛觉过敏和异常性疼痛6- - - - - -8]。

Levo-tetrahydropalmatine (L-THP) tetrahydroprotoberberine异喹啉生物碱,是一种主要活性组分的属己和紫堇属之植物。研究表明,L-THP具有良好的镇痛效果和临床使用在中国40多年作为一个与镇静/镇痛催眠属性(9- - - - - -11]。尽管L-THP最众所周知的传统的止痛剂,L-THP antinociceptive行动的机制仍不清楚。这种传统镇痛是否会减弱癌症疼痛仍然是未知的。在我们的现在,我们评估了L-THP对骨癌疼痛的影响及其可能的机制。

2。材料和方法

2.1。动物麻醉、药物和管理

按照规定使用的所有动物伦理委员会的国际研究协会的疼痛和机构批准的协议都是动物保健和使用委员会。成人,女,Sprague-Dawley老鼠(160 - 180 g)被用于这项研究。老鼠保持控制的照明环境,免费的食物和水。

所有行手术麻醉与戊巴比妥钠(50毫克/公斤,腹腔内)。L-THP(光学纯度≥99.5%)来自南宁制药(广西、中国)。L-THP(20、40、60毫克/公斤,溶解在盐水和0.5% DMSO, 2毫升/鼠)intragastrically管理。L-THP的剂量选择的基础上,以前的研究(12]。执行行为和神经化学测试2 h后L-THP或车辆管理。

2.2。骨癌疼痛模型

根据先前的研究,肿瘤细胞从苦行中提取液的大鼠接受沃克256大鼠乳腺细胞癌。肿瘤细胞植入(TCI)被注入模仿细胞(细胞/μL, 5μL)到右胫骨髓内空间诱导骨癌的老鼠(13,14]。

2.3。行为测试

脚的热痛觉过敏是由显著缩短延迟撤军对热刺激的反应。总之,热源集中在一部分后爪子,和辐射热刺激传递到网站。刺激后爪移动时自动关闭(或20年代后防止组织损伤)。热刺激了3次后爪子在5 - 8分钟的间隔。

机械触诱发痛发病率评估通过测量脚撤军足底表面的机械压痕后爪锋利,圆柱探针与一个统一的提示提供的大约0.2毫米直径电子·冯·弗雷。探针应用于六个指定位点分布在脚的足底表面。的最小值(克)诱导爪子撤军是读出显示。阈值的机械撤出在每个动物被平均六阅读和计算力转化成millinewtons (mN)。

2.4。免疫印迹

- 5脊髓很快就从深麻醉大鼠和存储在−80°C。连续降水过程被用于细胞溶解的组织样本在冰冷的Np-40或里帕裂解缓冲含有蛋白酶抑制剂的鸡尾酒,磷酸酶抑制剂,phenylmethylsulfonyl氟化物(Sigma-Aldrich)。匀浆孵化20 - 30分钟在冰冷的水中,涡10秒钟的最高设置每5分钟,然后在13000 g离心10分钟。收集上清液和蛋白质浓度使用bicinchoninic酸测定上层的估计。

总蛋白质是由十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和转移到0.2 -μm硝基或聚偏二氟乙烯膜(来自Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)。以下主要使用抗体:anti-GFAP (1: 500), anti-Iba-1(1: 1000)(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国),s - 100β(1:800)(Abcam,剑桥,英国),和anti-GAPDH(1: 10000)(美国Sigma-Aldrich)。洗后与Tris-buffered盐水渐变20 (TBST) 3×5分钟,细胞膜与辣根孵化peroxidase-conjugated二级抗体(1:5000)(研发系统、明尼阿波利斯、MN)在室温下2小时,然后用TBST 3×5分钟。开发的膜被增强化学发光试剂(美国PerkinElmer沃尔瑟姆,MA)。数据分析与分子成像仪(ChemiDoc XRS Bio-Rad实验室)和相关的软件数量One-4.6.5 (Bio-Rad实验室)。

