文摘
Paracoccidioidomycosis (PCM)是一个系统性真菌感染,在巴西流行,甚至导致严重的发病率和死亡率如果没有正确的治疗。患者可能对PCM的反应不同取决于获得性免疫反应的模式发展。保护性免疫反应的发病明显由中性粒细胞(中性粒细胞)发挥重要作用通过直接杀死真菌,也与其他细胞类型交互调整收购可能遵循的保护性免疫反应。,本研究旨在展示和比较不同实验模型的PCM(腹腔和皮下)关于生产和成熟股骨髓内中性粒细胞和中性粒细胞浸润在小鼠腹腔和皮下渗出液的抗性和敏感。我们也评估了真菌菌落和可溶性炎症介质的水平(LTB4 KC, IFN -γ、gm - csf和il - 10)在皮下air-pouches比较中性粒细胞出席这个网站的效率的两个主要中性粒细胞功能:初始裂解入侵的病原体和调制的获得性免疫反应。p .取代巴西橡胶树接种腹腔内能够传播易感小鼠的骨髓,导致更显著改变生产和成熟中性粒细胞比抗小鼠感染后观察到同样的路线。皮下air-pouch接种p .取代巴西橡胶树引起了控制和有限的感染,产生了PMN-rich渗出物,从而有利于研究真菌之间的交互和中性粒细胞。易感染的小鼠产生更高的中性粒细胞的数量;然而,这些细胞更有效地杀死真菌。炎性细胞因子在抗小鼠更为明显,支持他们的PCM阻力。
1。介绍
Paracoccidioidomycosis (PCM),其他几个真菌感染,一个重要的和被忽视的系统性条件可以很容易地发现在拉丁美洲,特别是在巴西1]。PCM导致肺、粘膜和皮肤的参与,甚至可能包括急性和慢性的疾病(2,3]。实际上,主急性PCM感染后转换为慢性阶段,其严重性本质上取决于宿主的免疫反应(4]。
缺陷在免疫细胞的激活和免疫抑制导致更高的易感性PCM (5,6]。因此,一些炎性细胞和异常的中性粒细胞(中性粒细胞)是至关重要的建立主机对PCM的真菌剂的反应Paracoccidioides取代巴西橡胶树(Pb)(7];这种反应包括抗菌因子的释放和生产、细胞因子,趋化因子,血清抗体,等等2,8]。
,中性粒细胞先天免疫应答的主要成分,但也可以触发和调节适应慢性反应时作用于T细胞(9),树突细胞(10),和B淋巴细胞(11]。然后值得一提的寻求这种煽动性的行为通过实验模型,可以模拟之间的交互Pb和免疫细胞。
因此,我们试图研究不同型号的Pb在两个不同的小鼠接种菌株(A / J和B10.A)已知耐药或容易PCM繁殖,分别轻微和严重的临床疾病的形式12]。其他行为的差异,抗小鼠(J / Sn和一个/株)显示低引起真菌传播和低死亡率,以及一些病变由活跃的紧凑和封装肉芽肿与特征表明疾病的有效控制。这些老鼠还显示高激活吞噬细胞,合成低水平的具体反Pb抗体,优先生产IgG2a和IgG3同形像,并保留延迟型超敏反应(DHT)和淋巴组织反应和优先生产细胞因子,构成实验paracoccidioidomycosis hyperergic杆。另一方面,易感小鼠(B10。应变)提出了高真菌传播,导致高死亡率,大量的松散和播散性肉芽肿疾病的进展和无效的控制指示。低激活吞噬细胞的状态,高水平的特定抗体,抑制DTH,和淋巴组织反应和优惠细胞因子的生产模式也观察到,描述实验的无能极疾病(13]。
中性粒细胞的出现,以及真菌生长和细胞因子状况,评估并提供一种免疫学课程关于骨髓,外周血,并渗出物的组成部分Pb感染。
2。材料和方法
2.1。动物
同基因的雄性老鼠,耐药(A / J)或敏感(B.10A) PCM菌株(12),大约11周大,被保存在控制房间温度下12小时光/ 12小时黑暗周期和美联储无菌食品和蒸馏水随意。
2.1.1。Paracoccidioides取代巴西橡胶树
高毒性Paracoccidioides取代巴西橡胶树Pb18应变(14)是孤立和生长在半固体的蚕豆清爽的媒体(15];真菌培养基是每7天更换一次。Pb18细胞被洗了三次0.9%无菌生理盐水和离心机(美国纽约5810 r离心机,埃普多夫)3 x 1300 g。一个包含10个真菌悬挂106酵母细胞/毫升使用血细胞计数器测量。排除真菌细胞生存能力的至关重要的染料杰纳斯绿B (16)总是比为75%。
