文摘

背景。先天免疫抗菌肽,其中包括β-defensin-1,促进一些免疫细胞的趋化和激活。的作用β-defensin-1在哮喘和慢性阻塞性肺疾病(COPD)仍不清楚。方法。诱导痰收集从健康控制和患有哮喘或慢性阻塞性肺病。β-defensin-1蛋白质痰上层清液由ELISA量化。潜在生物标志物检查使用接受者操作特性曲线。β-defensin-1释放主支气管上皮细胞(pBECs)在文化与调查,没有香烟烟雾提取物(CSE)。结果。气道β-defensin-1蛋白升高在慢性阻塞性肺病参与者相比,哮喘参与者和健康对照组。炎性表型没有影响β在哮喘或慢性阻塞性肺病-defensin-1水平。β-defensin-1蛋白质相比,严重哮喘的风险高和不受控制的哮喘控制。β-defensin-1蛋白质可以预测COPD的存在从健康对照组和哮喘病人。暴露的pBECs CSE下降β在健康对照组-defensin-1生产;然而在慢性阻塞性肺病pBECs参与者的水平β-defensin-1 remanied不变。结论。升高β-defensin-1蛋白是慢性阻塞性肺病的特征和严重哮喘不管炎性表型。β-defensin-1生产在COPD患者的上皮细胞特异表达,可能是一种有效的生物标志物和潜在的治疗目标。

1。介绍

哮喘和慢性阻塞性肺疾病(COPD)是慢性气道炎症性疾病,特点是气流限制妨碍在哮喘是可逆的,在目前的治疗下,进步,在慢性阻塞性肺病不完全可逆的。这些疾病的全球负担是相当大的1]。哮喘和慢性阻塞性肺病是公认的异构特性,特别是对炎症的类型呈现(2]。四个主要表型(嗜酸性、中性、paucigranulocytic和混合粒细胞)描述,特点是比例的中性粒细胞和嗜酸性粒细胞(2,3]。这些炎性表型与疾病严重程度的差异和对糖皮质激素的反应(4,5),但他们的潜在生物学仍知之甚少6,7]。

嗜酸性粒细胞、中性粒细胞的迁移和活动受到一系列的宿主因素的影响,包括一个类抗菌肽也称为alarmins。这些抗菌肽很小(< 100个氨基酸)蛋白质,它发挥着重要的作用在影响和调节免疫应答通过受体介导趋化和激活一系列先天和适应性免疫细胞(8]。Defensins和抗菌肽构成关键alarmin人类家庭(8]。的α- - -β人类defensins -defensins构成了两个主要的类,分类基于微分六个半胱氨酸组织主题(9]。β-defensin-1由所表达的观察呼吸道上皮细胞和广泛的抗菌和能够影响免疫反应(10]。

β-defensin-1多态性与哮喘有关(11,12)和慢性阻塞性肺病(13,14]。基因表达的增加β-defensin-1一直在观察支气管上皮和BAL流体细胞在慢性阻塞性肺病和消极与肺功能和气流限制(15]。β-defensin-1蛋白质,但尚未检查哮喘或慢性阻塞性肺病。本研究正是蛋白质的水平β-defensin-1诱导痰液样本与健康对照组相比,哮喘和慢性阻塞性肺病。我们调查的关系β-defensin-1炎性表型和疾病严重程度。理解异常的潜在来源β-defensin-1表达,我们也调查生产主支气管上皮细胞暴露于香烟烟雾提取物在文化。我们提出,在哮喘和慢性阻塞性肺病蛋白表达会更大,与疾病严重程度和炎性表型有关,在香烟烟雾暴露后上皮细胞改变。

2。方法

2.1。研究设计和痰液的分析

成人患者COPD和哮喘是从约翰亨特招募医院门诊诊所,新南威尔士、澳大利亚。参与者与慢性阻塞性肺病(和主支气管上皮细胞(pBEC)研究)诊断为慢性阻塞性肺病和postbronchodilator FEV₁/ FVC < 70%。参与者与哮喘()是诊断根据美国胸科学会指南基于当前(过去12个月)情景呼吸道症状,医生的诊断,并演示了对高渗盐水气道高反应的证据。健康对照组(和pBEC研究)是不吸烟者,FEV₁> 80%的预测,被广告招募。排除标准包括呼吸道感染、呼吸道疾病恶化或改变维持治疗在过去的一个月,和当前吸烟(除了pBEC COPD组的研究目前的吸烟并不排除标准)。所有的参与者给书面知情同意和猎人新英格兰地区卫生服务和纽卡斯尔大学的研究伦理委员会批准了这项研究。

