文摘

背景。严重创伤诱发一个复杂的病理生理学,由患者自身的免疫系统。最初的激活有关的分子模式的结果,这是释放中断,垂死的细胞被免疫受体,例如,愤怒。在这项研究中我们的目的是评估的贡献愤怒轴早期和晚期的免疫反应。方法。我们招收了16一起严重创伤患者10大腹部手术后患者和10个健康志愿者。血液样本被承认和每48 h共8天。等离子体浓度配体以及各种愤怒亚型和用ELISA检测il - 6。单核细胞表面的表达愤怒和HLA-DR被流式细胞术进行评估。结果。高和瞬态水平的il - 6和甲基乙二醛描述早期创伤后免疫反应,而样本后时间点为二次释放愤怒配体提供证据。结论。我们的研究结果提供证据的持续激活愤怒轴而古典介质如il - 6早期消失。考虑到免疫功能不全的单核细胞的表型,愤怒配体可能重大贡献者的知名中学阶段受损创伤患者的免疫反应。

1。介绍

创伤性损伤的治疗是一个基本的日常任务世界各地的医疗系统。情况时的严重程度和组合成了大大更具挑战性的病人损伤导致危及生命的条件。这些严重的外伤导致全球每年超过500万人死亡,这一数字可能会进一步增加在未来年1,2]。除了实际的致死率,治疗,剩下的残疾,身体障碍代表高个人以及社会经济负担(3]。严重的伤害来自有多种原因,尤其是从武装冲突,但在没有战争的情况下,交通事故的主要原因是住院发达以及第三世界国家。由于伤病,病人的体内平衡崩溃,触发一个高度复杂的病理生理学网络(4]。它都是交织在一起的系统的主要驱动力凝血和炎症(5),后者最初激活免疫原性有关分子模式(抑制)释放中断和坏死的细胞6]。由于大量的伤害和释放介质,创伤患者通常表现为全身炎症反应综合征(SIRS)。这是由于抑制激活免疫细胞通过绑定到相应的模式识别受体,例如,为先进的糖化结束产品受体(愤怒)。愤怒是一种multiligand免疫受体识别不同的抑制,包括proteinergic配体高机动组框1蛋白质(HMGB1)或S100蛋白质新陈代谢以及改性蛋白质和脂质,被称为高级糖化终端产品(年龄)7- - - - - -9]。由于愤怒绑定,促炎信号级联被激活,最终导致NF -的激活κB和目标基因表达的变化。年龄从nonenzymatically从而产生反应(美拉德反应)的高氧化应激条件结合葡萄糖的可用性(10]。几个条件,例如,糖尿病及其并发症如动脉粥样硬化,已经被证明是有原因地由这些化合物和配体(11)和可溶性形式的愤怒已确定和特点在许多其他人,包括急性系统性炎症条件像脓毒症12- - - - - -14]。两位杰出的可溶性亚型与不同的生成机制,内生(esRAGE)和可溶性分泌愤怒(sRAGE)。虽然esRAGE可变剪接事件的结果随后分泌,sRAGE来源于膜结合受体的蛋白水解乳沟。首次激活后,肌体平衡免疫反应,导致免疫功能紊乱的代偿阶段创伤患者(15]。稍后阶段是高相关性的病人,因为它们呈现高度脆弱复苏的感染在这段时间里,不仅因为他们的免疫状态,但也由于身体障碍的干扰,例如,皮肤或肺上皮细胞。

按照我们之前的结果和结果从其他组16,17),我们想扩大我们的知识关于愤怒及其配体参与系统性支持与抗炎创伤后免疫反应。为了实现这一目标,我们进行了一项前瞻性队列研究和测量血浆的浓度已知的配体以及可溶性和膜结合受体亚型。令人惊讶的是,我们能够显示不同的时空模式的配体愤怒,暗示一个持久基底“愤怒”的环境,这可能导致免疫功能障碍的患者。

2。患者和方法

2.1。病人

这个观察的临床研究在大学医院外科重症监护病房吉森,德国,当地伦理委员会批准后(伦理委员会的医学院李比希大学吉森:试验代码127/09 /德国临床试验注册:DRKS00000480)。知情同意是获得所有的病人和志愿者登记。如果病人不能同意,法定代表人是提前通知。总体来看,16个病人严重创伤后的特点是一个损伤严重度评分(ISS)≥16人参加这项研究。此外,10大腹部手术后患者(表1),包括10名健康的志愿者。对所有群体,满足下列条件导致排除在研究:年龄< 18年,终端肾功能不全、糖尿病(第一种和第二种),自身免疫性疾病(如克罗恩病恐怖、类风湿性关节炎),动脉粥样硬化和心肌缺血的历史/冠状动脉旁路移植/经皮穿冠状血管成形术,和怀孕。

