文摘

Low-level-laser疗法(低)是一种有效的补充治疗,尤其是抗炎和伤口愈合皮肤或粘膜肥大细胞(mc)。在外围,MCs相声神经元通过purinergic信号并参与各种生理和病理生理过程。是否细胞外ATP, purinergic信号的一个重要嘌呤,MCs和神经元可以通过辐照调制仍然未知。在这项研究中,红色激光照射对细胞外ATP含量的影响MCs和背根神经节(DRG)神经元进行调查和潜在的机制进行了探讨在体外。我们的结果表明,辐照导致细胞外ATP水平高程在人类肥大细胞线HMC-1剂量依赖性的方式,这是伴随着海拔的细胞内ATP含量、ATP合成的指示器,连同[Ca^{2 +}]_我海拔,exocytotic ATP释放的触发信号。MCs相比,辐射衰减的神经元的细胞外ATP含量,这可能是由陆军研究实验室67156年废除非特异性ecto-ATPases抑制剂。我们的研究结果表明,辐照强化细胞外ATP的MCs通过促进ATP合成和释放和变弱的神经元细胞外ATP上调ecto-ATPase活动。相反的反应,这两种细胞类型表明低强度的复杂机制。

1。介绍

Low-level-laser疗法(低)日益使用和有效的补充治疗诊所,尤其是对于伤口愈合,抗炎,缓解疼痛。肥大细胞(mc)的至关重要的免疫细胞,皮肤苍白的必要的角色在伤口愈合的过程中(1]。MCs最近发现重要的抗炎功能在活的有机体内在某种程度上(2),尽管他们著名的角色,促进炎症。皮下或粘膜MCs在活的有机体内已经提出参与抗炎(3和伤口愈合4- - - - - -7低强度的反应。最近,皮下MCs已被证明参与由激光针灸缓解疼痛的初始过程(8),越来越低,经常应用版本。在医学上,红色和近红外(NIR)激光波长之间的600和1000海里,经常应用于低,因为这些波长的激光可以穿透组织在毫米范围内所吸收的人体皮肤很低(9]。红光的近似皮肤传播深度是1.5 - 2毫米10),主要达到MCs驻留在皮肤和皮下皮肤层(11]。因此,MCs在皮肤可能直接参与低强度机制被激活在红色激光辐照。这个假设已经被一些支持调查在体外:激活脱粒12,13]、[Ca^{2 +}]_我立面图(12- - - - - -14),以及引发全细胞的膜电流(12红色激光辐照证明在MCs)。

积累的证据表明,purinergic信号参与各种生理和病理生理过程。细胞外核苷酸是重要的球员在调节炎症反应通过绑定purinergic P2受体存在于所有的炎症细胞,包括MCs [15]。P1受体的激活腺苷酸或其他受体激动剂能促进伤口愈合过程(16]。细胞外ATP不仅是内生P2受体激动剂数还有其他相关核苷酸的前体。辐照对MCs细胞外ATP含量的影响是未知的。在外围,MCs形态(17)和功能(18)与神经末梢,purinergic信号具有重要的作用[19),并通过purinergic MCs和外围神经元之间的串扰信号存在(20.]。这个相声是否可以由低级调制辐射仍然未知。

在目前的研究中,我们评估了反应背根神经节神经元细胞外ATP含量的MCs和低级红色激光辐照和进一步探讨底层机制。本研究的目的是为了更好地理解角色的ATP purinergic信号在细胞水平低强度的影响。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和隔离

人类肥大细胞行HMC-1请提供的j·h·巴特菲尔德博士(美国罗彻斯特市梅奥诊所)和培养如前所述21]。简而言之,这些细胞被孵化的phenol-red-free IMDM介质,补充了2毫米谷酰胺,25毫米的玫瑰,10% (v / v) 1%胎牛血清青霉素、链霉素,95%湿度孵化器(电子模型:310年,热,热,沃尔瑟姆,美国)公司为5%₂在37°C。细胞密度大约是/毫升。

