文摘
大肠杆菌O104: H4-associated溶血性尿毒症综合征(HUS)的特点是志贺toxin-induced血管损伤。根据最近的研究显示,失调的检验(Angpt) / Tie2配体受体系统在溶血性尿毒综合征内皮功能障碍可能是至关重要的。48成人溶血性尿毒综合征患者早期Angpt-2水平量化预测的复杂的临床过程,尤其是需要血液透析和机械通风以及癫痫的发生。在体外挑战人类脐静脉内皮细胞的患者的血清表示一个有害的中介作用减轻内皮激活Angpt-2打开未来的视角的溶血性尿毒综合征。
1。介绍
溶血性尿毒症综合征(HUS)的特点是急性溶血性贫血,血栓性微血管病,肾损伤经常引起的肠道感染类志贺产毒大肠杆菌(STEC-HUS)。STEC-HUS是一个医疗紧急事故的死亡率为4% (1]。很大比例的患者患有腹泻带血等并发症,神经系统症状广义发作,和急性肾损伤(AKI)或需要肾脏替代治疗(RRT) (1]。许多患者STEC-HUS显示自发缓解,在几周内完全恢复。然而,在一些病人病程发展迅速需要最好的支持性治疗,重症监护,介入治疗。定义相关的早期预后参数识别高危患者治疗医生仍然是一个挑战。仪器等风险评估预后生物标志物仍高度可取的。
全球内皮损伤的微脉管系统和随后的器官衰竭的病理生理特点STEC-HUS [2]。一些病态的细节仍然不明,而志贺毒素被改变的趋化因子的表达,趋化因子受体,细胞粘附分子,从而增加白细胞招募(3]。此外,血小板(4和嗜中性粒细胞5被激活。包括组织因子的释放增加内皮反应(6和激活的几个途径7]。关于内皮激活,我们也关注潜在的组的参与。
而(Angpt-1)和Angpt-2拮抗内皮细胞酪氨酸激酶Tie2的配体。Angpt / Tie2配体受体系统是一个nonredundant看门人的内皮细胞激活和控制在血管内皮细胞表型和炎症。Angpt-1不断发布和维护周围的周内皮静止。相比之下,Angpt-2竞争性抑制绑定的Angpt-1 Tie2从而破坏保护Angpt-1信号,导致船舶丧失完整性,血管渗漏和炎症基因的表达8]。在最近的一项研究发表,Angpt / Tie2系统的失调与儿童STEC-HUS的诊断(9]。然而,临床和预后的影响这一现象仍然是难以捉摸的,并且没有数据可用评估成人STEC-HUS循环组患者的作用。
在一个中心基础上,我们分析了Angpt-2成人STEC-HUS患者的血浆水平在最大爆发的报道大肠杆菌O104: H4在德国北部从5月到2011年7月(10,11]。我们旨在确定早期并发症的预测因素和结果。
2。材料和方法
2.1。病人和研究设计
48 STEC-HUS治疗患者在汉诺威医学院2011年爆发后被纳入本研究获得书面告知患者或其法定代理人的同意。这项研究是符合赫尔辛基宣言和执行机构审查委员会批准的汉诺威医学院(1123 - 2011)。
STEC-HUS确诊时患者肠出血性大肠杆菌和/或志贺toxin-2积极的凳子或出血性腹泻的历史在2011年5月至7月,满足以下三个条件:(1)血小板计数低于150 /问,(2)溶血性贫血和血红蛋白低于正常的下限,和(3)肾损伤的增加尿素和肌酐(12]。所有上述病人满足这些标准。
2.2。血液循环的采样和量化Angpt-1 Angpt-2
EDTA血浆样本量化Angpt-1和Angpt-2获得每个病人在不同的时间点(入学,入学后第三天或转诊到三级保健医院),立即离心机,分为整除,储存在−80°C。等离子体Angpt-1和测量Angpt-2如前所述13]。血浆样品的控制也实际上与EDTA。
2.3。内皮细胞培养
通过5人脐静脉内皮细胞(HUVECs) (Lonza、巴塞尔、瑞士)培养,治疗,和涂抹前面描述的详细(14]。
为了执行荧光免疫细胞化学HUVECs渐渐融合在玻璃盖玻片,固定,permeabilized,沾anti-VE-cadherin抗体和用phalloidin可视化f -肌动蛋白如前所述15]。这些实验是在每次复制和结果重现性好(数据未显示)。
内皮细胞是孵化EBM-2含5%胎牛血清(的边后卫)汇合的单层生长。当实验开始组织培养基改为EBM-2包含5%的病人的血浆。
2.4。测量Tie2
Tie2和phosphoTie2 (pTie2)测量如前所述[16,17]。不久,抗体pTie2 (Y992)(研发系统、明尼阿波利斯、MN)和Tie2 (C-20)(圣克鲁斯生物技术、海德堡、德国)。免疫印迹,等量的细胞溶解蛋白质决定0%聚丙烯酰胺凝胶和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(默克密理博,达姆施塔特,德国)。膜被封锁在室温下1小时3%牛血清白蛋白(BSA)。TBST所有洗涤步骤进行(20毫米三、150毫米氯化钠和0.1%渐变20(默克公司))。之后,膜被孵化与anti-phosphotyrosine抗体(研发系统)或anti-Tie2抗体(Santa Cruz)。蛋白质被可视化二次抗体结合辣根过氧化物酶(合)(Santa Cruz)和增强化学发光。一个模范污点从HUVEC溶解产物刺激血浆从病人补充图1所示在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2015/670248。