2.5。水平的肿瘤坏死因子-α,il - 1β,地震的决心

整个脊髓在- 5段迅速从深深的麻醉大鼠(每组)。组织均质在冰冷的100毫米PBS。由bicinchoninic酸测定蛋白质浓度测定。肿瘤坏死因子的水平α,il - 1β,地震测量使用酶联immunospecific试验(ELISA) (TNF -α工具:RTA00和il - 1β工具:RTB00)(研发系统)(地震工具包:KRC2341;热费希尔科学)根据制造商的指示14,15]。

2.6。统计分析

SPSS版本15 (SPSS Inc .,芝加哥,IL)是用来进行统计分析。延迟的差异的重要性热撤军和机械撤军的阈值随着时间进行了双向重复测量方差分析(RM方差分析)其次是Bonferroni事后测试。细胞因子的浓度变化和表达的蛋白质发现组间进行了测试与单向方差分析重复测量Bonferroni紧随其后的事后测试。所有数据都意味着±SEM。统计结果被认为是重要的如果。

3所示。结果

3.1。剂量依赖性抑制作用的L-THP TCI-Induced痛觉过敏和异常性疼痛

与先前的研究一致(13,14),老鼠接受TCI热痛觉过敏和机械方面表现出显著的异常性疼痛开始在术后第七天(图1)。高剂量的L-THP显著降低的生产和持久性这些疼痛行为TCI老鼠进行测试。重复管理L-THP 40和60毫克/公斤在术后3天,4和5,分别产生显著延迟TCI-induced感应的痛觉过敏和异常性疼痛(数字1(一)和1 (b))。在术后疼痛的感应行为开始天9 - 11之后L-THP管理。相同剂量的L-THP管理在术后7天,8日和9日产生了显著的,瞬态衰减的热痛觉过敏和机械触诱发痛(数字1 (c)和1 (d))。预处理水平相比,痛觉过敏和异常性疼痛减少了30% -60%,L-THP持续2 - 4天的镇痛效果,这取决于剂量。然而,L-THP 20毫克/公斤或车辆并不影响触诱发痛和痛觉过敏引起的TCI ()。同样,L-THP(60毫克/公斤)管理术后天11日,12日和13日也产生显著和瞬态(3 ~ 4天)降级的痛觉过敏和异常性疼痛(数字1 (e)和1 (f))。单一管理L-THP(60毫克/公斤)在术后一天11也可以诱发显著的镇痛效果(数字1 (g)和1 (h))。这样的镇痛效应从1 h和达到2 h后出现L-THP政府和单一的镇痛效果L-THP(60毫克/公斤)政府持续6 ~ 8小时(数字1 (g)和1 (h))。

3.2。长期抑制的影响L-THP TCI-Induced疼痛行为

我们进一步研究了长期影响的重复应用L-THP TCI-induced痛觉过敏和异常性疼痛。,因为在之前的研究中,我们发现L-THP 60毫克/公斤显示最明显的镇痛作用,这里我们只测试的角色在60毫克/公斤L-THP TCI-induced痛苦的行为。如图2,L-THP 60毫克/公斤intragastrically管理为7天,从术后7 - 19天,每隔一天一次,显著降低痛觉过敏的严重程度(图2(一个))和异常性疼痛(图2 (b)由50% ~ 80%)。镇痛效果持续了一个额外的8 ~ 10天后终止L-THP应用程序(数据2(一个)和2 (b))。

3.3。L-THP政府镇压TCI-Induced TNF水平上升α的地震,但不是il - 1β

当我们发现之前8,14),TCI治疗显著增加肿瘤坏死因子的水平α,il - 1β,在脊髓,地震期间表现出随着时间的进步增加从5 TCI后21天治疗(图3(一个))。肿瘤坏死因子的增加α和地震被显著地抑制L-THP管理。重复管理L-THP(60毫克/公斤)在早期阶段(术后天3、4和5)和晚期阶段(术后天7,8,9)显著抑制TNF - TCI-induced增加α和地震大约60% -70%(数据3 (b)和3 (c))。然而,L-THP政府没有影响TCI-induced il - 1β增加(图3 (d))。il - 1的水平β浓度在不同时间点L-THP组相比没有差异表达与汽车集团()。

