文摘
一个潜在的内皮功能障碍在心血管疾病的发病机制中起着基础性作用,是动脉粥样硬化的重要特征。蛋白质之间的通信的白细胞和内皮细胞发炎导致血球渗出主要是调查和几个关键球员如白介素、肿瘤坏死因子α,或损害相关的分子模式分子(潮湿)calprotectin现在确定。然而,有关细胞因子IL27,备受争议的当前知识对其炎症作用和相关监管元素需要澄清。因此,我们检查了炎症IL27对主要的影响内皮细胞的潜在的调节效应证明钙卫蛋白在转录组蛋白质组水平。并且qPCR-based筛选高IL27-mediated基因表达的IL7,IL15,CXCL10,CXCL11。IL27-induced Calprotectin时间downregulatory效果观察IL15和CXCL10基因的表达。大量spectrometry-based方法IL27±calprotectin细胞刺激开明calprotectin在28个蛋白质表达的调节作用,主要参与白细胞轮回的机制。此外,我们发现的证据STAT1参与这个过程。我们的发现提供了新的证据关于IL27-dependent促炎信号的控制下可以calprotectin并强调需要进一步调查分子可能antiatherosclerotic功能。
1。介绍
动脉粥样硬化的特点是动脉的狭窄引起的斑块形成和心血管疾病(是一个杰出的代表1,2]。有趣的是,前动脉粥样硬化发生发展经常中风或心脏病等心血管事件。在健康的条件下,血管系统包含一个组成的单层内皮细胞和形成一个循环血液和血管壁之间的障碍(3]。自分泌、旁分泌和血管内皮细胞的内分泌机制可以起到调节作用的能力,调节细胞的激活和增殖影响周围组织的生长和新陈代谢(4]。此外,它有一个重要的角色是一个看门人通过调节白细胞血液和底层组织之间的交易(5]。内皮功能的改变可能是由于几个风险因素包括吸烟、高胆固醇血症、高血糖,遗传因素,高血压、老化,或炎症1,2,6- - - - - -8]。在一个正常的静止内皮诱发几乎没有表达促炎的分子(6],endo -和外源性危险信号的识别内皮细胞(ECs)可导致炎症反应通过粘附分子的表达,分泌的炎症蛋白,ECs的形态变化9,10]。
早期血管炎症过程的关键事件的招聘和粘附白细胞transendothelial迁移到炎症网站之前,一个机制,包括细胞因子、激素、病原体相关分子模式分子(pamp),和损害相关的分子模式分子(抑制)11,12]。细胞因子的作用和抑制,特别是他们的基金会的活动和参与的加速度血管疾病,已经记录(13- - - - - -18]。关于IL6-family成员IL27细胞因子,由子单元p28 Epstein-Barr-virus-induced基因3 (EBI3),参与免疫反应和疾病是越来越多的接受19]。矛盾的观察关于其赞成或抗炎作用然而报道(20.,21]。它已被证明在活的有机体内IL27减少炎症抑制过度Th1在感染免疫反应,和在体外在一些T细胞亚型已经表明IL27感应的生产抗炎IL10 [22,23]。最近,IL27作为上游激活剂的抗炎作用的STAT3通路也建立了24]。在动脉粥样硬化的背景下,Hirase和同事证明小鼠IL27受体缺陷发展动脉粥样硬化病变(25]。
另一方面,其他数据,而争取IL27促炎的活动,所述Guzzo和合作者在初级单核细胞(26]或由南和同事证明IL27从预处理和正常分泌脂肪细胞在炎症条件下(27]。此外,在动脉粥样硬化发展,IL27在HUVECs诱导趋化因子的upregulation CXCL9 CXCL10,涉及transendothelial细胞迁移(19,28]。在人类研究中,检测到了更高的血清水平的IL27患有冠状动脉疾病(CAD)如心肌梗死和稳定和不稳定心绞痛29日]。通路分析主要从不同的冠状动脉粥样硬化病变组织证明的upregulation IL27开发早期病变的动脉粥样硬化材料,强调一个重要的角色的IL27在动脉粥样硬化的发展30.]。所有这些矛盾的数据的确切作用IL27炎症建议cytokine-specific的存在监管过程发生在细胞细胞通讯。
Calprotectin, S100A8 / S100A9异质二聚体S100蛋白家族的成员,也参与了急性和慢性炎症31日,32]。大多数出版物提出calprotectin促炎作用,和动脉粥样硬化的发展和发展在体外和在活的有机体内研究表明proatherogenic角色calprotectin [33- - - - - -36]。相反,据报道,管理calprotectin鼠动物模型诱导免疫抑制功能(37,38),这表明,类似于IL27, calprotectin可能相反的监管职能。