隔离大鼠腹膜MCs修改根据詹森et al。(2006)22]。简而言之,成人Sprague-Dawley老鼠(280 - 320 g)被公司牺牲₂窒息。30毫升钙/镁免费汉克的平衡盐溶液(hbs)注入腹腔的老鼠。腹部剧烈搅动后2分钟,注入了哈佛商学院收集和离心机在400 g与外开式转子5分钟。(150毫米NH Ammonium-chloride-potassium赖氨酸缓冲区₄KHCO Cl, 10毫米₃,0.1毫米EDTA-Na₂)被用来破坏红细胞。细胞颗粒很resuspended 8毫升70%等张percoll轻轻地覆盖2毫升RPMI 1640中。MCs呆在底部分数在580 g细胞悬液离心后15分钟。MC颗粒是resuspended RPMI 1640中。确定的可行性和纯度是0.4%台盼蓝和0.5%甲苯胺蓝(TB)。细胞密度是根据需要调整(见部分2。6在孵化器)和细胞平衡2 h。

隔离大鼠DRG神经元的修改根据Burkey et al。(2004)23]。简而言之,成人Sprague-Dawley老鼠(150 - 170 g)被公司牺牲₂窒息。Hibateral drg是从胸腰椎区域切割的脊柱和放置在含氧钙/镁自由哈佛商学院。周围的结缔组织鞘神经节摘除,然后孵化3毫升的F12培养基含有1.25毫克/毫升胶原酶IA, 300 U脱氧核糖核酸酶IV (DNase),在37°C和0.05%胰蛋白酶IX-S 50分钟。结束时潜伏期8毫升F12培养基含有10%马血清添加终止酶反应。Ganglia颗粒是由离心收集(200 g, 2分钟),resuspended F12培养基,通过fire-polished玻璃机械搅拌巴斯德吸管,直到分离细胞的悬浮均匀。神经片段被丢弃在60 g离心2分钟,和孤立的单个细胞的底部颗粒被resuspended F12培养基,转移到35毫米培养皿培养2 h。最后孵化,nonneuronal细胞附着在底部后,独立收集感觉神经元的平衡2 h的孵化器。

2.2。皮肤组织准备

还是男性Sprague-Dawley老鼠(中国科学院上海实验动物中心,上海、中国)重120 - 150克深感与乙醚麻醉。每只动物和一些棉花球放置在一个密封的容器中浸泡与醚(化学试剂国药控股有限公司,上海,中国。老鼠才斩首,他们深深麻醉。头发在胫骨外侧刮,用剪刀和皮肤被割开公开结缔组织,与钝敏锐地分离钳和剪刀在孵化前浴溶液(BS)(见部分2。3)1 h。片由三个结缔组织层,疏松层夹在两个致密层。疏松结缔组织的暴露是拉伸方向相反的两个致密层。此后,组织切片是由小针热熔胶固定在室底部的支持。识别MCs,固定片在0.5%的结核病孵化10分钟,然后用95%乙醇洗3次。本研究依照规定执行动物保健和使用委员会上海中医药大学(证书号2013012)。

2.3。试剂和解决方案

组织切片的BS包含(137毫米)氯化钠,氯化钾2.7,2 CaCl₂5 MgCl₂,5.6葡萄糖,和10个玫瑰,pH值7.4与氢氧化钠(调整)。HMC-1的b细胞是由以下(毫米):150氯化钠,氯化钾,2 CaCl₂5 MgCl₂4山梨糖醇,和10个玫瑰,pH值7.4与氢氧化钠(调整)。同渗重摩的解决方案是310 mOsm /公斤,验证与渗压计(微渗压计模型:3300年,先进仪器公司,诺伍德,妈,美国)。所有实验在室温下进行(23日°C)。

文化媒介、哈佛商学院、血清、抗生素、钙green-1,普朗尼克f - 127和从英杰公司购买公司(美国);所有其他化学物质都是购自σ公司(美国)。

试剂准备在股票的解决方案并将其保持在−20°C和b或培养基稀释之前使用。在一些ATP-accessing实验,HMC-1细胞使用NEM BAPTA或陆军研究实验室的67156 20分钟前发光测量。

2.4。辐照

根据Kubelka-Munk理论(24>),红灯辐照度减少90%的深度1.5 - 2毫米(参见[10,25])。因此,在我们目前的实验中,我们开始与一个剂量的17 J /厘米²,5%的我们之前的动物研究中使用的剂量水平(8]。更高的光剂量是通过延长曝光时间。激光设备和辐照参数用于HMC-1细胞和组织切片展示在表1。大鼠腹膜MCs和神经元,激光功率密度调整到18千瓦/厘米²,然后20分钟曝光生成21 J /厘米²。