血样来自外伤病人住院后24小时内,随后每2天(最多8天),只要患者在ICU。血液是只有一次的手术病人(结束后24小时内手术)和健康志愿者。

2.2。样品制备和ELISA

抽血液直接进入溶液EDTA管并立即处理。血浆的和细胞分数被离心分离为1.200×g在室温下10分钟。移除后,等离子体被存储在整除−80°C,直到进一步的分析。每个样本只有解冻过一次分析。

血浆的因素进行了分析使用商用ELISA根据制造商的指示:sRAGE(研发系统,明尼阿波利斯,美国),esRAGE(美国库比蒂诺B-Bridge国际)、白细胞介素- 6 (il - 6)(研发系统,明尼阿波利斯,美国),年龄,CML,和MG(细胞生物学实验室的所有三个公司,圣地亚哥,美国),S100A8(美国诺RayBiotech) S100A12(美国沃本MBL国际)和HMGB1 (Shino-Test公司(日本东京)。

2.3。流式细胞术

表达愤怒和HLA-DR被流式细胞术进行评估。HLA-DR的定量测定,50μL(全血与20孵化μL (Quantibrite HLA-DR /单核细胞抗体鸡尾酒(美国圣何塞BD生物科学)30分钟在黑暗中在4°C。后来,红细胞被添加450细胞溶解μL 1 x流式细胞仪赖氨酸溶液(美国圣何塞BD生物科学)和进一步孵化在室温下15分钟。测量进行FACSCalibur血细胞计数器(美国圣何塞BD生物科学)。在每个时间点校准曲线是通过测量获得的珠子与独特的荧光性质(Quantibrite PE珠子,BD生物科学、圣何塞美国)。根据制造商的说明和计算结果给出每个单核细胞上HLA-DR分子的平均数量。

在愤怒的情况下,100年μL全血与0.2孵化30分钟μg anti-CD14-FITC(美国圣地亚哥类别编号为301804,BioLegend)一起4μ号码sc - 80652 g anti-RAGE-APC(类别,圣克鲁斯生物技术、达拉斯、美国)或等量的同形像控制抗体(sc - 2889,圣克鲁斯生物技术、达拉斯、美国)。红细胞裂解是由2毫升的流式细胞仪赖氨酸溶液后跟额外孵化(15分钟)和两个清洗步骤。测量平均荧光强度与APC校准曲线(刘海实验室、渔民、美国)获得一个健壮的定量表达结果等效可溶性分子荧光染料(MESF)。

2.4。测量丙酮醛与高效液相色谱法(HPLC)

甲基乙二醛的浓度(毫克)等离子体是由衍生,2-diamino-4, 5-dimethoxybenzene和喹喔啉加合物的高效液相色谱荧光检测(如前所述18,19]。

2.5。统计数据

所有使用SPSS统计分析和可视化进行Mac版21 (IBM,阿蒙克,纽约)。一般来说,箱线图用于图形表示。组比较,nonparametrical Mann-Whitney测试使用。比较多的两组,克鲁斯卡尔-沃利斯检验对全球进行最初的差异。相关性分析、非参数枪兵分析了。水平的意义被描绘成在数字与符号,和。

3所示。结果

3.1。研究人群

创伤病人的调查群体主要由男性(87.5%)的中年(中值:44.1年)空间站中值为34.1,代表一个“典型”的创伤严重受伤。这些主要是由于交通事故,交通事故(co)司机的主要原因(43.8%)。因此,胸腔的大多数病人面对伤害(87.5%)和/或腹部(75%),而头部受伤只出现在大约三分之一的病人(表1)。常规实验室标记而言,创伤病人显示早期c反应蛋白的增加,而白细胞整体延迟动能。血糖水平往往是增加在整个观察时间(补充图1)网上(见补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2015/691491)。术后控制队列由患者接受腹部手术,例如,切除的胰腺和胃。