在这项研究中,我们开明的参与IL27 calprotectin在监管方面的内皮炎症状态的赞成和antiatherogenic功能。此外,目的是识别潜在的协同,添加剂,从其他介质或拮抗效果,我们分析的角色证明钙卫蛋白在转录组IL27-mediated蛋白质组并且监管。
2。材料和方法
2.1。HUVEC隔离、净化和激活
产妇知情同意后(拉西的国家D 'Ethique de矫揉造作的卢森堡2013/01v1.0),主要人类脐静脉内皮细胞隔离1毫克/毫升(通过传代形成细胞的胶原酶NB4(美国赛瓦)从新鲜脐带静脉从计划剖腹产(协议改编自39])。HUVEC细胞培养生长在0.2% gelatine-coated组织烧瓶和完整的M199(σ)补充EGM2 SingleQuots (LONZA, Verviers,比利时)和2毫米谷酰胺(σ)37°C潮湿大气中5%的股份有限公司2。纯洁的HUVEC细胞培养进行流式细胞术;以下使用抗体:鼠标反CD31-PE,鼠标反CD144-A647和鼠标反CD146-PerCP-Cy5.5抗体(所有从BD科学、Erembodegem、比利时)。通过数字2 - 4被用于HUVECs的激活。刺激实验和HUVECs准备细胞密度为2.5×105细胞/毫升6-well板块(格林尼,Vilvoorde,比利时)1毫升/完整的M199媒体24 h,和随后的消耗阶段12 h EGM2 SingleQuots-depleted M199媒体补充2%的边后卫(LONZA)、庆大霉素(LONZA),和2毫米谷酰胺(σ,MA)。浓度来确定最佳的刺激,HUVECs孵化12 h射程为10,30岁,100 ng / mL IL27(研发系统,阿宾顿,英国)和1、5、10μg / mL calprotectin (Hycult、Uden、荷兰)(3生物复制)。在聚集有关化验,转录组分析,HUVECs刺激与IL27 (30 ng / mL)±calprotectin (1μg / mL) 3、6、12、24 h(6生物复制),细胞内的蛋白质组分析课程6、12,24小时进行生物复制(9)。此外,HUVECs与肿瘤坏死因子刺激α(2 ng / mL) (Peprotech NJ)±calprotectin (1μg / mL) 3、6、12、24小时(3生物复制)。刺激停止了洗附着HUVECs 1毫升的冰冷的无菌PBS和6-well板直接冻结在−80°C。细胞生存能力评估LDH释放使用cytox96 nonradioactivity细胞毒性试验(Promega、莱顿、荷兰)。
2.2。RNA提取和RT-qPCR
RNA提取从HUVECs根据指令执行ReliaPrep RNA细胞Miniprep系统和解决方案(Promega)。250年μ裂解缓冲的L是添加到每个细胞被挠了。后来,纯化RNA与30筛选了μL nuclease-free水。RNA产量和纯度测定分光光度计NANOdrop 2000(热科学、CA)。反转录,0.2μg随机引物(Promega)添加到1μg RNA和孵化5分钟在70°C,紧随其后的是后续添加5 x反应缓冲区,20 U(最终)RNAsin核糖核酸酶抑制剂(Promega), 0.5毫米(最终)核苷酸(Promega),和160 U(最终)GoScript逆转录酶(Promega)孵化项目的5分钟25°C, 60分钟42°C, 10分钟在70°C。
最佳刺激浓度测定,96 -基因阵列TaqMan人类免疫面板(猫。使用了4370573)。互补脱氧核糖核酸(437.5 ng)是混合着TaqMan普遍掌握混合二世(应用生物系统公司,CA)和添加。qPCR参数设置如下:2分钟50°C, 10分钟在95°C,和40重复15在95°C和60年代60°C (QuantStudio 12 k Flex v1.1,应用生物系统公司)。数据分析是由表达式v1.1软件套装。时间分析,以下TaqMan底漆使用:IL7 Hs00174202_m1, IL15 Hs00174106_m1, CXCL10 Hs00171042_m1, CXCL11 Hs00171138_m1,和香港ACTB Hs99999903_m1, GAPDH Hs99999905,和GUSB Hs99999908_m1。总共25 ng cDNA混合了TaqMan普遍掌握混合二世(应用生物系统公司)和添加每好MicroAmpFast 96孔板(应用生物系统公司)。qPCR参数设置如下:10分钟在93°C和40重复15在95°C和60年代60°C (QuantStudio 12 k Flex v1.1,应用生物系统公司)。