2.2。感染和接种的老鼠
B10。A和A / J小鼠感染通过腹腔内路线包含25×10的真菌悬挂6/毫升和皮下注射0.1毫升的50×106/毫升悬挂,先前接种后2毫升无菌空气,如1990年Harmsen和Havell所述17Meloni-Bruneri等人在1996年[]和修改18]。对照组与无菌接种相应PBS。
2.3。中性粒细胞隔离和量化
的动物麻醉致死剂量(0.5毫升的10%盐酸氯胺酮和甲苯噻嗪溶液2%)和中性粒细胞从腹膜后注入3毫升无菌PBS和进一步提取整个PBS /渗出物的解决方案;1毫升的这个解决方案是放在Suta沉降室,然后沾May-Grunwald-Giemsa-Rosenfeld幻灯片。微分计算进行了光学显微镜,其中粒细胞单核细胞区分开来。细胞被量化使用血细胞计数器和细胞生存能力评估为0.2%台盼蓝(σ)。关于皮下路线,中性粒细胞收集后15天内感染的老鼠。在动物麻醉致死剂量(0.5毫升的10%盐酸氯胺酮和甲苯噻嗪2%解决方案);细胞被收集并放置在无菌管的帮助下无菌玻璃巴斯德吸管后皮瓣程序。这些细胞被转移并存储在猎鹰管包含RPMI (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)10%胎牛血清(的边后卫,σ),冷藏(2 - 6°C),和量化使用血细胞计数器;细胞生存能力评估为0.2%台盼蓝(σ)。
2.4。识别的中性粒细胞数量
中性粒细胞分析骨髓(脊髓x光像)是识别不成熟的中性粒细胞(早幼粒细胞,中幼粒细胞和晚幼粒细胞)和成熟的中性粒细胞(中性粒细胞和分段中性粒细胞)据罪的标准和Saintemarie [19]。细胞识别和量化计算已经完成收集材料从6为每个模型小鼠p .取代巴西橡胶树从每个动物接种和计数500个细胞。
2.5。组织病理学评价腹腔内和Air-Pouch分泌物
安乐死之后,活检是受感染的组织和材料固定在甲醛10%和遵循常规组织学程序随后嵌入石蜡。组织学部分5μ得到了m和苏木精和伊红染色(他)或染色。
2.6。量化的可行的Pb通过集落形成单位
材料收集的无菌皮下air-pouches经过13天的感染和立即离心机在1780 g (5810 r离心机,埃普多夫,纽约,美国)。100年resuspended丸μL PBS和传播在培养皿上无菌Drigalski撒布机的援助。同样,在1780 g离心后,100年μL(中性粒细胞/Pb混合悬浮液获得共培养2小时后在培养皿中传播。实验进行了一式三份。真菌生长在盘子里被允许发生的12天,当画笔标记被用来凸显了殖民地。这个过程中使用的培养基是BHI琼脂(HiMedia实验室、印度)补充葡萄糖1%,30%生长因子混合产生的真菌本身,和10%的边后卫,所述Singer-Vermes等人于1992年(20.]。
2.7。评估Air-Pouches内可溶性介质浓度
已经描述,材料收集的无菌皮下air-pouches经过13天的感染和离心机。收集上清液,过滤使用0.22μ米孔隙大小的过滤器(美国微孔,贝德福德,MA),并立即存放在−70°C。这种材料后来被用来量化干扰素-的浓度γgm - csf、il - 10, LB4, KC使用捕获酶联免疫吸附试验(ELISA),下面推荐的程序制造商的协议,根据这项技术最初被Coligan et al ., 199121]。使用的抗体对买来Peprotech (Peprotech, Ciudad de墨西哥,墨西哥)干扰素-γ、il - 10和gm - csf的决心,RD (KC研发系统,明尼阿波利斯,美国)的决心,和开曼群岛(美国开曼化学,安阿伯市密歇根)LB4决心。每个细胞因子的浓度测定参照标准曲线的线性回归曲线获得使用两倍稀释的小鼠重组细胞因子。结果是三个不同的样本的平均结果,表示为皮克每毫升的上层清液收集air-pouch exsudate。
