文摘
滑膜成纤维细胞有助于炎症致病性刺激下颞下颌关节。滑膜成纤维细胞和T细胞参与共同延续关节炎症激活反馈,通过分泌细胞因子和趋化因子,刺激对方。IL-17是一个主要由Th17细胞产生炎性细胞因子在发病机制中扮演重要角色的许多自身免疫和炎症性疾病。在这里,我们调查的角色IL-17A在颞下颌关节紊乱(TMD)使用全基因组分析TMD患者的滑膜成纤维细胞分离。IL-17受体在滑膜成纤维细胞表达评估使用实时PCR。微阵列分析表明IL-17A治疗滑膜成纤维细胞调节的il - 6和趋化因子的表达。实时PCR分析表明,il - 6基因表达,处于受控,引发,CCL20明显高于在IL-17A-treated滑膜成纤维细胞相比,参与控制。il - 6蛋白的生产增加了IL-17A以时间和剂量依赖性的方式。此外,IL-17A模拟滑膜成纤维细胞il - 6蛋白生产样品分离出三个病人。此外,信号抑制实验表明,IL-17-mediated诱导il - 6是NF的转导通过激活κB和磷脂酰肌醇3-kinase / Akt。这些结果表明,IL-17A与TMD的炎症过程。
1。介绍
颞下颌关节(颞下颌关节)是一种最复杂和主动关节人体中,扮演着重要的角色在下颌运动等功能来说,咀嚼和吞咽。颞下颌紊乱(TMD)患者最常表现为疼痛,有限的下颌运动,和颞下颌关节的声音。炎症因素导致炎症和降解途径与关节病理条件的恶化(1- - - - - -3]。这些炎症因素已发现在患者滑液的液体和/或组织intracapsular病理条件等颞下颌关节盘位移(DD),内部错乱(ID),和/或骨关节炎(OA) [1,2]。
滑膜炎、滑膜的炎症疾病,常伴随ID和/或OA在颞下颌关节4,5并被建议的一个关键特性intracapsular颞下颌关节(病理条件6]。滑液膜线的所有关节内的结构,除了卓越的关节软骨,窝和下颌髁关节盘(7]。滑膜衬里层的组织由纤维母细胞和macrophage-like细胞和滑膜亚系的覆盖疏松结缔组织,含有血管亚系成纤维细胞和白细胞。在骨科,滑膜成纤维细胞产生一系列假定的炎症介质和组织退化(8- - - - - -10)和其他免疫细胞相互沟通在一个独特的炎性微环境(9]。背后的分子机制的理解这些因素的活动可能导致TMD的发病机制的理解;然而,很少有人知道背后的分子机制的发展在颞下颌关节病理条件。
分泌白介素- 17 (IL)是主要由活性Th17细胞,和IL-17s IL-17受体发挥着重要的作用在许多自身免疫和炎性疾病11,12]。IL-17家庭由六个家庭成员不同的同源性和功能:IL-17A(通常称为IL-17), IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E(也称为IL-25),和IL-17F13,14]。IL-17受体(IL-17R)家庭包括五名成员(IL-17RA IL-17RE) (13,14];IL-17A和IL-17F绑定到同一个IL-17受体受体亚基组成的复杂IL-17RA和IL-17RC13,14]。IL-17一直与关节炎的进展在类风湿性关节炎(RA)和办公自动化。IL-17血清和膝关节滑液样本中检测到OA和RA患者,发现和积极的协会IL-17浓度与疾病严重程度和/或活动(15,16]。用人类细胞体外实验确定IL-17A因素促进滑膜增生,synoviocyte入侵,软骨退化,以及血管生成(17- - - - - -20.]。IL-17A在类风湿性关节炎的致病潜力也被报道涉及中和IL-17A和IL-17A-deficient小鼠的研究21]。
最近,IL-17从颞下颌关节滑液中发现ID和OA (22];然而在TMD的作用尚未研究。我们孤立的人类患者滑膜组织的滑膜成纤维细胞intracapsular颞下颌关节病理条件,然后研究了这些细胞的基因表达谱,当IL-17A对待。本研究的目的是调查的角色IL-17A TMD的发病机制。
2。材料和方法
2.1。隔离和滑膜成纤维细胞的文化
人体滑膜组织获得(TMJ1-3)从三个病人接受了ID或开放的颞下颌关节关节镜手术治疗OA (TMJ1,女,年龄:23年,用于寡核苷酸微阵列分析、实时PCR和ELISA。TMJ2,女,年龄:26年,用于ELISA。TMJ3,男,59岁,用于ELISA)。所有的病人提供手术知情同意和使用他们的组织标本为研究目的。孤立的、主要的文化和实验synoviocytes根据建立的指导方针进行的日本大学牙科学院的机构审查委员会松户(伦理委员会注册号:ec10 - 037)。