在ATP-related实验中,平衡细胞悬浮液在1.5毫升埃普多夫管(见部分2。6)被暴露于激光垂直进入管,为了让整个悬挂辐照。介绍了在光和荧光成像实验中,光在60度角组织切片或HMC-1细胞,和所有的细胞在显微镜下观察辐照。

监控可能的激光辐照引起的热效应,温度通过热电偶记录。红色激光引起的温度变化的灌注BS仅相当于0.2°C在15分钟照射。

为了排除这种可能性,试剂由激光被修改,100年的吸收光谱μM NEM, 25μM BAPTA, 100μ陆军研究实验室的67156进行扫描。所有的药物657 nm激光显示显著的吸光度。

2.5。光和荧光图像

探讨激光照射对大鼠皮肤的影响MC脱粒,组织切片固定在灌注室和显微图直立光显微镜下被捕(模型:NF1、尼康、日本)。

估计(Ca^{2 +}]_我HMC-1细胞钙green-1荧光测量如前所述[21]。短暂,HMC-1细胞生长在玻璃cover-slips涂poly-L-lysine在安装之前灌注室。5毫米钙green-1是股票的解决方案是溶解在20% (w / v)普朗尼克f - 127。HMC-1细胞被装载在phenol-red-free IMDM包含4μ米钙green-1是45分钟;然后加载与b细胞被过冷。荧光实验中使用的所有解决方案包含2.5毫米丙磺舒。倒光显微镜下显微图被抓获(模型:TE2000-U、尼康、日本)CCD摄像机(Orca-ER、滨松光子学、滨松、静冈市、日本)。图像数字化和平均(3帧),背景校正,图像处理和分析的系统(芥末软件、滨松光子学、滨松、静冈市,日本)。单个细胞的荧光强度视场被收集的图像强度的平均值确定感兴趣的区域内每一个细胞。图是彩色图像J软件(美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)。

所有显微镜图片拍摄40 x目标放大(CFI超级计划萤石ELWD, 0.6在附加说明)。

2.6。ATP的测量

ATP含量是由生物发光分析量化测量光输出从luciferin-luciferase反应26]。评价细胞外ATP含量、细胞密度调整至/毫升。100年μL整除分散细胞悬浮液被放置在1.5毫升埃普多夫管HMC-1细胞或为孤立的细胞96孔板。2 h后平衡的孵化器,所有样本分为未照射控制和辐照组暴露于激光对不同辐照时间。100年的样本,测量ATP水平μL luciferin-luciferase测定混合稀释,稀释缓冲和调整与甘露醇等渗性是添加到每个样本,并立即测量了光发射光度计(GloMax 20/20, Promega,威斯康星州的麦迪逊,美国HMC-1细胞或协同Mx, BioTek, Winooski,美国孤立的细胞)。

确定细胞内ATP含量,HMC-1细胞密度是关于调整/毫升。50μL整除分散细胞悬浮液转移到1.5毫升埃普多夫管。50μL phenol-red-free IMDM和100年μL体细胞ATP-releasing试剂被添加到每个50整除μL样本。在100年迅速旋转μL混合物转移到每个1.5毫升埃普多夫管包含100μL luciferin-luciferase试验和光发射被光度计测量立即,如上所述。操作是温和的,以避免机械细胞刺激。Luciferin-luciferase发光是校准与ATP标准之前和之后的所有样品测量。细胞内和细胞外ATP报道fmoles /细胞。

2.7。数据分析

分析的数据来源软件(OriginLab,北安普顿,妈,美国),表示为平均值±SEM。的值给测量获得不同样品的细胞的数量;的现在的独立实验的数量值。由单向方差分析样本平均数之间的差异比较,和被认为代表了统计上的显著差异。

3所示。结果

3.1。激光辐照增强HMC-1细胞的细胞外ATP含量

控制HMC-1细胞悬液的样本细胞/毫升细胞外ATP含量fmoles /细胞()。ATP含量逐步增加照射时间的1到3分钟。相对细胞外ATP增加3分钟照射引起的%的控制(,;图1),它是100年被μM NEM,胞外分泌的抑制剂(见表2)。这表明升高细胞外ATP源于细胞调节释放过程,而不是从细胞死亡。

有趣的是,不再照射时间的反应倾向于减少5分钟(只增加%控制相比,)。这一现象被描述为两相的剂量响应低光照射在1985年发现(27]。在众多的后续报道,证实促生可以获得较弱的剂量,而强剂量导致bioinhibition。这种现象经常被称为Arndt-Schultz法(28]。

