文摘

过敏性疾病,如哮喘和过敏性鼻炎,是常见的。因此,治疗药物的发现这些条件是至关重要的。丁香酚和抗过敏药(我)是一种天然化合物,antianaphylactic, antinociceptive和抗炎作用。本研究检测了抗过敏药我对ige炎症反应的影响及其在肥大细胞行antiallergy机制,RBL-2H3。我们发现我显著地抑制释放β己糖胺酶,肿瘤坏死因子(TNF)α,和白介素(IL) 4,和没有细胞毒性测试浓度(0 - 100μ米)。此外,我明显减少了生产的促炎脂质介质前列腺素E₂(铂族元素₂)、前列腺素D₂(PGD₂B),白三烯₄(LTB₄),白三烯C₄(LTC₄)。我们进一步评估的影响我的Fc的早期阶段εRI级联。我明显抑制麦克米兰磷酸化对林恩和表达但没有影响。此外,它抑制ERK1/2, p38和物磷酸化与促炎细胞因子的表达。我也减少了胞质磷脂酶A₂(cPLA₂)和5-lipoxygenase (5-LO)磷酸化和cyclooxygenase-2 (cox - 2)表达。这些结果表明,抑制过敏反应,抑制激活麦克米兰,ERK1/2, p38, cPLA物₂,5-LO。此外,强大的抑制cox - 2的表达也可能导致我的抗过敏药作用。我们的研究提供了进一步的信息关于我的生物功能。

1。介绍

过敏性呼吸道疾病,如哮喘和过敏性鼻炎常见疾病免疫系统的超敏反应所致。大约10 - 20%的世界人口受到过敏,过敏患者的数量每年增加(1,2]。大多数过敏患者产生IgE的遗传易感性。肥大细胞是一个关键球员在早期的过敏反应,通常发生在几分钟内暴露于一个适当的抗原,和其他生物反应,包括炎症性疾病(3]。这些细胞是至关重要的效应细胞在IgE-dependent立即过敏反应(4]。肥大细胞脱粒引发急性炎症反应,可能导致慢性疾病的进展5]。当一个IgE-antigen结合FcεRI、受体被激活和多种生物活性介质被释放,引起过敏反应,包括释放β己糖胺酶,一种常见的脱粒标记,组胺,花生四烯酸代谢物,炎性细胞因子(6]。重要的是,花生四烯酸代谢物,包括前列腺素和白细胞三烯,调解急性和慢性过敏反应(7,8]。RBL-2H3细胞肥大细胞系,起源于大鼠嗜碱性的白血病和IgE-Fc已经广泛用于研究εRI交互和脱粒。此外,RBL-2H3细胞是一个有用的模型在体外antiallergy药物的筛选候选人。

MAP激酶级联是一个重要的信号通路调节分化,活化,增殖,脱粒,和免疫细胞的迁移,包括肥大细胞(9]。MAPK信号分子分为三组:细胞外signal-regulated激酶(ERK) 1/2, p38 MAPK和c-JunNH2-terminal激酶(物)1/2。Erk1/2是一个重要的信号在生产白细胞介素- 5 (IL),肿瘤坏死因子(TNF),α、IL-3 IL-13肥大细胞(10]。p38 MAP激酶刺激骨髓肥大细胞il - 4生产(BMMCs) [11]。此外,激活物也是负责任的,至少部分,一些细胞因子的表达和生产,包括TNF -α、2、il - 6在肥大细胞(12,13]。

丁香酚(我,1-allyl-3 4-dimethoxybenzene)是一个模拟的酚类化合物丁香酚,精油中,包括罗勒、茴香、丁香、柠檬草、和月桂叶油。在东亚,我是精油中的一部分Asiasari基数(中文Xixin)。用作调味物质在饮食产品,包括饼干、冰淇淋,和不含酒精的饮料,和在化妆品、洗发水、肥皂,香水,和草药产品在欧洲,美国,和其他国家14]。我以前的工作表明,施加抗过敏药(15),抗痉挛(16],antinociceptive [14),和抗炎17)的影响。据报道,我抑制大鼠被动皮肤过敏反应(PCA),释放5-lipoxygenase (5-LO) RBL-1细胞和白三烯D₄(有限公司₄)诱导豚鼠回肠的收缩。我也抑制化合物48/80-induced系统性过敏反应和antidinitrophenyl IgE-induced局部过敏小鼠(18]。然而,我过敏反应的影响在IgE-activated RBL-2H3细胞和其抗过敏药机制仍然未知。