人体滑膜成纤维细胞分离的滑膜组织intracapsular患者颞下颌关节(滑膜成纤维细胞)的病理条件准备使用之前Ogura报道结果的方法等。23]。总之,滑膜组织样本用磷酸盐(PBS)洗净,剁碎,放在一个35毫米组织培养皿,并覆盖着消毒玻璃盖玻片。所使用的培养基是火腿的F12 (Wako,大阪,日本)补充10%胎牛血清(的边后卫)(细胞培养技术、Gravesano、瑞士),100年μg / mL青霉素g(明治、东京、日本),100年μg / mL硫酸卡那霉素(明治)和250 ng / mL二性霉素b(美国纽约Gibco,大岛)。媒介改变了每周两次。汇合的证监会分离与0.025%胰蛋白酶(Gibco)和0.02% EDTA在PBS和被亚文化在火腿的F12补充10%的边后卫和抗生素。的实验中,读者从通道获得6到8。
2.2。总RNA提取
Confluent-stage滑膜成纤维细胞培养介质中含2%的边后卫了24小时,然后被刺激有或没有10 ng / mL IL-17A (PeproTech Inc .,落基山,新泽西,美国)为各种长度的时间。从滑膜成纤维细胞细胞总RNA提取使用RNeasy迷你包(美国试剂盒,瓦伦西亚,CA),然后储存在−80°C到使用。
2.3。DNA微阵列分析
滑膜成纤维细胞总RNA样本处理IL-17A (10 ng / mL) 4 h和从未经处理的控制样本异形SurePrint G3 8 x60k v2人类基因表达微阵列(安捷伦科技公司,圣克拉拉、钙、美国),根据安捷伦协议。数组是使用一个安捷伦DNA微阵列扫描仪扫描。DNA微阵列的基因表达分析使用GeneSpring GX执行软件(安捷伦)。从每个数组数据规范化使用原始数据作为参考。基因表达的改变比较的归一化强度测定未经处理的细胞与IL-17A-treated细胞。微阵列数据存入国家生物技术信息中心基因表达综合(GEO系列GSE74668;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。
2.4。信号通路分析
生物相关通路IL-17A-responsive基因构造使用创新路径分析(IPA)(智慧系统,http://www.ingenuity.com/美国雷德伍德城,CA)。基因表达数据集的基因加入数字和比例(IL-17A-treated /控制)大于2倍的强度由GeneSpring GX软件程序上传到出来。每个基因标识符映射到相应的聪明才智通路中的基因对象的知识库。上传的基因,称为集中基因,分子网络由信息被覆盖到全球智慧路径中包含的知识库。异丙醇的分析确定关系、机制、功能,和通路相关的数据集。
2.5。实时聚合酶链反应(实时PCR)
使用GeneAmp互补DNA合成的总RNA RNA PCR试剂盒(热费希尔科学Inc .)、沃尔瑟姆,妈,美国)。实时PCR进行使用发电机SYBR绿色qPCR工具包(热费希尔科学Inc .)。PCR混合物(20μL)包含20 pmol正向和反向引物和2μL的互补。放大了使用DNA引擎内髓1 (Bio-Rad、大力神、钙、美国),在95°C与预热10分钟,其次是40 94°C的周期15年代,30年代55°C, 72°C 30年代。基因分析研究了它们的相对表达各自的控制使用方法(24]。所有五个复制分析,结果证实了五个独立的实验。
PCR碎片在1.5%琼脂糖凝胶电泳,其次是与美岛绿绿染色直接(日本遗传学、东京、日本)和片段大小的考试。使用的引物序列实时PCR分析如表所示1。
2.6。酶联免疫吸附测定(ELISA)
滑膜成纤维细胞板的密度细胞每在24-well板块与火腿的F12培养基含有10%的边后卫。融合性的细胞培养24 h在同一介质含有2%的边后卫。与IL-17A孵化后的适当的时间长度,文化上层清液被收集并存储在−80°C到使用。il - 6蛋白的动力学控制样品和生产检查与IL-17A滑膜成纤维细胞孵化(10 ng / mL) 4、8、12、24小时。检查剂量依赖性的il - 6蛋白的表达,细胞治疗与IL-17A浓度的10,50 ng / mL 24 h。条件培养基中的il - 6水平测量使用酶联免疫试剂盒(美国研发系统,麦金利,MN),根据制造商的协议。ELISA实验独立完成六次。