肺量测定法(可可PD仪表,路易斯维尔,科罗拉多州,美国)和痰诱导高渗盐水(4.5%)执行与FEV参与者₁> 1.3 L和0.9%盐水FEV的参与者₁低于这个水平。协议指定一个固定的痰诱导时间为15.5分钟。对炎症细胞计数,选定的痰是分散使用二硫苏糖醇(德勤),悬挂过滤,总细胞数和细胞生存能力进行计数。Cytospins准备和染色(May-Grunwald染色)和微分细胞计数是400年获得nonsquamous细胞。

2.2。测量β-Defensin-1蛋白质

的浓度β-defensin-1是由ELISA(100 - 240 - 1型α诊断国际,圣安东尼奥,德克萨斯州,美国)按照制造商的指示。标准曲线范围从50到800 pg / mL。测量β-defensin-1痰浮在表面的蛋白质是验证通过确定如下:德勤的抑制作用,稀释样品基体效应,飙升的恢复蛋白质。德勤在标准曲线上有一个微不足道的效果。基体效应时最小化样本稀释的1/10。平均有104%的上升β-defensin-1蛋白()恢复。

2.3。疾病分类

粒细胞的否决决定炎性表型≥3%用于痰嗜酸性粒细胞和≥61%,痰中性粒细胞(2]。严重哮喘受试者不受控制的哮喘(Juniper哮喘控制问卷(ACQ),得分≥1)和/或肺功能不佳(FEV₁%≤80,FEV预测₁/ FVC %≤70)尽管处方大剂量吸入激素(ICS) (> 1000μ每天g倍氯米松等价物)结合长表演β受体激动剂(16]。如果参与者肺功能不佳或不良症状控制,但没有满足治疗需求严重的哮喘,他们被归类为不受控制的哮喘。哮喘控制被定义为正常肺功能(FEV₁% > 80预测和/或FEV₁/ FVC % > 70)和控制症状的慢性阻塞性肺病(ACQ得分< 1)。根据全球阻塞性肺疾病严重程度定义(黄金)计划阶段17]。

2.4。主支气管上皮细胞(pBEC)文化

香烟烟雾提取物(CSE)是由冒泡烟从一个肯塔基州的时候研究香烟,3 r4f含有9.5毫克焦油和0.8毫克尼古丁,通过10毫升的支气管上皮细胞培养基基础培养基(BEBM Lonza) 5分钟的速度香烟和细胞培养实验后立即使用。人类pBECs通过支气管刷在光纤支气管镜检和培养如前所述18]。pBECs保持在支气管上皮细胞生长培养基(Lonza)。被播种到胎盘细胞胶原蛋白(σ)涂布24-well板块(Nunclon)和用于通道2 confluency一旦他们达到80%。在暴露于1% CSE pBECs保持在BEBM (Lonza)包含1 x胰岛素,转铁蛋白,亚硒酸钠液体媒体补充(σ)。此前我们已经确认这个CSE通过剂量反应曲线的浓度会导致细胞毒性最小,同时诱导免疫反应。所有细胞种植在37°C公司为5%₂在空气中。收集细胞培养上清液在24小时的评估β-defensin-1蛋白质。

2.5。统计分析

临床和细胞计数数据分析使用占据/ IC 11.1(美国德克萨斯州占据公司、大学站)和GraphPad Prism 5.0(美国加州GraphPad软件有限公司)和报告为意味着(SD)正态分布数据和非参数数据值(Q1和Q3)。对于正态分布数据,以及与Bonferroni事后测试或方差分析测试,调整为多个应用比较。对于非参数数据,Mann-Whitney测试或克鲁斯卡尔-沃利斯测试和邓恩的事后测试调整为多个应用比较。使用分类数据统计比较测试。用斯皮尔曼相关系数变量之间的关联进行了评估。接受者操作特征(ROC)曲线生成和曲线下的面积(AUC)计算评估慢性阻塞性肺病和之间的关系β-defensin-1水平。