2.8。统计分析
执行一个方差分析测试,其次是学生的以及检查实验群体之间的差异显著性水平为5%。该软件用于分析GraphPad棱镜6 (GraphPad软件有限公司;,美国加利福尼亚州拉霍亚,92037)。
3所示。结果
3.1。中性人口在骨髓中
不成熟的中性粒细胞高数量的骨髓中发现了B10。抗敏感比/ J小鼠腹腔内注射后(图1(一))。关于成熟的中性粒细胞,我们观察到更多的细胞抗小鼠的腹腔内接种后90天Pb(图1 (b));耐药和易感动物之间没有显著差异被发现在其他时期(图进行了研究1 (b))。中性粒细胞骨髓细胞总数明显高于在易感动物经过120天的腹腔内感染(图1 (c))。
(一)
(b)
(c)
图2显示了相对成熟和人口总中性粒细胞感染小鼠的骨髓Pb通过腹腔内或皮下路线。统计上显著的结果与皮下air-pouch感染、耐药的老鼠提出更高的和成熟的中性总人口相比,腹腔内模型研究(图2)。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。外周血中性粒细胞数量
的动力学行为抗中性粒细胞在血液的总数和易感小鼠如图3(一个)成熟的中性粒细胞,清楚地表明,一个更大的人口存在血液中的易感小鼠腹腔接种。图3 (b)代表成熟中性粒细胞在血液的相对人口的敏感和耐药后15天老鼠接触Pb在腹腔内或皮下环境;没有统计上显著的结果。
(一)
(b)
3.3。中性粒细胞浸润在腹膜和皮下Air-Pouch渗出物
从图中提取4(一),没有统计上的显著差异腹膜浸润的中性粒细胞敏感和耐药的老鼠,这第七天以来渗透仍然很低,在所有随后的研究时期;然而,air-pouch渗出物air-pouches揭示了一个著名的成熟中性粒细胞数量为抗动物(图15天4 (b))。
(一)
(b)
3.4。骨髓的组织学外观
的存在Pb股骨骨髓的易感小鼠腹腔内感染是炫耀性和真菌细胞的形态保存下来,这表明这些细胞是可行的(图5(一个))。Neutropoiesis也明显在成熟的骨髓巨核细胞的存在易感小鼠腹腔内感染后(图5 (b))。正如所料,没有Pb被发现在抗小鼠的骨髓22]。
(一)
(b)
3.5。集落形成单位Pb和细胞因子在皮下Air-Pouches概要文件
可行的Pb被确定在皮下air-pouches经过13天的皮下感染;敏感和耐药之间的差异老鼠喜欢大量的真菌易感动物的皮下air-pouches内(图6(一))。gm - csf(图6 (b)),干扰素-γ(图6 (c)),和LTB4(图6 (d))水平显著增强抗小鼠相比的易感动物。il - 10水平(图6 (e))之间的类似鼠标菌株;和KC浓度在皮下air-pouches显示明显高于抗小鼠(图6 (f))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
4所示。讨论
这里包括两种途径Pb感染已经在文献中描述:腹腔内(23)和皮下(17,18]。其他三个路线也可以提到,静脉注射23],intraoral [24),和气管内的25),并不包括在目前的调查。然而,皮下air-pouch技术已被证明能提高几乎纯的中性粒细胞,也作为一个地方和控制Pb感染(18,26),是现在其他古典方法相比,在骨髓成熟中性粒细胞的最高数字,以及招募中性粒细胞在代替。腹腔内注射的Pb,另一方面,会导致一个exsudate组成的中性粒细胞(40 - 50%27]。
有趣的是,我们发现B10。易感动物产生了不成熟的中性粒细胞的人口比耐/ J小鼠,腹腔内接种后Pb。相应地,真菌导致更高的腹腔内注射生产的成熟中性粒细胞/ J。我们可以假设一个中性粒细胞组成的人口高度成熟的细胞更有效的抗真菌和抗做支持这样的老鼠的行为。