3.4。L-THP政府抑制TCI-Induced活化的小胶质细胞,但不是星形胶质细胞

鉴于促炎细胞因子水平的增加是由于脊髓胶质细胞激活,我们检查了L-THP在胶质细胞激活的作用。在骨癌痛,在脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞显著激活(数字4(一)和4 (b))。GFAP的表达(特定蛋白质的星形胶质细胞)和Iba-1(小胶质细胞的特定的蛋白质)TCI治疗后显著增加(数据4(一)和4 (b))。星形胶质细胞激活开始在术后第七天,直到天21日(最后一个测试一天),和小胶质细胞的激活从术后第五天,在天的程度达到顶峰。GFAP的表达在术后6天TCI治疗后没有显示出明显的变化而虚假的集团(数据4 (c)和4 (e))。L-THP(60毫克/公斤)政府在早期阶段和晚期阶段显著抑制TCI-induced活化的小胶质细胞(数字4 (c)- - - - - -4 (f))。然而,有趣的是,L-THP政府没有影响星形胶质细胞的激活引起的TCI(数字4 (d)和4 (f))。确认这一现象,我们使用另一个特殊的标记星形胶质细胞,s - 100β,其突出表现是星形胶质细胞激活的特点(16,17]。GFAP一样,s - 100的表达β在脊髓TCI治疗后显著增加(图4(一))。管理L-THP(60毫克/公斤)在早期或晚期阶段没有对s - 100的表达的影响β(数据4 (c)- - - - - -4 (f)),这表明L-THP TCI-induced没有影响脊髓星形胶质细胞的激活。

4所示。讨论

本研究调查了在老鼠L-THP骨癌疼痛的止痛效果。我们的结果表明,系统的应用高剂量的L-THP瞬变和剂量依赖性延迟和逆转TCI-induced热痛觉过敏和机械触诱发痛。L-THP的镇痛效应是由抑制小胶质细胞的激活,以及肿瘤坏死因子-α和地震增加。据我们所知,这个研究表明,第一次L-THP可以显著减轻TCI-induced痛觉过敏和触诱发痛和提供新的实验证据支持的效用L-THP治疗慢性疼痛和扩大使用L-THP在临床治疗。

L-THP的镇痛和antinociceptive效应已经被临床和实验证据证明(10,18- - - - - -22]。L-THP已经找到缓解头痛、胸痛、忧郁症的痛苦,人类(和腹痛18,19在实验动物中,炎症和神经性疼痛12,20.- - - - - -22]。然而,L-THP镇痛效应背后的机制仍然知之甚少。已经表明,L-THP的镇痛作用是通过阻断多巴胺D2受体介导的纹状体和下丘脑弓状核,导致激活下行antinociceptive系统中脑导水管周围灰质的脊髓背角和抑制疼痛的信号转导(10,23,24]。然而,有更少的证据L-THP在脊髓的作用,伤害感受的主要中央系统。

正如我们上面提到的,骨癌疼痛是复杂,可能涉及炎症和神经性疼痛(2,3]。考虑几项研究已经表明,L-THP可以减轻炎症和神经性疼痛,我们假设L-THP可能用于治疗骨癌疼痛。在目前的研究中,行为测试中,我们发现,口服L-THP显著抑制和逆转TCI-induced导致的行为方式存在剂量依赖的相关性。这L-THP的止痛效果,抑制促炎细胞因子TNF -α在脊髓和地震释放。细胞因子已经被证明是重要的因素导致中央和周边敏感25)在慢性疼痛和神经损伤后,调节。L-THP可以抑制促炎介质(26]。据报道,L-THP可以抑制肿瘤坏死因子-α全身monocyte-endothelial细胞粘附和nf -κB核易位(27]。心肌ischaemia-reperfusion受伤期间,L-THP政府明显减少炎症因素的积累,包括TNF -α和MPO28]。这些报告表明L-THP可能参与调节促炎细胞因子。然而,除了考虑,目前的研究中,对il - 1 L-THP政府没有影响β表达式。il - 1的浓度β在脊髓后重复管理L-THP仍维持在高水平。在我们能接受的研究中,我们发现了相同的现象8]。Wnt /β连环蛋白信号导致神经性疼痛通过调节TNF -α的地震,但不是il - 1β。所以有L-THP和Wnt信号之间的关系吗?L-THP调节促炎细胞因子的作用机理是什么?还需要进一步的研究。