在这项研究中,我们调查的抗过敏药影响我IgE-activated RBL-2H3细胞。此外,我们评估机制负责的抗过敏药影响我。

2。材料和方法

2.1。试剂

我买了从国家食品和药物控制研究所(中国,北京;纯度≥99.5%)。杜尔贝科的最低基本培养基(DMEM)、青霉素、链霉素、胎牛血清(的边后卫)从GIBCO购买(美国纽约大岛)。4 - [3 - (4-Iodophenyl) 2 - 4 (4-nitrophenyl) 2 h-5-tetrazolio] 1, 3-benzene disulfonate (WST-1)获得Dojindo(熊本、日本)。林恩,特定抗体phospho-Lyn phospho-Syk,麦克米兰,phospho-ERK1/2, ERK1/2, phospho-p38, p38, phospho-JNK,物,胞质磷脂酶A₂(cPLA₂),phospho-cPLA₂cyclooxygenase-2 (cox - 2)β肌动蛋白从细胞信号技术购买(美国贝弗利,MA)。特定的抗体phospho-5-lipoxygenase (5-LO)和5-LO,和酶免疫测定(EIA)包前列腺素E₂(铂族元素₂)、前列腺素D₂(PGD₂B),白三烯₄(LTB₄),白三烯C₄(LTC₄)从开曼群岛购买化学(美国安阿伯市MI)。酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒TNF -α和il - 4从Bangyi获得技术有限公司(上海,中国)。Dinitrophenyl - (DNP) IgE获得Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国),和DNP-bovine血清白蛋白(BSA)获得Biosearch技术公司(诺瓦托、钙、美国)。所有其他化学试剂均为分析纯,购自Sigma-Aldrich。

2.2。细胞培养

RBL-2H3细胞从文化的集合类型购买中国科学院(中国上海)。细胞在DMEM培养基培养补充10%的边后卫和抗生素青霉素(100 U /毫升和100年μg / mL链霉素)37°C湿润5%股份有限公司₂的气氛。

2.3。细胞毒性试验

细胞呼吸是细胞生存能力的指标,并通过测量mitochondrial-dependent减少WST-1水溶性四唑盐(19]。简而言之,RBL-2H3细胞被播种到96孔板(1×10⁴细胞在DMEM /)和10%的边后卫在一夜之间37°C。这些细胞被洗和孵化DNP-IgE (10μg / mL) 24 h。IgE-sensitized细胞被孵化与我(0 - 100μ米)1 h和刺激DNP-BSA (100 ng / mL) 4 h。WST-1试剂(10μL)补充道,混合物进一步孵化1 h。细胞生存能力是决定通过测量吸光度的波长450 nm的差异。

2.4。β己糖胺酶释放活动

RBL-2H3细胞孵化24-well板(2×10⁵一夜之间细胞/)37°C。这些细胞被洗1×PBS和孵化DNP-IgE (10μg / mL) 24 h。IgE-sensitized细胞被孵化与我(0 - 100μ米)1 h,紧随其后的是4 h与DNP-BSA孵化(100 ng / mL)。来衡量β己糖胺酶活动,培养基是离心机(17000×g, 10分钟)在4°C。上层清液(25μL)与10毫米混合poly-N-acetyl氨基葡萄糖(p-NAG;50μ在0.1 L)柠檬酸钠缓冲(pH值4.5)在96孔板和孵化1 h在37°C。反应被终止停止缓冲(0.1 Na₂有限公司₃缓冲区,pH值10.0)。的β己糖胺酶活动是由测量吸光度的差异在405海里。数据显示为平均值±标准偏差(SD)一式三份的实验。

2.5。ELISA

测量肿瘤坏死因子-α和il - 4浓度的培养基,所有样本离心机(17000×g, 10分钟)在4°C和存储−80°C到分析。肿瘤坏死因子-α和il - 4浓度测定用ELISA试剂盒根据制造商的指示。数据显示为一式三份的平均±SD实验。

2.6。环境影响评价

确定铂族元素₂,PGD₂,LTB₄和LTC₄浓度的培养基,所有样本离心机(17000 g×10分钟)在4°C,和上层清液储存在−80°C到分析。的铂族元素₂,PGD₂,LTB₄和LTC₄浓度测量与环评工具根据制造商的指示。数据显示为一式三份的平均±SD实验。