不过,易感动物显示更高的中性粒细胞总数内骨髓后腹腔内注射真菌;这强烈支撑,成熟细胞(更高的百分比/ J小鼠的骨髓)更有效和带来更好的抵抗一旦高度激活(18,28),即使在较小的数字。在七天的感染,有更高的不成熟的中性粒细胞数量的骨髓/ J(抗小鼠)比B10。(易感小鼠),在15天的感染,有更高的不成熟的中性粒细胞数量的骨髓B10。的老鼠比骨髓/ J小鼠腹腔内注射后(图1(一))。
但在后来感染的时候,我们经常观察到更高数量的不成熟的中性粒细胞的骨髓B10。的老鼠比骨髓/ J小鼠腹腔内注射。这个数据证实了早些时候数据中观察到的实验模型显示,易感小鼠应变激活一开始paracoccidioidomycotic感染比耐鼠标应变。耐霉菌病是由于一个高效的延迟型超敏反应(DTH)反应。
事实上,在感染的后期,抗小鼠显示持久的潜孔。在感染的发生,然而,易感小鼠存在一个强大的DTH反应,高于耐药的,但是这个反应是失去了整个感染,使这些动物容易paracoccidioidomycosis。先前发表的研究显示这些反应动力学29日]。因此,我们假设不成熟中性粒细胞的更高的生产易感小鼠初步恢复他们的中性粒细胞缺乏能力。实际上,我们可以在另一项研究表明,一个称职的中性粒细胞杀菌反应取决于这些细胞的激活水平而不是他们的数量26]。
换句话说,中性粒细胞的抗小鼠获得优越的成熟,从而可以更好地处理真菌感染。电阻依赖于免疫细胞的活性,某些个人反应更好或贫穷PCM取决于他们的免疫反应(2]。因此,经典假定PCM患者存在缺陷与中性粒细胞缺乏吞噬能力和破坏这种真菌30.- - - - - -33]。
另一方面,它可以被认为的后果之一Pb感染易感主题是正常中性粒细胞成熟的障碍,顺向相对无能处理Pb感染。因此,腹腔内接种的致命的隔离Pb导致真菌传播各种器官。可行的酵母细胞形式的存在已经检测到网膜,脾脏,肝脏和肺部的人数明显高于易感小鼠(22),这肯定是同意我们的发现,一旦我们可以确定形态完好无损Pb酵母细胞(形式)只有在易感动物的骨髓,而不是在这些耐药的。虽然我们以前描述的传播p .取代巴西橡胶树各种器官后腹腔内感染(22),在骨髓中真菌的存在直到现在才报道。同时,在另一项研究[13),我们描述了组织病理学以及肉芽肿病变的特点在这些器官。
现在,无论中性粒细胞成熟,皮下注射Pbneutropoiesis是最有效的方式获取明显。这皮下施加在1990年被Harmsen和Havell [17Meloni-Bruneri等人在1996年[]和修改18]。值得注意的是,我们的研究结果表明,可以利用皮下注射感染的研究炎症反应,尤其是中性粒细胞,Pb感染。我们不能确认这个路线真正模拟临床PCM;但实际上,没有研究实验模型可以代表PCM在它的全部。
我们看到的最高生产中性粒细胞与皮下模型(总和成熟)。然而,没有利益诱导成熟细胞的普遍生产如果这些细胞不能达到感染的网站。有趣的是,我们能看到皮下air-pouch路线也可以招募大量的中性粒细胞感染网站;不仅意味着一个优越的中性粒细胞的生产,但也是一个明显的这些细胞迁移到实际皮下囊。这里,我们还显示一个明显的成熟的中性粒细胞在外周血两种实验方法;腹腔内感染了耐高差异和易感小鼠中性粒细胞总数;较高的中性粒细胞数量表达在易感动物。
比较骨髓与外周血发现结果,我们得出这样的结论:有一个高级招募中性粒细胞细胞易感染的小鼠时,特别是在90天的腹腔内感染;易感动物可能受到刺激产生更高的不成熟的中性粒细胞数量迅速迁移和血液中可以找到。然而,这种成熟的腹腔内迁移细胞不喜欢老鼠的研究模型。此外,成熟的人口更富有表现力的渗出物/ J小鼠皮下注射,这再次证明了更高的生产在骨髓和血液中性粒细胞数越高负责PCM电阻如果这些细胞不能够到达的地方Pb感染。
所以,抗小鼠显然招募中性粒细胞air-pouches更“聪明”的方式,诱导高成熟中性粒细胞的数量保持在袋,从而对抗真菌。这是为什么我们能看到neutrophil-rich渗出物在皮下air-pouches远系瑞士动物抗小鼠(类似于26]。因此,我们倾向于使用PCM的皮下air-pouch模型实验研究炎症反应,尤其是急性反应,一旦air-pouches产生一个局部感染,由动物本身可以更好的管理(34]。