鉴于脊髓来自大多数促炎细胞因子激活的胶质细胞,我们进一步研究了l-THP在脊髓神经胶质细胞活化的作用。我们的结果表明,L-THP管理显著抑制TCI-induced小胶质细胞激活。然而,L-THP TCI-induced显示没有影响星形胶质细胞激活。确认L-THP对星形胶质细胞的影响,我们选择了另一种蛋白质标记,s - 100β,代表了星形胶质细胞激活。与GFAP一致,s - 100的表达β在脊髓TCI治疗后显著增加。然而,L-THP政府还显示没有影响upregulation s - 100β。这个有趣的发现表明,激活星形胶质细胞和小胶质细胞的机制是不同的(29日- - - - - -31日]。这种现象可能部分解释了为什么L-THP管理局没有对il - 1的影响β释放。据报道,il - 1的产生和释放β主要发生在星形胶质细胞(32,33]。根据目前的研究,L-THP没有对星形胶质细胞活化的影响,所以它没有显示出对il - 1的影响β表达和释放。

在骨癌痛模型中,有一个大的变化脊髓小胶质反应。目前的研究中,我们发现小胶质激活开始在早期阶段后从第五天(TCI)和保持在一个较高的水平直到手术后21天。这些发现与之前的研究相一致(13,14,34]。然而,最近,杨et al。35]报道不一致的发现,骨癌引起延迟激活的小胶质细胞。他们发现小胶质标记Iba-1才移植术后第14天,和小胶质细胞没有影响骨癌疼痛的感应。相反,王et al。36]发现,鞘内政府的二甲胺四环素(小胶质细胞抑制剂)在早期阶段(从每天4 - 6)可以显著预防癌症骨疼痛,在后期阶段(从10天12)它没有效果。这些变化可能是由于在动物菌株的差异,性别和肿瘤细胞的起源。目前的研究中,我们选择Sprague-Dawley老鼠虽然杨等人Wistar鼠在他们的研究中使用。可能会有另一个可能的原因来解释的差异。在我们的研究明显骨破坏出现在术后几天5到7,在杨等人的研究(35),明显的骨破坏才出现术后第14天。肿瘤细胞的增长,联系,受伤,然后摧毁了远端感觉纤维的过程刺激骨髓和矿化骨。小胶质细胞是众所周知的中枢神经系统损伤后的早期反应细胞。所以肿瘤cell-induced骨破坏导致小胶质细胞激活在早期阶段。

总之,L-THP在高剂量可以有效降低TCI-induced热痛觉过敏和机械触诱发痛。机制L-THP-induced衰减骨癌疼痛可能部分通过抑制小胶质细胞的激活,以及促炎细胞因子TNF -α地震释放,在脊髓。然而,目前的研究中,我们不能排除其他的可能机制L-THP治疗骨癌疼痛,如镇静的效果。目前的研究提供了实验证据,表明L-THP骨癌疼痛的镇痛作用,并建议的临床效用L-THP治疗骨癌疼痛。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Mao-yin张和岳鹏刘本研究同样起到了推波助澜的作用。

承认

这部分工作是支持由中国国家自然科学基金(国家自然科学基金委- 81271242和国家自然科学基金委- 81371242)。