2.7。伊拉克的1/4,抑制PI3K、TAK1 IKKβ
滑膜成纤维细胞被镀的密度5×104细胞每在24-well板块与火腿的F12培养基含有10%的边后卫。融合性的细胞培养24 h介质中含2%的边后卫。使用下面的抑制剂的抑制实验:Interleukin-1 Receptor-Associated-Kinase-1/4 (IRAK-1/4)抑制剂(20μ米)(默克公司,达姆施塔特,德国),磷酸肌醇的3-kinase (PI3K)抑制剂LY294002 (20μ米)(默克公司)、转化生长因子-β活化激酶1 (TAK1)抑制剂(5 z) 7-oxozeaenol (1μ米)(默克公司),和NF的抑制剂κB激酶β亚基(IKKβ)抑制剂ps - 1145 (10μL)(开曼化学,安阿伯市,美国)。抑制剂的细胞进行预处理试剂为30分钟,其次是孵化IL-17 (10 ng / mL)。8 h后,文化上层清液被收集并存储在−80°C到使用。抑制剂的效果计算100−[(il - 6生产与IL-17抑制剂的存在)/ (il - 6生产IL-17)×100]。条件培养基中的il - 6水平测量使用酶联免疫试剂盒(研发系统)。
2.8。统计分析
数据表示为意味着±标准差(SD)和分析了使用单向方差分析(方差分析)。事后分析进行了使用Student-Newman-Keuls (SNK)多重比较检验。和被认为是显示显著差异。
3所示。结果
3.1。表达IL-17滑膜成纤维细胞受体家族成员
之前检查的功能影响IL-17A(作为一个典型的IL-17)滑膜成纤维细胞,我们首先分析了表达IL-17R家人a e在使用实时PCR滑膜成纤维细胞。所有IL-17R家庭成员在滑膜成纤维细胞(图表示1)。IL-17A信号通过heterodimeric受体组成的复杂IL-17RA和IL-17RC14]。因此这些数据表明IL-17A信号并在滑膜成纤维细胞。
3.2。微阵列分析滑膜成纤维细胞
接下来我们分析了滑膜成纤维细胞的基因表达谱,有或没有治疗IL-17A确定机制在病理条件下的颞下颌关节的影响。50739个基因的DNA微阵列,27583个基因是滑膜成纤维细胞中表达,这些基因的表达参与控制细胞和IL-17A-treated细胞之间的比较。基因显示大于双重IL-17A-treated之间的表达差异和控制细胞进行了进一步的分析。总共1710个基因显示大于2倍的变化表达IL-17治疗;389个这样的基因调节的表情,和1321个基因的表达下调(图2)。1710年IL-17-responsive基因分类基于基因本体的分子功能使用GeneSpring软件。许多调节基因分类功能的配体受体如趋化因子、生长因子、细胞因子与炎症和免疫相关监管机构。相比之下,一些表达下调的基因被归类为受体配体(表2)。
3.3。IL-17A信号通路分析
调查存在的生物相关通路IL-17A-responsive滑膜成纤维细胞的基因,我们上传数据集IL-17A-responsive基因包含基因标识符和相应的褶皱变化值通过DNA微阵列分析到音标系统关注的基因。1710年IL-17A-responsive基因分类基于基因本体论(数据没有显示)。最高度相关的类别由疾病和紊乱是炎症反应,其次是结缔组织疾病和免疫疾病。相关类别的分子功能是细胞生长和增殖,细胞细胞信号和互动,和细胞运动。
接下来,IL-17A-responsive基因排列在分子网络使用国际音标系统,与这些基因在规范化路径的图形表示。在图的插图3(一个)显示的规范化途径”角色的IL-17A关节炎”,这是关键分子在关节炎的炎症和破坏。节点显示为基因或基因产物;红色节点显示IL-17A基因调节的滑膜成纤维细胞的微阵列分析数据。无数的趋化因子的表达被IL-17A调节治疗;相比之下,IL-17RA和IL-17RC既定的表达及其在滑膜成纤维细胞表达并没有改变以应对IL-17A。IL-17A调节基因如il - 6和趋化因子NF监管κ尽管NF的表达κB不响应IL-17A(图复杂分子3 (b))。
(一)
(b)
3.4。时间的IL-17A-Induced滑膜成纤维细胞的基因表达