定量分析是由斯和合作者的方法(40]。内部执行规范化ACTB、GAPDH和GUSB看家基因(香港)。
2.3。蛋白质组学
2.3.1。样品制备
细胞裂解,50μL 8 M尿素是直接添加到每个细胞刮,转移,随后用1 h在4°C。200年之后μL 0.8% RapiGest NH(水)在50毫米4HCO3添加了2毫米德勤和孵化1 h在室温下(RT),其次是增加10毫米mmt(皮尔斯,Erembodegem,比利时)和孵化的1 h RT在黑暗中。消化的蛋白质肽是通过增加1μg胰蛋白酶黄金(Promega) 24 h RT和停止添加1%组织为1 h RT,后来样本咸了通过使用3 M Empore墨盒(3 M分析,MS)。与200年样本装上子弹,筛选了μL 70%的乙腈(ACN)在0.1%的组织,并进一步在真空干燥离心机(Speedvac,热科学)。干样本resuspended 20μL 0.1%的组织。样本加载压缩技巧C18 (ZTC18S960,微孔,Molsheim,法国)和筛选了20μL 70% ACN内0.1%的组织和干真空离心(Speedvac,热科学)。在测量之前,样本resuspended 10μL 2% ACN内0.1%的组织。
2.3.2。质/女士
肽的分析是由质/女士在一个EASY-nLC超高效液相色谱法(热科学)耦合的混合双压/ orbitrap线性离子阱质谱仪(LTQ orbitrap Velos Pro,热科学)。75年解散肽样本分离μ(内径),25厘米,PepMap c18柱(Dionex-Thermo科学)。解决梯度从2%到40%不等ACN在0.1%甲酸以恒定流量300 nL /分钟200分钟使preseparation肽。洗脱肽在nanospray电离接口。关于MS / MS设置,collision-induced离解(CID)申请的15个最丰富的离子在全女士扫描检测。基本设置如下女士:完整的女士(英尺分;60000号决议;范围400 - 2000)和MS / MS(线性陷阱;最小信号阈值500;隔离宽2 Da;动态排斥时间设定30年代;单电荷离子被排除在选择;规范化的碰撞能量将35%和激活时间10毫秒)。
2.3.3。Label-Free量化
初期发育气为蛋白质组学(水域,非线性动力学,MA)是用于label-free量化质派生数据。首先,排列的二维离子强度图代表的保留时间和质量收取比肽进行,其次是量化信号的最后肽和蛋白质数据库搜索鉴定。为了依靠蛋白质自信地认为,至少有两个独特的截止多肽/蛋白质应用。
2.3.4。数据归一化
蛋白质组学的初期发育七量化蛋白质仍倾向于丰度高。因此,丰度进一步加工利用(v3.2.1 [41数据规范化使用)bioconductor包方差稳定和规范化(VSN [v3.36.0], [42])和函数vsn2。
为了评估生物复制之间的变化,计算每个复制的峰值和执行;也就是说,每个蛋白质丰度比值的总和考虑复制的蛋白质丰度计算。每个时间点之后,峰值和中位数/复制和复制的峰值和平均计算。应用截止1.25标准差(sd)允许一个消除离群值复制。在细节,2 6小时时间点复制,6为12 h时间点复制,和7复制24小时时间点被移除。此外,两个生物复制控制复制1和2h,尽管实现sd的截止1.25显示转移分布和随后被删除(数字S1-S3在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2015/737310)。
2.3.5。差异蛋白质表达计算
保留复制实施微阵列数据的线性模型(limma)bioconductor包(v3.24.10),确定微分表达式(43]。这个包裹已经成功地应用于蛋白质组学(42,44,45]。limma使用一个经验贝叶斯以及考虑全球的噪声方差,以避免局部方差为小样本。
多个测试是由计算校正错误发现率(称为值)使用limma提供的值和计算使用bioconductor包价值[v2.0.0] [46]。最后,对数基地2 FC (LogFC)值被转换回原来log2FC sinh使用函数。情节进行使用ggplot2 包[v1.0.1] [47]。阈值的意义值是由策划值在十字路口的价值观和识别(图S4) [45]。统计上显著值表示了,,。值得注意的是,所有统计分析进行一个mac OSX架构(x86_64-apple-darwin14.3.0(64位)。