不过,唯一参与炎性细胞因子和中性粒细胞招募不足以完全根除Pb感染,这是证明持久存在的真菌接种的气泡后15天内(18]。然而,抗小鼠能够更好的处理感染,这是证明的数量显著降低Pb在他们air-pouches。尽管如此,细胞因子,有效激活中性粒细胞,gm - csf和干扰素等γ(35,36),目前在数量上升,在袋内,这些量被老鼠总是高的抵抗力。
gm - csf和干扰素-γ实际上是介质的例子可以增加中性粒细胞的真菌的活动通过一个机制,依靠ROS的产生如H2O2和超氧化物阴离子35,36];然后,我们的研究结果支持更高比例的成熟细胞之间的直接匹配和提高参与的gm - csf air-pouches内部。因此,LTB4,当然调节单核细胞的真菌的活动和接触时是高度由中性粒细胞Pb(37),也更/ J动物的存在。LTB4当然调节单核细胞的真菌的活动和接触时是高度由中性粒细胞Pb;最近的一项研究还显示LTB4的角色在促进巨噬细胞对真菌的活动Pb感染(38]。
KC,另一方面,是化学引诱物对小鼠中性粒细胞(39];中性粒细胞的浸润,肺的早期急性阶段Pb相关感染已经释放KC [39]。因此,在这项研究中,KC数较低的敏感组和高参与的平行抗炎细胞因子il - 10,后15天内炎症反应已经失去其急性身份。然而,尽管/ J小鼠il - 10参与相似,KC水平超过了il - 10内空气的口袋,又表现出较高的抗中性粒细胞的招聘集团,甚至经过15天的Pb接种。根据,il - 10负调节先天反应Pb相关,Th2反应(37,40]。
因此,air-pouches抗小鼠的细胞因子环境整体炎症模式,能够直接获得性免疫反应对一种有效的反应,以应对PCM的后阶段,与细胞因子的模式出现在exsudate air-pouches易感的老鼠。
5。结论
我们的研究结果支持使用皮下air-pouches为了研究对产生的炎症反应Pb一旦感染,会导致更高的生产和成熟中性粒细胞在骨髓,以及中性招聘网站的感染,以及简化控制免疫细胞的生成集合和局部感染。我们也强调主持人的重要性的总体免疫全景,在抗动物存在明显的炎症反应的敏感问题。凸显了这个有效抗中性粒细胞的成熟和迁移模式小鼠,它们存在于高浓度暴露于炎症,激活细胞因子在感染的网站而不是什么是观察老鼠的敏感。因此,从抗小鼠中性粒细胞能够有效地应对Pbair-pouch病变,以及直接即将获得对一个有效的免疫反应,主要是Th1保护模式。再次,中性粒细胞易感小鼠不直接处理能力Pb出席的感染和调节后天免疫的主要监管Th2模式。
伦理批准
本研究根据动物实验的伦理原则和所有动物程序进行符合巴西国家委员会的指导方针对动物实验的控制。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
作者要感谢卢西亚海伦娜梅洛尼Bruneri博士(为纪念),他负责获得几个重要的结果了。他们也要感谢FAPEMIG (Fundacao德帕罗尽管Estado de米纳斯吉拉斯)和斗篷(Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量优越,http://www.capes.gov.br/)。v . l . g . Calich和大肠汉堡接受慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府(CNPq,http://www.cnpq.br/生产力研究奖学金和a·c·s . c·门德斯是斗篷硕士奖学金的接受者。e .汉堡是一个接受者of Fundacao德帕罗尽管Estado de米纳斯吉拉斯(FAPEMIG,http://www.fapemig.br/),FAPEMIG cbb - ppm - 00119 - 14所示。