3.2。激光辐照促进HMC-1细胞ATP合成

细胞外ATP含量取决于三个代谢步骤:合成、释放和水解。在不同的培养细胞类型、红色和NIR-light射线促进ATP合成[已报告29日,30.细胞内ATP索引的内容。因此在我们的研究中,体细胞ATP含量是评估。在未照射控制细胞内ATP HMC-1细胞达到fmoles /细胞()。它略微增加在第一分钟的辐照和显著增强,%控制值相比,3分钟后接触(,;图2)。类似于细胞外ATP响应,5分钟辐照诱导体细胞ATP的内容(通过增加较小%控制相比,)。细胞内与细胞外ATP内容的连贯的反应可能表明,ATP合成部分在辐照导致外部ATP含量升高。

3.3。激光照射增加(Ca^{2 +}]_我在HMC-1细胞

通常,(Ca^{2 +}]_我海拔是exocytotic ATP释放的触发信号(31日]。因此,(Ca的反应^{2 +}]_我辐照是评估。我们发现,激光辐照显著升高(Ca^{2 +}]_我在HMC-1细胞(细胞,)。一个例子实验如图3(一个),这说明了Ca的增加^{2 +}在不同辐照时间荧光。1分钟后增加的相对荧光强度明显辐照和达到% (细胞,)的控制。它上升到% (细胞,),% (细胞,)与辐照3和5分钟的时候,分别(图3 (b))。为了判断irradiation-induced (Ca^{2 +}]_我海拔高度与ATP释放,细胞内自由钙^{2 +}在HMC-1细胞被BAPTA螯合。结果表明,预处理与25 HMC-1细胞μM BAPTA封锁了3分钟照射诱导细胞外ATP上升(表2)。这表明,细胞外ATP水平取决于(Ca^{2 +}]_我端依赖ATP释放。

3.4。激光照射激活野生型MCs

为了确认红色激光辐照的影响在野生型MCs,我们测量皮肤MCs辐照的反应原位。结缔组织片分离大鼠胫骨外侧的包含MCs在高密度32]。图4(一)显示了两个MCs在一片部分;静息细胞表现出光滑、完整的膜。识别MCs染色证实了结核病的0.5%。一旦片暴露在红色激光照射5分钟,一些MCs在这片开始布满,显示粗膜和释放颗粒分散在细胞(图4 (b))。由于腹膜MCs结缔组织表型的皮肤MCs和孤立的腹膜MCs的可用数量远远高于皮肤MCs,鼠腹膜MCs被送往决定性红色激光辐照的影响ATP动员。类似于与HMC-1细胞反应观察,21 J /厘米²照射大鼠腹膜MCs还显示趋势的增强细胞外ATP内容,尽管增加尚不具备统计学意义(图5)。

3.5。激光辐照变弱的大鼠DRG神经元细胞外ATP含量Ecto-ATPase活动的调制

未照射神经元细胞外ATP含量fmoles /细胞()。MCs相比,细胞外ATP水平减毒了%在DRG神经元21 J /厘米²辐照(,,图6)。消除神经细胞外ATP的可能性可以通过激光辐照降解,对ATP的影响评估。结果表明,ATP是不受激光辐照(表2)。考虑到多个ecto-ATPases表达DRG神经元(33),我们想知道ecto-ATPase活动的抑制效应调制引起的辐照。图6说明了细胞外ATP含量的响应DRG神经元辐照的非特异性ecto-ATPases抑制剂陆军研究实验室的67156。100年μ陆军研究实验室的67156部分减毒irradiation-induced抑制细胞外ATP (,,图6)。这表明,至少在某种程度上辐照降低外部ATP水平刺激ecto-ATPases DRG神经元的活动。剩下的抑制效应的机制67156年陆军研究实验室的存在需要进一步探索。