2.4。免疫印迹
HUVEC样本挠了Triton-x裂解缓冲。tris-glycine 10%聚丙烯酰胺凝胶制备和大约20μg蛋白被加载(混合5 x Laemmli缓冲区)。3μL PageRuler + Prestained蛋白质梯(热科学)至少转移到了一个,和感兴趣的样品免费转移到井的凝胶。此外,0.2μ使用m PVDF膜。抗体来自BD生物科学:pSTAT1 pY701 (612233), STAT1(610116),和STAT3 (610190);细胞信号:pSTAT3 pY705(9145年代);皮尔斯热:微管蛋白(pa1 - 38814)。二次抗体抗体是IRdye800CW(奥德赛,926 - 32214)和anti-mouse Alexa萤石680(表达载体,A10038)。膜被荧光标记检测目标蛋白,LI-COR奥德赛红外成像系统的光感应器(LI-COR, NE)。对于微密度分析,pSTAT1 ()和pSTAT3 (微管蛋白)规范化。
2.5。路径分析
数据分析通过使用试剂盒的聪明才智通路分析(出来试剂盒雷德伍德城;http://www.ingenuity.com/)。规范化的转录组数据每个刺激的不同浓度和蛋白质组数据的6日12日分别和24小时被合并。核心分析使用以下设置:值< 0.05(转录组数据)或值< 0.15(蛋白质组数据);参考集是聪明才智知识库(基因+内源性化学物质),只有实验观察,直接和间接关系,Fisher精确以及选择;所有物种的知识基础,所有细胞类型都包括在内。关于转录组数据,比较分析IL27——和calprotectin-regulated基因和前20名的生物功能是执行选择基于得分分数。后来,层次聚类进行基于欧氏距离的前20名的生物功能使用函数的热图。2的包gplots。
2.6。统计分析
统计分析使用软件GraphPad棱镜5(美国GraphPad软件,拉霍亚,CA)。超过5生物复制和不平等的差异,一个未配对以及与韦尔奇的校正,少于5生物复制,一个未配对以及应用。统计上显著值表示了,,。
3所示。结果
3.1。IL27和Calprotectin-Dependent调节内皮细胞的基因表达
检查IL27和calprotectin对内皮细胞基因表达的影响,还有一个多元化的基因阵列分析的96个基因,包括细胞因子、生长因子和其他免疫反应基因。为了优化刺激浓度IL27 calprotectin, 3不同浓度IL27(10、30和100 ng / mL)和证明钙卫蛋白(1、5、10。并且μ使用g / mL),根据公布的数据(19,33,48]。显著差异表达基因的关系与IL27刺激后如图1(一)。19独特显著表达基因被发现其中15个是调节和4个表达下调。有趣的是,最高的upregulations观察IL7,IL15,CXCL10,CXCL11(表S1)。关于calprotectin细胞刺激,15独特显著表达基因被发现,其中11个基因调节和4基因表达下调,与基因PTGS21到10后被调节μg / mL证明钙卫蛋白治疗后表达下调并且5μg / mL calprotectin刺激。基因差异表达最高的观察IL7和CCL5(表S1)。
(一)
(b)
我们下一个执行功能基因富集分析利用聪明才智通路分析(IPA)工具。监管明显独特的基因合并为每个刺激。进行了岩心分析和生物浓缩生成基于基因注释。前20名来自calprotectin生物功能和IL27-regulated基因在图所示2。IL27-mediated基因表达表明IL27激活所有的前20名的生物功能,包括,例如,炎症反应和激活,刺激和白细胞迁移(分数≥2)。然而,calprotectin只有介导的激活的20个生物功能。这个途径分析显示,尽管IL27似乎涉及到典型的炎症功能,calprotectin的活动不太明显。
3.2。Calprotectin-Dependent IL27-Mediated基因表达的调节效应IL7,IL15,CXCL10,CXCL11
