文摘

缺血性四肢的再灌注诱导炎症和随后会引起急性肺损伤。咖啡因,一种广泛使用的精神兴奋药,具有强大的抗炎能力。我们阐明咖啡因是否能减轻肺部炎症引起的下肢缺血再灌注(IR)。成年男性Sprague-Dawley老鼠被随机分配接受红外光谱、红外+咖啡因(红外+ Caf集团),sham-operation(假的),或假+咖啡因( 在每组)。诱导IR,下肢被橡皮筋双边联系每个大腿高为3小时3小时再灌注紧随其后。咖啡因(50毫克/公斤,腹腔内注射)再灌注后立即进行。严重肺部炎症的组织学分析数据显示特征IR组和轻度至中度肺部炎症的特征红外+ Caf组。总细胞数和蛋白质浓度在支气管肺泡灌洗液的IR组明显高于红外+ Caf集团( 和 、职责)。同样,肺的炎症介质浓度(肿瘤坏死因子-α,interleukin-1β和巨噬细胞炎性protein-2)和肺髓过氧化物酶活性的IR组明显高于红外+ Caf集团所有 )。这些数据清楚地表明,咖啡因可以减轻下肢缺血再灌注引起的肺部炎症。

1。介绍

下肢缺血可引起各种临床条件,包括严重的肢体缺血,腹主动脉瘤,创伤性动脉损伤(1- - - - - -3]。治疗可以恢复灌注缺血肢体(s)执行,以减少由缺血造成的损害。然而,再灌注缺血肢体(s)可以诱导炎症和导致远程器官损伤(4- - - - - -6]。在这方面,肺是最脆弱的器官远程伤害后续缺血再灌注(2,4,6]。

咖啡因(1、3、7-trimethylxanthine)是一种广泛使用的精神兴奋药。咖啡因本身是临床上用于治疗头痛、呼吸抑郁症在新生儿,肥胖,餐后低血压(7]。这些上述效应的咖啡因是由methylxanthine-sensitive抑制腺苷酸受体(7]。此外,咖啡因被证明具有强大的抗炎能力(8,9]。使用动物模型,以往的研究证实,咖啡因(特别是高剂量咖啡因)施加显著的治疗效果对创伤性脑损伤(10)和油的原油带来肺损伤(11]。咖啡因也起到保护作用对心肌缺血再灌注(12]。

迄今为止,是否咖啡因可以保护肺组织的下肢缺血再灌注的不利影响仍有待研究。进一步阐明,因此我们进行了本研究。本系统的研究使用了一个麻醉啮齿动物模型建立的下肢缺血再灌注(4,13)来确定系统的应用咖啡因在再灌注会减轻解剖和肺部炎症和病理生化标记物的。

2。材料和方法

这个动物研究机构批准的使用和护理委员会台北慈济医院,佛教慈济医疗基金会(102 - iacuc - 014)。大鼠治疗根据美国国立卫生研究院的指导方针。共有48个成年男性Sprague-Dawley老鼠(200克- 250克;BioLASCO台湾有限公司,台北,台湾)被用于这项研究。所有大鼠喂养一个标准实验室食物和水在一天自由,直到实验。

2.1。动物的准备

所有老鼠都是麻醉的腹腔内注射(ip)的混合物zoletil(40毫克/公斤;Virbac,卡罗,法国)和甲苯噻嗪(Rompun TS、拜耳勒沃库森,德国),被置于仰卧位。右颈动脉插管的聚乙烯(PE-50)导管持续血流动力学监测和抽血。执行气管造口术和16-gauge angiocatheter插入气管切开插管。血压和呼吸速率持续监控整个实验。补充剂量的zoletil /甲苯噻嗪混合物(13/3毫克/公斤,ip)给出了每30 - 60分钟,直到研究结束时,以确保和维护足够的麻醉。

2.2。试验协议

下肢缺血再灌注损伤的协议修改从以前公布的报告4,13]。简而言之,两国下肢缺血再灌注是由每个大腿橡皮筋止血带止血高申请3小时再灌注3小时紧随其后。一半的老鼠接受了下肢缺血再灌注损伤的协议。控制操作的影响,其余大鼠收到了sham-operation,也就是说,麻醉,颈动脉管子,和气管造口术,但是没有介绍的橡皮筋止血带止血和肢体缺血再灌注。

2.3。实验小组

所有的老鼠被随机分配到四个实验组,每组之一( 每组):sham-operation(假的),假+咖啡因(假+ Caf),下肢缺血再灌注(IR)和IR(红外+ Caf) +咖啡因组。老鼠的假+ Caf和红外+ Caf组接受咖啡因(50毫克/公斤,ip;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)后立即再灌注。剂量的咖啡因(50毫克/公斤ip)是根据先前的研究证明在这个剂量咖啡因可以降低油的段肺损伤小鼠(11]。为治疗车的影响,控制老鼠的骗局和IR组生理盐水(1.0毫升,ip)类似的时间点。3小时后再灌注,所有老鼠安乐死与颈部位错。