4所示。讨论

在活的有机体内MCs已经演示了扮演一个角色在低强度抗炎(3),伤口愈合7),以及缓解疼痛(8]。不仅MCs的总数还脱粒率都增加了红色激光辐照(6]。在在活的有机体内测试,提高脱粒[12,13),组胺释放34,35],[Ca^{2 +}]_我(12- - - - - -14,34,35)以及全细胞的膜电流(12]在MCs辐照证明绿色、蓝色或红色激光。Extracelluar ATP是一个重要的自分泌/旁分泌中介调节系统功能在不同的组织通过绑定P2受体。红色激光irradiation-induced海拔MCs细胞外ATP水平已经说明在我们以前的工作(14]。在目前的研究中,我们证实了这种强效应,并演示了剂量依赖性。细胞外ATP含量受到几个流程,包括合成、释放和水解。的irradiation-induced连贯的反应在我们的研究中,细胞内和细胞外ATP内容表明,照射的刺激作用在细胞外ATP可以部分归因于提高ATP合成。由红色和NIR-light辐照促进ATP合成已经报道在不同的培养细胞类型(29日,30.]。ATP合成取决于细胞呼吸链的状态。单色光的吸收细胞呼吸链的组件,如细胞色素c氧化酶,据报道(35,36]。除了提供更多的ATP加载到分泌囊泡,增加ATP合成也将促进ATP-driven转运蛋白如Ca^{2 +}和钠⁺/ K⁺腺苷三磷酸酶。呼吸链是否参与所描述的过程在我们的工作需要进一步调查。“photo-switched“配体,调节细胞膜通道控制提出了(37,38]。这可能是另一种机制下属在我们的研究中。

我们的结果也表明了,辐照可以提升(Ca^{2 +}]_我MCs,要求作为ATP释放的触发信号(31日),从而增加细胞外ATP水平。我们的实验与BAPTA-loaded细胞提供了进一步的证据,取决于(Ca的细胞外ATP水平^{2 +}]_我上升。由于细胞外ATP是内生的P2X受体激动剂允许细胞外钙^{2 +}进入细胞(19),MCs自己表达P2X受体(39),我们假设的ATP分泌MCs可以通过自分泌产生正反馈P2受体的激活。这种机制可以放大辐照在局部地区对当地影响障碍,例如,在抗炎反应(3在愈合(7),或在当地的缓解疼痛8]。

像皮下MCs、周围神经炎皮肤也可以达到的深度照射在低强度(40]。在我们的工作中,辐射衰减的背根神经节神经元细胞外ATP的含量,这是对MCs的反应。辐照的抑郁影响周围神经系统了(41]。因为可溶性和附膜ecto-ATPases,水解细胞外ATP,存在于周围神经系统,包括诊断相关外围结局(33),调制ecto-ATPases DRG神经元的辐照可以解释对细胞外ATP含量的影响。在我们的工作,100年μ陆军研究实验室的67156废除irradiation-induced萧条DRG神经元的细胞外ATP暗示的upregulation ecto-ATPases DRG神经元。ecto-ATPases水解细胞外ATP AMP,腺苷的前身是一个重要的中介参与疼痛的绑定A1受体(42,43]。外围神经系统purinergic受体的主要领域,包括A1受体(19]。因此调制的ecto-ATPases辐照可能低镇痛作用的机制之一。

MCs与神经末梢形态(17)和功能(18]。他们之间存在串扰通过purinergic信号(20.]。论相反的反应辐照在MCs和神经元,我们假设刺激ecto-ATPase DRG神经元可以水解的部分细胞外ATP释放的MCs在低强度。

5。结论和总结

低级的红色激光辐照MCs和DRG神经元相反对细胞外ATP含量的影响。MCs的辐照剂量依赖性的方式,增强细胞外ATP水平带来的增加细胞内ATP合成和Ca^{2 +}]_我。对DRG神经元,辐照抑郁ecto-ATPases由于upregulation细胞外ATP含量。相反的反应,这两种细胞类型表明低强度的复杂机制需要进一步调查。

缩写

ARL67156:	6 n, N-Diethyl -β- - - - - -γ67156年FPL -dibromomethylene-D-adenosine-5′三磷酸三钠水合物
BS:	浴的解决方案
BAPTA-AM:	1,以叔(2-aminophenoxy) ethane-N, N, N′, N′-tetraacetic酸tetrakis (acetoxymethyl酯)
:	细胞内钙的活动
按:	背根神经节
哈佛商学院:	汉克的平衡盐溶液
HMC-1:	人类肥大细胞1号线
低强度:	Low-level-laser疗法
NEM:	N-Ethylmaleimide
主持人:	肥大细胞
近红外光谱:	近红外
结核病:	甲苯胺蓝。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这次调查的部分支持由中国国家自然科学基金(授予号。81102635和81102635),中国的国家基础研究计划(973计划,拨款2015 cb554505和2012号cb518502),和中国国家中医药管理局项目(批准号ZYSNXD-CC-ZDXK-07)。作者也感激的绿色山谷控股公司(中国上海)的支持。