评估可能的角色calprotectin监管的IL27-dependent调节基因的表达IL7,IL15,CXCL10,CXCL11,HUVECs对待IL27 (30 ng / mL)±calprotectin (1μg / mL)和相对基因表达是不同的时间点由RT-qPCR 3、6、12、24小时如图3。Calprotectin IL27-mediated的差别引起对这些基因的表达IL15和CXCL10虽然没有观察到显著的影响都没有IL7也不上CXCL11。有趣的是,calprotectin IL27-induced基因表达降低IL15一半的时间点,而其表达下调的影响CXCL10较弱和有限的时间点初3 h和6 h。这些结果指向一个特定的downregulatory calprotectin在内皮IL27-dependent信号导致的基因表达IL15和CXCL10。
(一)
(b)
(c)
(d)
为了证实了炎性活动IL27 calprotectin调节效应,刺激了HUVECs TNFα(2 ng / mL)±calprotectin (1μg / mL) 3、6、12、24小时,基因的表达IL7,IL15,CXCL10,CXCL11分析了RT-qPCR(图4)。我们观察到相似的肿瘤坏死因子α介导基因upregulationIL7,IL15,CXCL10,CXCL11。此外,calprotectin诱导downregulatory对肿瘤坏死因子的影响α介导的基因表达IL7、IL15 CXCL10,因此验证我们之前发现和强调IL15- - -CXCL10特殊技能calprotectin的监管作用。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。Calprotectin-Dependent调节对IL27-Mediated胞内蛋白表达的影响
探讨IL27-induced HUVECs蛋白表达和检查的潜在管理角色calprotectin在这个过程中,我们使用一个label-free MS-based蛋白质组学的方法。HUVECs刺激了IL27 (30 ng / mL)±calprotectin (1μg / mL) 6、12和24小时。总的来说,独特的蛋白质检测的数量为每个时间点是1061 6 h, 994在12 h和886在24 h(表1)。如图S4的表示值在价值来源于蛋白质组数据,截止阀值对应于一个意义值< 0.15可以选择。数据显示以下独特的不同调节蛋白质检测每个时间步:11 6 h, 143在12 h,并在24小时(表1931)。此外,时间增加显著表达蛋白质IL27——calprotectin-stimulated HUVECs被观察到。有趣的是,聚集有关透露已经最高蛋白表达数字12 h暗示calprotectin IL27-mediated蛋白表达的调节作用(表1)。如图5,calprotectin时间28日调节对蛋白表达的影响被观察到独特的蛋白质。图6总结了定性calprotectin IL27-mediated蛋白质表达的调节作用。虽然calprotectin使具有潜力的IL27-dependent表达NMT1 (12 h)和STAT1(24小时)和调节STAT3(6小时),它的表达减少1英镑和战争在24 h和表达下调STAT1 6 h。此外,证明钙卫蛋白阻止NID1的差别IL27-mediated对这些TPM1并且,以及14 upregulation蛋白质:ARFGAP1, BASP1, CANX,应付,GNB2, GP1中,GSTP1, HMOX2, PKM是PEBP1, PDLIM5, RPL30 PSMA7, YBX3。聚集有关的结果还表明,HUVECs IL27 + 5的差别calprotectin诱导的对这些蛋白质(FERMT3 H2B1C, KP2 PECAM1, SRSF7)而2蛋白质(AHSG和S100A9)调节。然而,没有一个相应的蛋白质的基因引起IL27和受calprotectin差异表达。这些发现强调所扮演的角色的蛋白质水平calprotectin IL27-dependent蛋白表达的调节。
3.4。Calprotectin-Dependent调节影响IL27-Mediated STAT1/3信号
转录的信号传感器和催化剂(STAT) 1和3都是已知的下游信号级联IL27并通过磷酸化激活(49,50]。我们的蛋白质组学结果清楚地表明,calprotectin调节IL27-mediated STAT3蛋白表达在6 h而STAT1的蛋白表达下调6 h和调节在24 h(图5)。接下来我们分析了西方墨点法STAT1和STAT3磷酸化水平与IL27 HUVECs刺激时(30 ng / mL)±calprotectin (1μg / mL) 3、6、12、24小时(数字7和S5)。有趣的是,IL27 + calprotectin cotreatment显然使具有潜力IL27-mediated STAT1磷酸化在12和24小时但没有影响的STAT3磷酸化,表明calprotectin可能通过STAT1的监管活动调节IL27-dependent炎性信号。