2.4。肺组织收集和支气管肺泡灌洗

开胸进行促进肺组织收割。左主支气管和和左肺切除。左肺组织snap-frozen在液氮和存储−80°C进行后续分析。促进组织学分析,正确的六大鼠肺组织每组灌注4%甲醛通过气管切开插管,然后删除。促进支气管肺泡灌洗液(BALF)分析,对肺的其他六个老鼠从每组与3毫升无菌生理盐水灌洗五次,我们之前的报道指出[13,14]。当时BALF收集。最大化的功效BALF集合,每次灌洗后吸了两次。五项分数从每个大鼠BALF汇集在一起,节省了后续分析。

2.5。组织学分析

formaldehyde-infused肺组织被嵌入在石蜡连续切片,然后与苏木精和伊红染色。肺组织炎症是由一个病理学家评估使用光学显微镜是盲目的。肺泡壁的组织学特征,包括水肿的变化,出血,血管堵塞,多形核白细胞(中性粒细胞)和渗透,被用来评估肺部炎症,根据我们以前的报告(14]。

2.6。总BALF中细胞数量和蛋白质浓度

汇集BALF的整除(50μL)从每个老鼠稀释1:1台盼蓝染料(美国纽约生活技术,大岛屿)和总细胞数是计算使用标准血细胞计数器,使用我们之前报道的协议(13,14]。其余汇集从每个大鼠BALF离心机(3000转5分钟15°C),然后收集上层的。BALF的蛋白质浓度分析了上层清液用BCA蛋白质分析工具包(IL皮尔斯生物技术公司,罗克福德,美国),由制造商的协议。一式三份BALF样本进行了分析。

2.7。炎症介质和髓过氧化酶(MPO)活动

冰冻的肺组织处理根据我们先前的报道(13,14]。炎性介质、冷冻肺组织与组织称重和均质均质器(MICCRA d 1,艺术Prozess & Labortechnik GmbH & Co . KG Mullheim,德国)在5卷里帕缓冲区(150毫米生理盐水、1% NP-40钠脱氧胆酸盐0.5%,十二烷基硫酸钠0.1%,50 mM Tris-HCl, pH值7.5;所有化学品都来自Sigma-Aldrich)和孵化在4°C•瑞帕缓冲区。离心后(在4°C 20分钟14000 rpm),组织收集上层的。后测量蛋白质浓度用BCA分析工具包(皮尔斯),细胞因子的浓度(例如,肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)和interleukin-1β(il - 1β))和趋化因子(例如,巨噬细胞炎性protein-2 MIP-2)的组织分析了上层的一式三份使用商业酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(TNF - ELISA试剂盒α和il - 1β皮尔斯;MIP-2酶联免疫试剂盒;研发系统,Inc .,明尼阿波利斯,美国)。ELISA进行按照制造商的协议。

肺MPO活性从snap-frozen组织量化,根据我们之前的报告(13,14),测量的活动渗透到中性粒细胞,肺部炎症的指标(13]。肺组织样本称重和均质1分钟15卷PE KH缓冲区(0.01米2阿宝41毫米EDTA)。均化和离心后(在4°C 20分钟14000 rpm),颗粒被收集和resuspended 15卷cetyltrimethylammonium溴化(13.7毫米)的缓冲区乙酸(50毫米)。resuspended丸被用和离心机(10000 rpm 15分钟15°C)。上层清液的收集和孵化水浴2小时60°C。MPO活性测定使用MPO荧光检测设备(美国宾夕法尼亚州恩佐生命科学,普利茅斯会议),根据制造商的指示。一式三份的样品进行了分析。所有化学物质来自Sigma-Aldrich。

2.8。丙二醛(MDA)测定

Snap-frozen肺组织匀浆MDA使用硫代巴比土酸测试化验,按照我们之前的协议发表(13,14),量化脂质过氧化的状态(15]。总之,snap-frozen肺组织称重和均质在5卷里帕缓冲在冰上。离心后(在4°C 10分钟2000 rpm),上层清液被收集并存储在冰。上层清液MDA浓度的测量使用商业MDA测定工具包(TBARS化验设备,开曼化工有限公司,安阿伯市,美国),根据制造商的指示。一式三份的样本分析。

2.9。统计分析

单向方差分析与Bonferroni-Dunn测试是用于多个比较。数据平均值±标准偏差。显著性水平是0.05。商业软件包(SigmaStat窗户,SPSS科学,芝加哥,IL)是用于数据分析。

3所示。结果

3.1。肺组织学数据

组织学分析显示正常轻度肺部炎症特征在虚假的和虚假的+ Caf组(数据1(一)和1 (b))。IR组显示严重的肺组织炎症特征(图1 (c))。此外,红外+ Caf组的肺组织(图显示轻度至中度肺部炎症特征1 (d))。