3所示。结果

3.1。临床特征和炎症细胞在哮喘参与者,COPD患者和健康对照组

临床细节和炎性细胞详细表1。被确诊为慢性阻塞性肺病的参与者中度到重度(2 2轻微和严重),明显老了,有一个更大的患病率和吸烟史,更高的每日剂量ICS。参与者与哮喘有显著较高的BMI。正如所料,FEV₁%,FEV预测₁在哮喘受试者/ FVC显著低于健康对照组和低在COPD受试者比哮喘受试者和健康对照组。炎症细胞的变化出现在哮喘和慢性阻塞性肺病,包括细胞总数增加,中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。

3.2。气道β-Defensin-1在哮喘,慢性阻塞性肺病,和健康对照组

β-defensin-1蛋白质在痰液明显高于在COPD受试者((q1和q3)中位数:63.0(43.6和81.9)ng / mL)比哮喘受试者(26.3(18.3和40.8)ng / mL)和健康对照组(18.2 ng / mL(14.2和27.8);图1)。没有显著差异β-defensin-1炎性表型之间的蛋白质哮喘或慢性阻塞性肺病(图2)。β-defensin-1蛋白质明显高于那些有严重的哮喘(图3),但并不是不同慢性阻塞性肺病的黄金阶段(数据未显示)。气道β-defensin-1蛋白水平与吸烟史(包年吸烟)在COPD受试者(枪兵和,图4),但不是在哮喘受试者或健康对照组。气道β-defensin-1蛋白质水平弱与ICS剂量在哮喘(枪兵和),但不是在慢性阻塞性肺病,最有可能反映哮喘严重程度的关系。气道之间没有相关性β-defensin-1蛋白质和参与者的年龄。

气道β-defensin-1蛋白质预测COPD的健康对照组的准确性(AUC) 88.3%(95%置信区间CI: 79.3 - -97.4%;图5(一个))。最好的分界点β-defensin-1水平预测COPD从健康对照组> 29.3 ng / mL,敏感性为87.5%,特异性为83.3%,阳性似然比为5.3。气道β-defensin-1蛋白质从哮喘和慢性阻塞性肺病的预测的准确性(AUC) 80.8%(95%置信区间CI: 72.5 - -89.1%;图5 (b))。最好的分界点β-defensin-1水平预测COPD从哮喘> 42.1 ng / mL,敏感性为80.0%,特异性为78.3%,阳性似然比为3.7。气道β-defensin-1蛋白质从严重哮喘是慢性阻塞性肺病的预测的准确性(AUC) 68.7%(95%置信区间CI: 55.2 - -82.2%,图5 (c))。最好的分界点β-defensin-1水平预测慢性阻塞性肺病严重哮喘> 47.3 ng / mL,敏感性为70.0%,特异性为72.4%,阳性似然比为2.5。

3.3。上皮细胞的生产β-Defensin-1

的水平β-defensin-1释放未经处理的媒体控制pBECs健康对照组与慢性阻塞性肺病和参与者之间的相似。然而,在刺激与香烟烟雾提取物(CSE)β-defensin-1生产降低了2.8倍的平均健康控制pBECs,而慢性阻塞性肺病pBECs继续产生相同的水平β-defensin-1(平均−2.8倍和0.1倍,)。图6显示的水平β-defensin-1文化,进一步说明这一点,与COPD组释放更多β比健康控制-defensin-1 pBECs CSE刺激后1%。

4所示。讨论

据作者所知,这是第一个研究检验β-defensin-1蛋白质在哮喘或慢性阻塞性肺病的痰。我们报告一个高水平的β-defensin-1蛋白质在慢性阻塞性肺病和严重的哮喘,无炎性表型的关系。气道的水平β-defensin-1在慢性阻塞性肺病与吸烟史。气道的水平β-defensin-1可以显著区别的存在慢性阻塞性肺病哮喘受试者和健康对照组。的生产β-defensin-1减少健康pBECs但保持在慢性阻塞性肺病pBECs CSE曝光后,这也许可以解释持续和加剧β-defensin-1水平。