2.7。免疫印迹分析

RBL-2H3细胞被播种到6-well板(5×10⁵细胞在DMEM /)和10%的边后卫在一夜之间37°C。这些细胞被洗和孵化DNP-IgE (10μg / mL) 24 h。我的细胞培养(0−100μ米)1 h和刺激DNP-BSA (100 ng / mL) 4 h。收获细胞细胞溶解,目标蛋白质resuspended在裂解缓冲。细胞溶解产物是由钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。膜被孵化1:1000稀释的抗体phospho-Lyn,林恩,phospho-Syk,麦克米兰,phospho-ERK1/2, ERK1/2, phospho-p38, p38, phospho-JNK, phospho-cPLA物₂,cPLA₂、cox - 2和β肌动蛋白和抗体phospho-5-LO 5-LO。这些墨迹洗了TBS-T和孵化1:5000稀释辣根peroxidase-conjugated免疫球蛋白二次抗体。膜上的蛋白被发现使用化学发光反应,和膜暴露在Hyperfilm发射极耦合逻辑。目标蛋白质浓度相比,控制浓度,每个蛋白质,结果被表示为基于蛋白质的密度比标准尺寸标记。每个乐队的密度是决定使用ImageJ软件。

2.8。统计分析

结果表示为平均值±标准偏差(SD)和正态分布的平均值之间的差别进行评估的数据单向方差分析(方差分析)其次是邓肯的测试为多个比较。0.05或0.01的值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。抑制作用的我ige RBL-2H3细胞过敏反应

确定最优的浓度我我们的研究中,我们评估了我和抗原的细胞毒性(DNP-BSA) cotreatment。跟我我们对待RBL-2H3肥大细胞浓度范围从1到100μ在随后的实验。的IgE-sensitized RBL-2H3细胞暴露在不同浓度(0−100μ米)1 h和刺激100 ng / mL DNP-BSA 4 hβ己糖胺酶试验。我明显抑制释放β己糖胺酶(图1(一)),这是一个普遍的生物标志物的脱粒和过敏反应的特点确定一个由过敏原引起的。此外,肿瘤坏死因子的释放α两促炎细胞因子,il - 4从RBL-2H3细胞被我明显抑制剂量依赖性的方式(数字1 (b)和1 (c))。我治疗(0−100μ米)24 h产生(图没有明显的细胞毒性的影响1 (d))。

3.2。抑制我对促炎的形成脂质介质的影响

我们下一个检查我的铂族元素形成的影响₂,PGD₂,LTB₄和LTC₄促炎的脂质介质调节过敏反应(20.- - - - - -23通过花生四烯酸信号下游的ige Fc)产生ε国际扶轮激活(24]。RBL-2H3细胞preincubated与我(0 - 100μ米)抗原之前挑战,铂族元素的形成₂,PGD₂,LTB₄和LTC₄是通过环境影响评价分析来衡量的。如图2,我明显抑制铂族元素的形成₂,PGD₂和LTC₄和抑制LTB₄在较小程度上形成。总的来说,这些结果表明,我抑制过敏性炎症引起的铂族元素₂,PGD₂,LTB₄和LTC₄。这表明我直接抑制一种酶参与前列腺素和白三烯生物合成。

3.3。监管的影响我与花生四烯酸相关酶级联

另外我们调查的抗过敏药影响我的激活花生四烯酸酶的级联。花生四烯酸级联激活与Fcε国际扶轮在IgE-activated受体激活肥大细胞(22]。因此,我们假设我显示,抗过敏药的影响,会影响cPLA₂、5-LO或cox - 2激活(图3)。当IgE-sensitized RBL-2H3细胞暴露在我之前在不同浓度1 h抗原刺激,cPLA磷酸化₂花生四烯酸级联的病原反应步骤,减少了。同样,我压制5-LO磷酸化,白三烯生物合成的病原反应步骤,抑制cox - 2表达,催化前列腺素生物合成的病原反应步骤。这些发现表明,我降低了激活的几个目标,包括cPLA₂、5-LO和cox - 2,表明我的抗过敏药作用可能由抑制花生四烯酸级联。

3.4。抑制我对俱乐部的影响ε国际扶轮信号通路

接下来,我们调查了我的抗过敏药的作用机制。激活的足球俱乐部εRI受体诱发林恩,麦克米兰磷酸化调节对肥大细胞脱粒[22]。在这方面,我可能影响林恩或麦克米兰磷酸化Fc的早期阶段ε国际扶轮受体级联。当RBL-2H3细胞被preincubated跟我之前的1 h抗原的挑战,和孵化延长额外的10分钟,麦克米兰的磷酸化,但不是林恩,是剂量依赖性地抑制(图4)。值得注意的是,我明显下降的表达式和磷酸化ERK1/2(图5(一个))。因此,我可以降低ERK1/2函数通过直接抑制ERK1/2表达式。此外,MAP激酶的磷酸化,比如p38或物,也抑制了我,虽然p38磷酸化对我来说是更敏感(数字5 (b)和5 (c))。