2.5。统计分析
连续变量表示为与相应的第25和第75百分位数中位数(四分位距(差))通过使用Mann-Whitney等级和测试和比较。变量之间的相关性被斯皮尔曼相关的评估测试或线性回归。数据分析和图准备进行使用GraphPad棱镜(GraphPad棱镜软件公司,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国)。
3所示。结果
3.1。病人的特点
我们STEC-HUS队列包含48个病人(73%的女性),平均年龄为45(27-57)年。没有慢性肾脏疾病的历史。所有病人发达溶血、血小板减少和中度到重度炎症(表1)。平均入院肌酐259.5 (163 - 342)μmol / L和43例(89.6%)出现急性肾损伤(AKI)就像我或更高。
3.2。检验水平
与健康对照组相比,我们发现显著降低血浆水平Angpt-1 STEC-HUS患者(1.36(0.95 - -2.29)和2.5 (1.5 - -3.4)ng / mL,)以及Angpt-2显著升高(2.6 ng / mL(1.8 - -3.28)和1.39 (0.91 - -1.64),、职责)在入院3天。
3.3。协会组STEC-HUS复杂的临床过程
关注STEC-HUS病人,我们比较Angpt-1和Angpt-2水平在subcollectives后不同的结果参数。特别是早期血浆水平组之间的比较患者被更严重,或受到临床症状和并发症。需要进行肾替代治疗的32例(66.7%)的中位数在入院5(3 - 7.3)天。Angpt-2水平明显高于要求RRT的病人相比,那些没有(2.9 ng / mL(2.1 - -3.8)和1.8 (1.2 - -2.8)ng / mL,)(图1(一))。Angpt-2水平在入院第三天之间的歧视患者需要RRT和那些没有一个接受者操作特征曲线下面积(ROC)为0.73(95%置信区间,0.567 - -0.888;)(数据未显示)。承认,即使在天Angpt-2水平与患者要求RRT相比那些没有(2.7 ng / mL(2.2 - -3.6)和1.9 (1.3 - -2.2)ng / mL,)(数据未显示)。
(一)
(b)
(c)
入院后平均10.5天,10个(20.8%)患者出现神经系统并发症从轻度认知障碍到广义发作。再次,早期Angpt-2第三天显著增加患者癫痫发作期间相比,那些没有(3.1 ng / mL(2.5 - -5.7)和2.4 (1.7 - -3.1)ng / mL,)(图1 (b))。相应的ROC曲线显示曲线下面积(AUC)为0.71 (95% CI, 0.547 - -0.882,)(数据未显示)。
机械通风需要9例(18.8%)。Angpt-2入学后第三天高需要机械通气的病人相比,那些没有(3.8 ng / mL(2.7 - -5.9)和2.3 (1.7 - -3.1)ng / mL,)(图1 (c))。相应的AUC ROC曲线为0.80 (95% CI, 0.652 - -0.952,)(数据未显示)。
Angpt-2水平入院时没有与癫痫的发生,需要机械通气(数据没有显示)。Angpt-2水平入院时没有与癫痫的发生,需要机械通气(数据没有显示)。入院时,第三天,无论是Angpt-1还是Angpt-2 RRT / Angpt-1比率与需要,机械通风,或发生癫痫(数据没有显示)。
3.4。破坏血管内皮的完整性在体外可能被Angpt-2诱导
帕瑞克豪等人曾表明,败血症,Angpt-2减少过剩Tie2激活,导致paracellular差距形成的细胞骨架由actin-myosin-based收缩。添加Angpt-1逆转这个过程(18]。探索潜在的中介作用Angpt-1 Angpt-2我们挑战与病人的血浆内皮细胞。我们选择患者血浆从高Angpt-2水平(Angpt-2: 13.6和15.6 ng / mL)和挑战ECs测试Angpt-2水平较高的内皮细胞表型的影响。f -肌动蛋白的荧光免疫细胞化学,细胞骨架的结构蛋白,VE-cadherin,内皮细胞的主要成分,粘合连接处并且执行。ECs处理控制的等离子体不影响汇合的,相邻细胞与皮质肌动蛋白结构和典型的单层细胞边界VE-cadherin的本地化。相同的静止表型观察使用等离子体的溶血性尿毒综合征患者尤其高Angpt-1浓度(Angpt-1: 15.5和17.2 ng / mL)(图2)。然而,患者的血浆高Angpt-2 (Angpt-2: 13.6和15.6 ng / mL)扰乱了内皮架构,所描绘的压力增加肌动蛋白纤维(ASF)和不同的内皮间隙的形成。然后我们进行了一个实验来测试的影响等离子体高Angpt-1内皮完整性和Angpt-2水平。接触病人的血浆高Angpt-1和Angpt-2水平(Angpt-1: 12.1和10.1 ng / mL, Angpt-2: 9.3和12.9 ng / mL, resp)完全废除ASF和interendothelial缺口的形成。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.5。Tie2受体磷酸化在体外