使用微阵列信号通路分析数据表明,趋化因子的表达和il - 6在滑膜成纤维细胞调节IL-17A治疗4 h。我们下分析了IL-17A感应的时间进程因此滑膜成纤维细胞的这些基因的表达。表达进行了分析使用实时PCR的滑膜成纤维细胞有或没有IL-17A孵化后2、4、8、12或24小时。基因表达的il - 6、处于受控和引发(也称为CXCL8)明显高于在滑膜成纤维细胞治疗IL-17A 4 h 24 h相比,参与控制(数字4(一),4 (c),4 (d))。CCL20显著调节基因表达的滑膜成纤维细胞通过IL-17A治疗8 - 24小时(图4 (b))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.5。IL-17A效应在滑膜成纤维细胞il - 6蛋白的生产
il - 6是其中一个最著名的促炎细胞因子参与各种自身免疫性和慢性炎症性疾病的发病机理。大量的炎性疾病的特点是生产过剩的il - 6的分泌。因此,IL-17A-responsive中我们选择了il - 6基因检查IL-17A蛋白质生产的影响。滑膜成纤维细胞与浓度的孵化IL-17A 1, 10日和24小时50 ng / mL。IL-17A增加滑膜成纤维细胞的il - 6水平的媒体在剂量依赖性的方式,虽然没有显著区别细胞1 ng / mL IL-17A处理和未经处理的控制(图5)。我们还研究了在滑膜成纤维细胞il - 6蛋白生产的孵化有或没有10 ng / mL IL-17A 4、8、12或24小时。条件的il - 6水平媒体增加了IL-17A时间的方式在整个24小时周期(图6)。
在接下来的实验中,IL-17A的影响在三个滑膜成纤维细胞il - 6蛋白的生产样品分离出三种不同的患者检查。il - 6蛋白水平显著增加细胞的条件媒体处理10 ng / mL IL-17A 24 h比未经处理的控制细胞在所有三个样本,虽然增加的水平不同个体三个样品(图7)。
3.6。信号传导抑制剂对IL-17A-Induced il - 6的影响生产滑膜成纤维细胞
网络IPA和几个以前的报告表明IL-17A引起的细胞因子表达是通过NF介导的κb .因此,我们调查了NF的抑制剂的影响κB信号通路IL-17A-induced通过滑膜成纤维细胞il - 6生产。il - 6的感应IL-17A是减少滑膜成纤维细胞通过预处理LY294002 (PI3K抑制剂)、z (5) 7-oxozeaenol (TAK1抑制剂)和ps - 1145(一个IKKβ抑制剂);相比之下,生产没有受到一个IRAK-1/4抑制剂(图的影响8)。il - 6生产被LY294002抑制35.0%,由(5 z) 7-oxozeaenol 95.7%, 21.2% ps - 1145(图8)。
4所示。讨论
当前的研究表明,IL-17A起着重要的作用作为一种促炎细胞因子在自身免疫性疾病和慢性炎性疾病,如风湿性关节炎。阐明的角色IL-17A TMD的炎症过程,我们从TMD患者和孤立的滑膜成纤维细胞的基因表达谱研究滑膜成纤维细胞IL-17A对待。这些基因表达谱进行分析之前我们首先检查了这些细胞的转导能力IL-17信号确认IL-17Rs在滑膜成纤维细胞的表达;所有的IL-17受体是滑膜成纤维细胞中表达。在最近的研究中,一个多态性IL-17RC报道与观察到的不同的剪接变体有关在几个细胞类型(25,26]。在这项研究中,IL-17RC PCR产品可视化为两个乐队通过琼脂糖凝胶电泳;因此可能存在两个以上不同的剪接变体IL-17RC滑膜成纤维细胞。
使用高通量DNA微阵列,共有1710个基因显示大于双重的表达强度差异参与控制和IL-17A-treated滑膜成纤维细胞。我们也调查了生物功能和这些IL-17A-responsive基因使用信号通路的分子相互作用分析。许多反应的基因可以与炎症反应和免疫相关疾病。“IL-17A调节多种趋化因子的表达总科成员参与调控白细胞聚集和激活的炎症组织。在这项研究中,我们审查的动力学表达式处于受控,引发,CCL20使用实时PCR。处于受控的基因表达(也称为Gro -α),引发(也称为CXCL8),这是众所周知的趋化因子,被IL-17A高度调节。另一方面,据报道,CCL20(也称为MIP-3α)函数作为生产IL-17 Th17细胞化学引诱物(27]。IL-17A-induced表达式处于受控、引发和CCL20滑膜成纤维细胞是维持24小时。据报道,IL-17A是其作用的一个关键属性编排炎症细胞的迁移,在RA发病机理(一个中心位置28]。自从发现炎症细胞在滑膜组织和流体从TMD患者29日,30.],IL-17A等诱导炎症可能会因此有一个角色在TMD的白细胞的吸引力。此外,Th17细胞的迁移引起CCL20滑膜成纤维细胞产生的,可能会导致增加IL-17A水平在TMD的滑膜组织。