(一)
(b)
4所示。讨论
在炎症细胞因子的功能IL27机制导致免疫细胞通过内皮轮回争议进行了讨论。在这项研究中,我们调查了潜在IL27-dependent诱导炎症反应对内皮细胞基因和蛋白质表达的血管炎症。此外,我们建议calprotectin可能参与了这一过程的监管。
4.1。的调节作用在IL27-Mediated Calprotectin炎症
动物和人类研究显示矛盾的观察的调查IL27硬化的作用。在动物模型中发现一个atheroprotective角色而人类研究证明了一个重要的proatherogenic IL27在心血管疾病中的作用[30.,51]。HUVECs我们的研究结果表明,接触不同的基因差异表达的结果以选择IL27浓度(图19 96测试的基因1(一)和表S1)。其中19个基因,我们观察到15调节基因是已知参与炎症。路径分析表明IL27-induced基因是高度参与等多种生物功能的激活激活,刺激,和白细胞迁移(图2)。因为这些函数是动脉粥样硬化的早期步骤发展的基本特征,我们提出不仅促炎也是proatherogenic IL27保护者的角色,在协议与国王的途径分析和同事(30.]。
在人类研究中,这两个证明钙卫蛋白亚基S100A8 S100A9并且在动脉粥样硬化斑块和升高的血清中检测到的病人患有外周动脉疾病(52,53]。在我们的研究中,刺激HUVECs calprotectin不同浓度显示16 96测试的基因差异表达基因(图1 (b)和表S1)。然而,calprotectin-induced基因表达表明糟糕的监管效果的表达水平与FC(只有2基因> 1.5)。我们的观察是依照Viemann和合作者的研究中,人类微血管ECs与200年刺激μg / mL calprotectin 6 h:尽管calprotectin浓度升高,使用FC > 1.7只有16个基因被诱导,提出参与促进血小板聚集、炎症和内皮通透性(54]。
为了启发calprotectin的角色在我们的实验装置,我们的路径分析表明,calprotectin-regulated基因并不涉及典型的白细胞活化和迁移而完全参与(图延迟过敏的反应2)。基于这个途径分析,我们假设可能calprotectin HUVECs炎症反应的调节活动。为了澄清calprotectin的炎症作用,我们调查他们潜在的协同,添加剂或拮抗对转录组和蛋白质组水平的影响。我们首先分析了calprotectin对HUVEC基因表达水平的影响,关注4大多数调节基因在IL27刺激(IL7,IL15,CXCL10,CXCL11)(图3)。
我们观察到清晰的对IL27-mediated calprotectin调节的影响IL15和CXCL10基因表达(图3 (b)和3 (c))。有趣的是,刺激与calprotectin IL27-mediated基因的表达减少IL15在整个时间范围和研究CXCL10在早期的时间点(数据3 (b)和3 (c))。根据我们的观察,我们建议IL27-mediated calprotectin的抗炎作用IL15和CXCL10基因的表达。但细胞因子IL27是已知效功能支持和抗炎能力(20.),这可能导致误解的calprotectin提出的抗炎作用。因此,我们也刺激HUVECs强有力的促炎TNFα在相同的条件下在calprotectin面前。有趣的是,类似calprotectin减少影响观察TNFα介导的基因表达(图4),非常支持我们的假设关于calprotectin的抗炎能力IL27-stimulated HUVECs。分析基因组是不足以完全理解疾病表型或开发过程。因此,我们进一步分析了整个细胞溶解产物的细胞内蛋白质组IL27±calprotectin-stimulated HUVECs由强迫label-free质/ MS方法来获得更大的洞察我们建议抗炎能力的上下文中calprotectin内皮炎症。label-free量化显示数量的确定和量化蛋白质类似Gautier et al。55),确定725年未经处理的HUVEC独特的蛋白质样品。另一种强迫蛋白质组学方法结合label-free量化也成功应用于HUVECs治疗临床III期候选人(56]。为了进一步推进我们的数据,我们使用了积极的错误发现率也称为值,控制着虚假的发现和纠正多个测试计算意义(57]。事实上值被证明提供了一种更直接的方式解读的意义价值的定量蛋白质组学(45]。在我们的研究中,直接比较价值观和门槛值使用广泛接受的意义值< 0.05显示值阈值最大0.175(图S4)。根据这个结果,我们选择了一个阈值的意义值< 0.15,也就是说,不到15%的重要调节蛋白是错误的发现。这最后显示数据表所示1为重要的调控蛋白。