驱动因素持续哮喘和慢性阻塞性肺病发炎,导致恶化的症状和肺功能,增加知识感兴趣的潜在机制和识别潜在的新颖的治疗目标。一类多功能抗菌蛋白质被称为alarmins defensins和抗菌肽的组成的两个主要的家庭,可能是重要的。人类β-defensin-1小阳离子肽表示持续的呼吸道上皮细胞。研究的功能β-defensin-1主要围绕其抗菌性;然而其他功能已报告(19]。β-defensin-1具有免疫调节作用,促进单核细胞的激活和成熟的树突细胞通过细胞表面表达的upregulation costimulatory分子和成熟的标记,以及促进促炎细胞因子的生产(20.]。通过大量的细胞表面受体包括CCR6,β-defensin-1促进未成熟树突状细胞和T细胞的趋化作用[21]。通过这些免疫调节功能,β-defensin-1可能影响COPD的发病机理,通过促进T细胞和树突细胞介导的炎症。

多态性的基因编码β-defensin-1 (DEFB1)已经被证明能够影响的浓度β-defensin-1唾液中的蛋白质检测,表明这些基因多态性影响表达,因此可以修改先天免疫反应(22,可能影响疾病的易感性。DEFB1基因多态性与哮喘有关(11,12和慢性阻塞性肺病易感性13,14]。此外,增加DEFB1支气管上皮和BAL液细胞中基因表达的COPD患者与FEV负相关₁%预测和FEV₁/ FVC [15]。明显的增加β-defensin-1蛋白质中看到当前的研究支持一个模型β-defensin-1特异表达在慢性阻塞性肺病和严重的哮喘。此外,我们发现了一个弱的相关性β-defensin-1 ICS剂量和哮喘。长期的皮质类固醇治疗可能导致先天和适应性免疫反应之间的平衡的变化,包括细胞迁移和巨噬细胞的趋化因子网络(23]。需要进一步的研究来确定长期ICS治疗的影响β-defensin-1水平。

开发新的诊断工具和治疗慢性阻塞性肺病已经跟不上对该病的了解(24]。作为呼吸道样本,痰液提供了吸引人的手段研究潜在的生物标记物,因为它包含大量的炎症介质参与COPD疾病过程(25]。这项研究还表明,β-defensin-1痰上层清液中蛋白质含量可能是一个有用的生物标志物的检测慢性阻塞性肺病。β-defensin-1能够区分COPD和哮喘受试者和健康水平较高的控制精度。多年来,肺量测定法和临床症状主要工具来管理慢性阻塞性肺病;然而这种方法不是最优26]。痰嗜酸性粒细胞和呼出一氧化氮可以预测的嗜酸性粒细胞的炎症反应在呼吸道疾病(24),但不区分哮喘和慢性阻塞性肺病。血液生物标志物包括c反应蛋白、il - 6和纤维蛋白原可以检测慢性阻塞性肺病的系统性炎症组成部分,重要在预测患者急性加重的风险(27),但这些标记并不特定于慢性阻塞性肺病,决心在中性粒细胞升高哮喘表型(28]。血浆蛋白的签名α₂巨球蛋白、结合珠蛋白和血液结合素被证实区分哮喘和慢性阻塞性肺病准确率达到了84% (29日]。这种组合3标记只是略优于痰β-defensin-1仅在当前的研究中为81%。后续的研究是必要的调查β-defensin-1对慢性阻塞性肺病诊断和预后和预测未来的能力恶化的风险。

上皮细胞可能的主要来源β-defensin-1分泌的航空公司。直到最近,只有四个β-defensins(1、2、3、4),与集群8号染色体上的基因所表达的已知上皮细胞(30.]。然而,额外的β-defensins预计表示,虽然他们的生物功能不明确9]。监管的表达β-defensin-1通常是本构;然而它可以诱导体外刺激有限合伙人和干扰素-γ(31日),多聚肌苷酸(32),细菌组件(33],TNF -α和il - 1β(34]。β-defensin-2是细菌引起的产品通过toll样受体的激活(通常)或促炎细胞因子包括TNF -α或il - 1β(10]。的表达β-defensins可能因此产生的环境,炎症是增强10),增加血管通透性(35]。这样的失调β-defensin-1严重哮喘和慢性阻塞性肺病可能比有益有害。