的mRNA表达il - 6在滑膜成纤维细胞也调节IL-17A,及其在IL-17A蛋白质产量增加时间和剂量依赖性的方式。IL-17A也刺激了il - 6蛋白的生产在所有三个孤立的滑膜成纤维细胞样本三个病人。il - 6在炎症和组织破坏一个重要的角色在关节疾病,如风湿性关节炎(31日),其关节炎患者滑膜液的浓度升高(32,33]。il - 6展示了一个重要的角色在inflammation-evoked破骨细胞形成和骨侵蚀(34]。最近表明,il - 6可促进Th17细胞分化的效应CD4 + T细胞(子集35]。这个函数的il - 6是通过在类风湿性关节炎的发展发挥重要作用[36]。在TMD, il - 6水平也增加了ID和/或OA患者滑液从[22,37]。il - 6在滑膜成纤维细胞的过度生产IL-17A因此似乎与TMD相关异常有关。
信号通路分析还表明,趋化因子和il - 6的表达被NF刺激κb . IL-17A IL-17RA heterodimeric受体信号在复杂和IL-17RC [14),导致激活NFκB在几个细胞类型(38,39]。人们普遍认为,IL-17 signalingshares下游转录因子il - 1β和肿瘤坏死因子-α(40]。先前的研究已经报道,IL-17似乎发挥与il - 1添加剂和协同效应β和肿瘤坏死因子-α的诱导il - 6在RA滑膜41]。我们怀疑大多数基因调节的IL-17A可能类似于那些由il - 1调节β和肿瘤坏死因子-α。我们之前已经调查了颞下颌关节滑膜成纤维细胞的基因表达谱与il - 1治疗β和/或TNF -α(42,43]。调查IL-17A-mediated NFκ激活,我们检查了NF的抑制剂的影响κB信号在滑膜成纤维细胞il - 6生产IL-17A对待。我们发现IL-17A-induced il - 6生产被LY294002 (PI3K抑制剂)、z (5) 7-oxozeaenol (TAK1抑制剂)和ps - 1145(一个IKKβ抑制剂),但并没有受到IRAK-1/4抑制剂的影响。因此IL-17A信号转导可能分享TAK1及其下游信号导致NFκ与il - 1 B激活β信号转导。此外,PI3K / Akt信号,参与TNF -α端依赖NFκB激活(44),也与IL-17A-induced通过滑膜成纤维细胞il - 6生产。然而,抑制il - 6生产由TAK1抑制剂是强于IKKβ抑制剂。据报道,TAK1信号是由其他几个信号转导途径,如MAPK信号通路,除了NFκB激活(45]。此外,PI3K / Akt促进生存通过抑制p53和贝克/ Bax-mediated凋亡和触发AP1激活(46]。因此我们建议IL-17A激活NF之外的几个信号通路κB激活途径对il - 6在滑膜成纤维细胞(图生产9)。
在这项研究中,我们的研究结果表明,IL-17A upregulation il - 6的表达和趋化因子介导的NFκB通路中重要的促进白细胞吸引力和TMD的滑膜组织(图的入侵10)。我们建议这个IL-17A级联可能有助于促进和提高TMD的炎症状况。
5。结论
所有IL-17受体表达在颞下颌关节的滑膜成纤维细胞。IL-17A诱发的mRNA表达趋化因子,il - 6,以及il - 6蛋白生产的滑膜成纤维细胞。IL-17A似乎转导信号通过激活NF il - 6生产κB和PI3K / Akt通路。我们的数据提供了洞察IL-17A参与激活的细胞机制的滑膜成纤维细胞发炎颞下颌关节。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
承认
本研究支持的科研补助金(c)(22592230和22592230)日本促进社会科学。