4所示。讨论

的精油Asiasari基数有许多有益健康的影响,表现出抗炎,抗菌,antiallergy属性,以及影响呼吸系统和循环系统(25]。Asiasari基数精油含有相当数量的化学成分,包括我,asarylketone,桉油酚、黄樟油精,柠檬烯,eucarvone [26]。据报道,在此之前,我对炎症产生有益的影响,缺血,过敏反应,伤害感受。我们目前的数据表明,我发挥抗过敏药效果IgE-activated RBL-2H3细胞。我明显抑制antigen-sensitized肥大细胞脱粒和促炎细胞因子释放。一些细胞因子过敏性炎症中扮演关键的角色。例如,TNF -α从IgE-activated肥大细胞分泌,在过敏反应中起着重要作用[27]。因此,我在TNF -的抑制作用α可能表明其形成优势作为antiallergy代理。在过敏性疾病的发病机理,il - 4是至关重要的IgE合成的诱导和肥大细胞发展(28]。il - 4也调节炎症反应,由于它能够影响内皮细胞粘附分子表达和细胞因子的生产和促进经济增长和激活的中性粒细胞,肥大细胞、T细胞和嗜酸性粒细胞(29日]。这些结果表明,我明显抑制肥大细胞脱颗粒,释放促炎细胞因子。

的一种可能机制ME-induced抗过敏药活动可能对俱乐部的影响ε国际扶轮信号级联。IgE-induced在肥大细胞脱粒与Fc的激活有关εRI受体,激活引发各种炎症介质的释放,包括TNF -α林恩的前列腺素,白细胞三烯,通过磷酸化/麦克米兰途径[23]。反过来,麦克米兰的激活增加细胞内钙^{2 +}和激活的MAP激酶家族23]。因此,林恩和麦克米兰是重要的细胞内介质在早期信号Fcε国际扶轮受体激活。在目前的研究中,麦克米兰显著抑制了我,支持这一概念,它是我的主要目标。支持这一观点,我显著降低ERK1/2的磷酸化,p38,下游效应器的Fc和物εRI (23]。

在目前的研究中,100年μ我明显抑制cPLA₂5-LO磷酸化和5-LO产品的形成,减少LTB₄和LTC₄。这种效应可能改善我的antiallergy行动,因为LTB₄是一个强有力的化学引诱物和激活的中性粒细胞和其他免疫细胞在严重哮喘30.,31日]。LTC₄是一种有效的spasmogenic剂和cysteinyl-LT受体的激动剂,来诱发过敏性疾病(慢性炎性反应21]。此外,我还抑制cox - 2表达,极大地降低了铂族元素的cox - 2产品的水平₂和PGD₂在激活免疫细胞,增强,包括肥大细胞(20.,32]。我在铂族元素的抑制效应₂形成可能导致其抗过敏药活动增加,铂族元素₂可能调解哮喘发展和炎症与il - 4和IL-5相关,这是由辅助T细胞(32]。此外,我PGD的抑制作用₂形成可以添加抗过敏药行动,PGD₂众所周知,引起支气管收缩和血管扩张,增加毛细血管通透性和粘液生产在哮喘20.]。总的来说,这些发现表明,我可以通过抑制cPLA减少过敏反应₂并通过抑制cox - 2活性5-LO激活和。综上所述,我可以抑制过敏反应通过抑制麦克米兰的激活,ERK1/2, p38和物,减少酶的活动负责PGD的生物合成₂和LTB₄。进一步,这些影响可能会扩展到其他细胞或组织抗炎作用。此外,TNF的表达α与p38、物和Fc ERK1/2激活吗ε国际扶轮受体级联IgE-activated肥大细胞(23]。因此,降低TNF -α形成了我可能会提供一个额外的优势作为一个抗过敏药的代理。

总之,目前的研究表明我有抗过敏药效果IgE-activated RBL-2H3细胞。负责其抗过敏药影响的机制可能涉及多个目标包括天空、ERK1/2, p38, cPLA物₂、5-LO和cox - 2。这种影响可能提供更多的信息我作为抗过敏药剂的应用。因此,我们未来的研究将集中在提供额外的药理的证据来证明这种可能性。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究得到了广东省科学技术发展基金会(批准号2012 a032400002),广东省医学科学研究基金会(B2013074),中国国家自然科学基金(批准号81202431),广东省自然科学基金(批准号S2012010009576)。