虽然生产的β-defensins至关重要的免疫功能,改变了这些分子的表达可能导致疾病进展。香烟烟雾暴露的上皮,COPD的发病机制中的重要组成部分,已被证明影响生产β-defensins [36]。我们的研究表明,生产的β-defensin-1降低在接触CSE健康pBECs;然而,慢性阻塞性肺病pBECs暴露时,β-defensin-1生产维护。这种异常反应的pBECs COPD患者可能导致更高层次的β-defensin-1的痰,这可能引发了暴露于香烟烟雾中。其他研究已经表明,β-defensin-1基因表达也减少CSE曝光后A549细胞,肺肺泡上皮细胞系(37]。相反,其他β-defensins调节在烟雾暴露(37,38]。需要进一步调查了解引起异常的机制β在慢性阻塞性肺病-defensin-1生产。

这项研究有一些局限性。需要进一步调查关于刺激负责升高β-defensin-1水平在慢性阻塞性肺病和机制。未来的研究还应该调查的关系β-defensin-1和细菌感染。鉴于pBEC文化的结果,我们会怀疑上皮细胞重新编程,这样他们的生产β-defensin-1不会改变,因为它应该暴露在不同的刺激。我们也没有调查的关系β-defensin-1水平在这一人群基因型。考虑到协会DEFB1多态性与慢性阻塞性肺病,这应该是进一步调查。未来的研究将需要确认的潜在生物标志物β-defensin-1与慢性阻塞性肺病人口大的主题,这也将是必要的检测对疾病严重程度。进一步的研究还应该调查的水平β-defensin-1哮喘慢性阻塞性肺病患者的重叠。

这项研究表明,β-defensin-1蛋白质增加航空公司在慢性阻塞性肺病和严重哮喘而不是与炎性表型有关。事实上,β-defensin-1表达式是一个强大的生物标志物预测COPD哮喘受试者和健康对照组。的水平β-defensin-1与吸烟史,在体外,β-defensin-1降低烟雾暴露在从健康的参与者,但维持上皮细胞在上皮细胞从参与者与慢性阻塞性肺病,暗示一个微分响应或宽容吸烟暴露。这项研究发现了特异表达β-defensin-1生产,表明这种蛋白质可能是慢性阻塞性肺病的治疗目标和严重的哮喘。

缩写

AUC:	曲线下的面积
CA:	控制哮喘
慢性阻塞性肺病:	慢性阻塞性肺疾病
CSE:	香烟烟雾提取物
DEFB1:	β-defensin-1
:	在1秒用力呼气量
FVC:	用力肺活量
黄金:	全球阻塞性肺疾病
pBECs:	主支气管上皮细胞
中华民国:	接受者操作特征
山:	严重的哮喘
TLR:	toll样受体
UA:	不受控制的哮喘。

免责声明

凯瑟琳·j·贝恩斯是担保人和负责的内容,包括数据和分析。

利益冲突

作者没有利益冲突。

作者的贡献

研究设计和概念是由凯瑟琳·j·贝恩斯和彼得·g·吉布森。数据收集和解释是由凯瑟琳·j·贝恩斯托马斯·k·赖特,朱迪·l·辛普森,凡妮莎·m·麦克唐纳,丽莎·g·伍德,彼得·a·华克克里斯蒂·帕森斯和彼得·g·吉布森。数据分析是由凯瑟琳·j·贝恩斯和托马斯·k·赖特。论文的写作是由凯瑟琳·j·贝恩斯和托马斯·k·赖特。论文的编辑和审查是由凯瑟琳·j·贝恩斯托马斯·k·赖特,朱迪·l·辛普森,凡妮莎·m·麦克唐纳,丽莎·g·伍德,彼得·a·华克克里斯蒂·帕森斯和彼得·g·吉布森。担保人是凯瑟琳·j·贝恩斯。

确认

作者要感谢Ridewood布里吉特的技术援助,希瑟·麦克唐纳,米歇尔·格里森凯莉假货,凯利钢铁、Calida穆勒,和乔安妮聪明。国家卫生和医学研究委员会(APP1045371)承认。