结扎的Angpt-1 Tie2导致其酪氨酸磷酸化,而Angpt-2可以对抗Tie2激活。测试是否差距形成Tie2磷酸化程度是一致的,我们免疫印迹EC溶解产物pTie2后受到挑战和Angpt-1 Angpt-2等离子星座提到。Angpt-1 / Angpt-2比率明显与磷酸化Tie2 /总Tie2比率(pTie2 / tTie2) (,)(图3)表明这些循环确实是生物活性分子,他们目标规范共同受体作为HUS-associated内皮功能障碍的病理生理特征。
4所示。讨论
尽管STEC-HUS归类为血栓性微血管病,血栓事件发生率或栓塞是罕见的在德国爆发201119]。肾功能损害似乎也由直接引发急性肾小管损伤甚至当血栓事件被选择止赎的小鼠模型20.]。此外,微血管损害临床症状的贡献STEC-HUS表示了长期T2弛豫时间定量核磁共振扫描患者的神经系统并发症(21]。为目的的调查机制内皮损伤和功能障碍的患者,我们与结果相关的检验水平参数。
从我们的数据,我们得出这样的结论:组和Tie2受体的改变导致STEC-HUS的早期阶段。似乎能够指示潜在的初始内皮损伤的严重程度,从而也进一步的并发症的发病的预后价值。苦难的内皮完整性可能比血栓事件,更重要的是减轻这种疾病的新方面。
内皮完整性支持Angpt-1水平高,高架Angpt-2受损。内皮细胞暴露于等离子体水平低Angpt-2和高Angpt-1显示完整的信息接触和皮层细胞骨架的配置而暴露于高Angpt-2没有Angpt-1水平升高诱导形成严重的差距。特别是Angpt-2的贡献是我们的研究结果强调,预测RRT的要求和机械通风以及发生癫痫发作在疾病的早期阶段。作为Weibel-Palade body-stored蛋白质,Angpt-2可以快速发布在各种刺激包括细胞因子、凝血酶,缺氧,激活白细胞,血小板22]。在孩子大肠杆菌O157: H7介导STEC-HUS早期失调组最近描述(9]。在pre-HUS阶段,儿童表现出凝血凝血异常与血管损伤早期的证据前溶血性尿毒综合征肾损伤(23]。然而,触发因素诱导Angpt-2释放仍然不太为人所知,和临床预后的影响Angpt-2 STEC-HUS患者的血浆水平到目前为止已经失踪。内皮屏障的破坏可能是“一个可能的EDTA的存在。类似的对抗的病人样本与EDTA和控制,EDTA特定的影响应该从观察到的差异最小化。
等离子体水平的Angpt-1与严重程度无显著相关性折磨的病人。由于突然开始我们的研究在2011年德国爆发,Angpt-1测量无法进行足够广泛,从而限制我们的研究。作为表达更持续和血管平滑肌细胞周围的周(22,24),适应迅速增长的Angpt-2后很可能推迟到临床并发症。是否Angpt-1管理个人受到STEC-HUS可以从内皮保护,肾,或神经损伤可能是未来研究的一个有价值的目标。其他的研究强调诊断和预后的潜在循环Angpt-1和Angpt-2各种传染病如疟疾和/或脓毒症有无multiorgan功能紊乱综合症(插件)13,18,25,26)表明,预后和治疗组的选项的详细调查和Tie2受体是值得考虑的强烈。
我们的结论是,大肠杆菌O104: H4诱导STEC-HUS可能与早期Angpt-2海拔和破坏血管内皮的完整性。早期血浆水平升高为患者预后参数提供一种有价值的方法。STEC-HUS仍是一种罕见的疾病主要影响孩子,我们鼓励监控Angpt-2水平的风险评估。
此外,我们想促进更大的概念,前瞻性多中心研究需要确认预后的可靠性值和治疗干预的可能性Angpt / Tie2通路。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
亚历山大·卢卡斯和Jan Beneke造成同样的纸,都认为是第一作者。
承认
作者感谢他们的同事在医学院汉诺威密集支持在招聘和监控病人参与这项研究。
补充材料
支持图1:免疫印迹的HUVEC溶解产物刺激与等离子体STEC-HUS患者(lo Angpt-1 / 2 =低浓度,你好=高Angpt-1 / 2浓度)。示例Angpt-2高和低Angpt-1(左列)显示了一个pTie2 / tTie2比率较低。相比之下,较低的样本Angpt-2和高Angpt-1(右列)显示pTie2 / tTie2比率更高。