我们的蛋白质组学方法显示calprotectin调制(图28独特的蛋白质5)。不幸的是,我们整个样品的复杂性HUVEC细胞溶解产物不允许低丰富的蛋白质如细胞因子的测定。因此,calprotectin IL27-mediated基因表达的抑制作用IL15和CXCL10不能检查在蛋白质水平强迫质/女士。然而,高蛋白质含量检测到了CXCL10以及CXCL11人类和颈动脉粥样硬化组织而没有人发现在正常血管壁,突显出这两个蛋白在动脉粥样硬化的发展起着重要的作用[58]。
关于我们的结果,因此,我们提出一个模型calprotectin IL27-mediated减少影响血管内皮炎症在动脉粥样硬化的背景下。图8描述IL27-induced血管炎症的可能机制和潜在atheroprotective calprotectin的角色在这个上下文。IL27诱导趋化因子的分泌CXCL10和CXCL11吸引单核细胞和T细胞。详细,CXCL10 CXCL11主要招募CD4和CD8 T细胞,这也代表了主要的T细胞在动脉粥样硬化斑块子集(58- - - - - -60]。CXCL10 CXCL11可以绑定通过同源受体CXCR3单核细胞上高表达,T细胞、NK细胞(61年]。在动脉粥样硬化的背景下,内皮细胞不表达CXCR3但使用非常明确的系统(62年]。科学家趋化因子如CXCL10和CXCL11还可以绑定,例如,硫酸乙酰肝素蛋白聚糖,在内皮细胞的细胞表面。这个绑定CXCL10和CXCL11可以促进单核细胞和T细胞的滚动在血管内皮62年,63年]。此外,它可以促进粘附到其他蛋白质如transpresented IL15在内皮细胞的表面。T细胞和单核细胞表达IL2R同行α和IL2R IL15R形成tridimeric IL15受体(64年]。独立研究表明transendothelial T细胞和单核细胞迁移通过IL15表达内皮细胞(64年,65年]。
我们的蛋白质组分析显示一个IL27-induced监管的各种蛋白质参与的炎症状态内皮以及动脉粥样硬化的发展。例如,细胞外基质糖蛋白nidogen-1 (NID1)被IL27高度表达下调。NID1属于基底膜和细胞外基质之间是一个重要的链接器组件胶原蛋白和层粘连蛋白(66年]。它可以表明,抑制NID1可以影响细胞形态学的扁平的圆形基础基底膜失去联系。因此,一个重要的功能含义NID1建议在血管组织屏障(67年]。此外,NID1可能参与肿瘤细胞的防御渗透68年]。另一个高度表达下调的蛋白质IL27原肌球蛋白1 (TPM1),这被认为是一种肿瘤抑制基因。抑制TPM1可能导致的不稳定细胞骨架(69年]。是描述的起始和发展动脉粥样化可能发生由于失去完整性的一个完整的内皮细胞单层(70年]。在动脉粥样硬化的背景下,一个潜在的downregulator TPM1可能是小非编码的microRNA miR21 [71年),miR21最高调节microrna在人类动脉粥样硬化斑块的研究(72年]。在我们的研究中,IL27诱导1英镑的upregulation也观察干扰素γ对待HUVECs [73年),导致增强单核细胞的粘附。类似的结果也证明了增加单核细胞的粘附在刺激人类皮肤微血管内皮细胞(HDMEC)和人类冠状动脉内皮细胞(HCAEC) [74年]。
根据我们的数据和我们的假设模型,IL27-induced内皮炎症参与招聘、粘附、浸润的单核细胞和T细胞。因此,我们提出一个重要proatherogenic角色IL27在动脉粥样硬化的早期步骤。此外,我们观察到IL27-induced upregulation PEBP1的符合PEBP1水平升高在动脉粥样硬化的载脂蛋白e−−/老鼠(75年]。我们也提出一个calprotectin atheroprotective作用,如图8。刺激与calprotectin防止IL27-mediated upregulation NID1 TPM1,表明没有底层的基底膜发生的障碍。此外,calprotectin减少IL27-mediated upregulation 1英镑的可能导致减少单核细胞粘附内皮。有趣的是,calprotectin下调PECAM1的蛋白表达,导致减少transendothelial迁移的假设:PECAM1确实是被称为一个重要的贡献者transendothelial白细胞迁移到血管壁(76年]。