3.2。创伤后可溶性亚型的愤怒和il - 6

符合我们之前的研究中,我们可以显示早期和瞬态增加可溶性亚型的愤怒,创伤后立即sRAGE esRAGE, il - 6(图1)。有趣的是,这些手术后不能观察到等离子体水平增加,暗示全球的主要影响干扰止血在创伤病人相比选择性病人在全身麻醉下。

3.3。细胞表面的表达愤怒和HLA-DR单核细胞

为了评估大量的愤怒在单核细胞,流式细胞仪进行测量。患者创伤和手术病人显示从头开始减少大量的愤怒在细胞表面(图2(一个))以及普遍下降的趋势RAGE-positive单核细胞与健康对照组(图相比2 (b))。这些趋势是保持在所有时间点。此外,作为一个代理标记的免疫能力,我们定量测量单核细胞的HLA-DR表面表达。正如所料,再次HLA-DR表达两组明显下降,创伤后坚持病人在整个观测时间。尽管整体动能相同,愤怒的表达水平和HLA-DR创伤患者在所有时间点关联弱但显著(,)。

3.4。愤怒配体和代谢创伤后压力

一系列的配体不同的起源和性质到目前为止已经发现了愤怒。我们想阐明的问题程度的愤怒实际上配体后发生创伤和可能有助于病理生理学。令我们吃惊的是,典型的抑制HMGB1的血浆浓度改变创伤后立即或在以后任何时间点(图3(一个))。与此形成鲜明对比的是,S100A8(图3 (b))以及S100A12(图3(一个)延迟动能)水平增加,达到峰值后第四天创伤。相同的动能也发现AGE-modified蛋白质(图4 (c))。看看其他代谢配体,例如,CML MG-modified蛋白,最初我们的研究揭示矛盾的动能与浓度低于健康对照组手术创伤患者,4天后恢复正常(图中恢复4(一)和4 (b))。最后,我们测量丙酮醛羰基活性物种的浓度(毫克)等离子体,这是一个有关司机年龄(图的生成4 (c))。与CML -和MG-modified蛋白质的浓度下降,MG实际上只在创伤患者早期达到顶峰,回落到正常的价值观在创伤后第二天。总的来说,结果表明交织发生的早期(il - 6,可溶性愤怒,丙酮醛)和后期(白细胞、S100A8 + A12 AGE-modified蛋白质)利益相关者的免疫反应的基础上愤怒的免疫功能受损和低丰度在创伤患者单核细胞。此外,推迟一代的年龄可能受葡萄糖的高可用性,这是一个常见的危重病患者的特点。

4所示。讨论

我们的研究是第一次我们的知识,探讨了愤怒轴严重创伤后的病人一个纵向的方法,包括代谢配体和司机、可溶性受体亚型,单核细胞表面表达。证据的重要性在此设置在其他来自多态性研究,呈现一个协会的感染性并发症与单核苷酸多态性(SNP)创伤后催化剂地区[愤怒表达调控20.]。此外,由于高基础表达水平的愤怒肺细胞(21),结扎的受体可能诱发随后的肺功能障碍(22]。

我们组和其他早期的研究表明,可溶性亚型发生迅速和暂时性的创伤和相关联后,与损伤程度(例如,16,17]。这些结果符合我们当前研究的结果,并延长在对照组。事实上,患者在手术后不显示愤怒发生的剧烈的运动创伤患者,暗示一个生成的分子机制,而根据解除体内平衡相比,实际的组织损伤,这是在相同的程度上出现在主要的腹部手术后的病人。这个想法也进一步支持的事实,脓毒症患者,是一种代表了感染与创伤后无菌情况,表现出高血浆的水平的sRAGE [13,14]。在目前的研究中,血浆il - 6水平也显示出显著的区别病人手术后和创伤,证明早期和暴发性先生们说一些几十年前23]。尽管群体之间的差异反应,抑制已被证明是创伤后免疫反应的重要介质,其他条件(6]。HMGB1的典型的潮湿与高在所有体细胞核丰富,释放后创伤被科恩和同事(早些时候报道24]。然而这是冲突与我们目前的研究结果,我们不能看到任何明确HMGB1含量的变化。然而,HMGB1早些时候报道诱导交叉抗性有限合伙人(25)以及二级功能衰竭的状态在成熟单核细胞(26]。HMGB1之外,还大量阿森纳其他抑制免疫原性司机已报告,尤其是自己的线粒体DNA (27]。

估计高水平的可溶性愤怒是否与单核细胞表面表达下降有关,流式细胞仪实验进行。在最初的下降之后,大量的愤怒往往会增加一部分病人然后再下降,而愤怒的比例⁺单核细胞仍或多或少是相同的。尽管没有显著差异,但我们不能排除,单核细胞失去愤怒剧目的一部分,例如,酶脱落的金属蛋白酶ADAM10 [28),可能是一个counterregulatory机制来避免过度激活的炎症信号级联。支持这个想法,我们的病人表现出持续减少HLA-DR在整个观测时间,一个标志,是一个有效的代理对单核细胞的免疫功能29日]。不过,愤怒的残余表达单核细胞基底信号水平可能仍然不够,由于愤怒的延迟发生的免疫原性配体,即S100A8 S100A12。最后一个也被报道可以绑定并激活TLR4促炎的方式(30.]。S100A8也是同样如此,最重要的是证明诱导二次hyporesponsiveness状态在单核细胞(31日),模拟临床图片中我们观察队列和类似于著名的内毒素耐受状态32]。此外,我们还发现AGE-modified蛋白质增加延迟但深刻的方式。这可能是外伤病人新陈代谢相关的指标变化,导致主要增加血糖水平,其次,结合氧化应激,上述年龄段的一代。一种解释可能是已知的瞬态,inflammation-induced胰岛素抵抗[33),诱导糖尿病代谢条件。因此,“真正的”糖尿病已被证明是增加血浆的年龄层次,有趣的是还高血浆的甲基乙二醛(毫克)负载(34),一个功能我们也观察到在创伤患者,我们发现在脓毒症患者(早些时候35]。MG是羰基活性物种的一员,在几个方面可能会影响细胞功能。在糖尿病、镁已被证明非常独特的修改和hyperactivate,钠离子通道表达疼痛的感觉纤维,导致神经性疼痛的感觉(36]。有趣的是,也可以激活bacteria-derived甲酰化肽,导致疼痛但更令人吃惊的是调制的局部免疫反应(37]。结合这些研究结果与我们的结果毫克高水平的创伤后,出现两个假设:第一,似乎有一个细胞内分解代谢的改变,主要从糖酵解能量流的分流到毫克一代而不是柠檬酸循环。其次,MG一代可能同时促炎的刺激以及引发早期机制来抵消过度炎症,从而防止危害生物。

我们初步研究表明一些限制有关小样本大小以及奇异抽样的外科病人。此外,外伤病人解除密集或中间病房没有跟进,导致一个“生存偏差”。

总之,我们的研究揭示了所有级别的愤怒轴,从在诱饵受体配体表面愤怒的表情。有趣的是,我们发现较晚出现的proteinergic配体S100A8 S100A12以及高水平的AGE-modified蛋白质。结合免疫反应的深刻的萧条,使得病人脆弱的传染性和缺乏il - 6在以后遇到点,有人可能会假设愤怒(及其配体)是造成司机这耐火材料的免疫状况。作为常见的免疫系统,愤怒的作用可能是二价,最初推动无菌系统性免疫反应与其他已知的受体识别抑制(例如,TLR4)和次要责任,吞噬细胞的补充免疫功能紊乱(如单核细胞)。然而,我们的研究是基于临床,我们无法解开的因果关系。这个任务必须在受控环境中执行,例如,细胞培养,以准确定位在细胞功能的作用。如果我们很早和初步结果将适用,可以推测在创伤患者持续免疫功能紊乱的理由“矛盾”治疗扰乱愤怒,配体相互作用,例如,小分子抑制剂(如FPS-ZM1),目前在临床试验中测试的潜在用途,防止RAGE-mediated淀粉样蛋白运输在血脑屏障(38]。最终的目标必须是平衡免疫在我们的病人需要尽可能多的反应,但是没有失去响应补偿的方式。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Florian Uhle Christoph Lichtenstern,马库斯·亚历山大·Weigand和卡佳Weismuller进行设计和组织的学习和执行样品测量,数据分析和收集、解释的结果,和论文的写作。托尔斯滕Brenner,基督教科赫,基督教Heiss和Stefan而进行的数据分析和收集、解释的结果,和论文的写作。托马斯•弗莱明和彼得·保罗Nawroth样本进行测量的解释结果,关键论文的修改。

确认

这项研究是由一个内部研究资助的大学医院吉森Katja Weismuller Christoph Lichtenstern。彼得·保罗Nawroth和托马斯·弗莱明获得金融支持从1118年合作研究中心(DFG)。

补充材料