比较刺激IL27和IL27 + calprotectin IPA通路分析(表S2),我们发现,对于聚集有关,calprotectin负责抑制mTOR以及EIF2信号通路。不同的动物和人类模型中观察到的组织,抑制mTOR可能导致antiatherosclerotic效应导致预防或延缓动脉粥样硬化的发病机制(77年,78年]。根据我们的研究结果,我们提出一个atheroprotective角色calprotectin通过其对transendothelial IL27-dependent影响白细胞迁移到血管壁。
4.2。假设关于Immunoprotective Calprotectin的角色
它已被证实在活的有机体内,calprotectin LPS-mediated炎症减少了直接绑定到有限合伙人也到其他细胞因子如摘要意思β、白细胞介素6和TNFα(37]。另一个在活的有机体内动物研究显示减少严重的炎症细胞浸润后证明钙卫蛋白政府提出了一个清道夫活动并且calprotectin [38]。关于我们的实验装置,基于知识calprotectin可以绑定到TNFα,因为我们表明calprotectin同样降低TNFαIL27-mediated基因表达,我们也建议潜在calprotectin和IL27之间蛋白质间交互作用。这个拾荒者函数并不直接意味着预防受体结合和随后的信号通路的激活,因为它取决于IL27免费绑定网站的可用性。calprotectin能否防止IL27其受体的结合需要更多的调查。除此之外,它也记录了IL27受体激活发生通过Janus激酶和统计数据。有趣的是,一项研究发现,排泄和分泌(ES)产品从寄生虫降低干扰素γ介导的CXCL10基因表达没有任何抑制phosphorylation-dependent激活的上游调节器STAT1 [79年]。然而,没有减少CXCL9mRNA水平观察,这也可能被解释成不同的基因转录所需transactivating代数余子式的存在。这种调节过程是否可以外推到calprotectin的观察不同的调节效果IL27-mediated STAT-dependentCXCL10/CXCL11基因表达需要进一步的调查。
5。结论
总之,我们的研究结果清楚地表明,细胞因子IL27起着重要的作用作为一种促炎介质通过调节内皮基因和蛋白质的表达,这可能是主要参与早期动脉粥样硬化的机制。更重要的是,我们首次展示calprotectin充当一个调制器的这个过程。我们的主要发现的的识别作用calprotectin IL27-mediated调控的基因表达(IL15,CXCL10)、蛋白表达(TPM1, NID1 PECAM1, 1英镑),和信号激活(STAT1)。根据这些观察,我们表明,在IL27-induced血管炎症,calprotectin小说可能是一个有吸引力的候选人作为管理者的单核细胞招聘早期动脉粥样硬化病变,因此预防炎症和动脉粥样硬化的进展。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
作者要感谢倩碧银亮钢(罗伯特·舒曼Hopitaux卢森堡)提供剖腹产的脐带。作者非常感谢伊冯Ducho(实验和内部医学研究所,马格德堡,德国)质谱仪为样品制备。作者还要感谢Fabrice Tolle博士(卢森堡大学生命科学研究中心)的援助HUVECs隔离和建议在本研究的完成。此外,他们感谢Enrico Glaab博士(系统生物医学中心卢森堡卢森堡)援助与蛋白质组学数据分析和普朗松Sebastien博士(卢森堡大学生命科学研究中心)与流式细胞术寻求帮助。最后,作者感谢Ioanna Chatzigiannidou和尼古拉•荣格(卢森堡大学生命科学研究中心)技术的帮助。这项工作是支持的卢森堡大学和博士的学校系统和分子生物医药、卢森堡大学。
补充材料
图S1、S2、S3和S4正常化和分析相关的蛋白质组学数据。图S5显示了一个免疫印迹用于获得关于统计磷酸化状态图7。表S1显示了使用多基因阵列TaqMan IL27 / calprotectin对比分析试验。国际音标表S2对应分析IL27与IL27 + calprotectin细胞刺激。