(一)
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图1
代表的微观研究肺组织沾hemotoxylin &伊红(100 x)。(一)sham-operation(虚假)组显示正常轻度肺部炎症特征。(b)假+咖啡因(假+ Caf)组显示正常,轻度肺部炎症特征。(c)下肢缺血再灌注(IR)组显示严重肺部炎症特征。(d) IR(红外+ Caf) +咖啡因组显示轻度至中度肺部炎症特征。老鼠的假+ Caf和红外+ Caf组收到咖啡因(50毫克/公斤,腹腔内注射)后立即再灌注。控制车辆的影响,老鼠的骗局和IR组生理盐水(1.0毫升,腹腔内注射)类似的时间点。
3.2。BALF数据

BALF中虚假的集团总细胞数 细胞/毫升和蛋白质浓度 μ克/毫升(数字2(一个)和2 (b))。总细胞数( 细胞/毫升)和蛋白质浓度( μg / mL)假+ Caf组BALF的类似的骗局集团(数字2(一个)和2 (b))。总细胞数( 细胞/毫升)和蛋白质浓度( μg / mL)的IR组明显高于那些虚假的集团( = 0.002,分别地;数据2(一个)和2 (b))。此外,总细胞数( 细胞/毫升)和蛋白质浓度( μg / mL)的红外+ Caf组明显低于IR组( 和 、职责;数据2(一个)和2 (b))。

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图2
蛋白质含量总细胞数(a)和(b)在支气管肺泡灌洗液(BALF)。骗局:sham-operation组。假+ Caf:假+咖啡因组。红外光谱:下肢缺血再灌注组。红外+ Caf:红外+咖啡因组。老鼠的假+ Caf和红外+ Caf组收到咖啡因(50毫克/公斤,腹腔内注射)后立即再灌注。控制车辆的影响治疗,老鼠的骗局和IR组生理盐水(1.0毫升,腹腔内注射)类似的时间点。单向方差分析与Bonferroni-Dunn测试是用于多个比较。显著性水平是0.05。数据来源于6老鼠从每组和平均值±标准偏差。 :IR组和虚假的组。 :红外+ Caf组与IR组。
3.3。肺部炎症介质和MPO活性数据

虚假的组,肺肿瘤坏死因子-的浓度α是 pg / mL, il - 1β是 pg / mL, MIP-2 pg / mL, MPO活性 μ/毫升(数据3(一个)- - - - - -3 (d))。肺部肿瘤坏死因子的浓度α( pg / mL), il - 1β( pg / mL), MIP-2 ( pg / mL)以及肺MPO活性( μ/毫升)的假+ Caf组类似的骗局集团(数字3(一个)- - - - - -3 (d))。肺部肿瘤坏死因子的浓度α( pg / mL), il - 1β( pg / mL), MIP-2 ( pg / mL)以及肺MPO活性( μ/毫升)的IR组明显高于那些虚假的集团(所有 ;数据3(一个)- - - - - -3 (d))。相比之下,肺肿瘤坏死因子的浓度α( pg / mL), il - 1β( pg / mL), MIP-2 ( pg / mL)以及肺MPO活性( μ/毫升)的红外+ Caf组显著低于IR组(所有 ;数据3(一个)- - - - - -3 (d))。

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图3
肺部(一)肿瘤坏死因子-的浓度α(肿瘤坏死因子-α),(b) interleukin-1β(il - 1β),(c)巨噬细胞炎性protein-2 (MIP-2), (d)和髓过氧化物酶(MPO)活性。骗局:sham-operation组。假+ Caf:假+咖啡因组。红外光谱:下肢缺血再灌注组。红外+ Caf:红外+咖啡因组。老鼠的假+ Caf和红外+ Caf组收到咖啡因(50毫克/公斤,腹腔内注射)后立即再灌注。为治疗车的影响,控制老鼠的骗局和IR组生理盐水(1.0毫升,腹腔内注射)类似的时间点。单向方差分析与Bonferroni-Dunn测试是用于多个比较。显著性水平是0.05。数据来源于6老鼠从每组和平均值±标准偏差。 :IR组和虚假的组。 :红外+ Caf组与IR组。
3.4。肺MDA数据

虚假的组的肺MDA浓度 单位/通用组织和假+ Caf组 单位/通用组织(图4)。肺MDA浓度( 单位/通用组织)的IR组显著高于虚假的集团( ;图4)。相比之下,肺MDA浓度( 单位/通用组织)的红外+ Caf组显著低于IR组( ;图4)。


图4
肺的丙二醛(MDA)浓度。骗局:sham-operation组。假+ Caf:假+咖啡因组。红外光谱:下肢缺血再灌注组。红外+ Caf:红外+咖啡因组。老鼠的假+ Caf和红外+ Caf组收到咖啡因(50毫克/公斤,腹腔内注射)后立即再灌注。为治疗车的影响,控制老鼠的骗局和IR组生理盐水(1.0毫升,intra-peritoneal注入)类似的时间点。单向方差分析与Bonferroni-Dunn测试是用于多个比较。显著性水平是0.05。数据来源于6老鼠从每组和平均值±标准偏差。 :IR组和虚假的组。 :红外+ Caf组与IR组。

4所示。讨论

这项研究的结果与先前的研究一致(2,4,6),证实下肢缺血再灌注能引起明显的肺的炎症。此外,目前的研究清楚地表明,在这种啮齿动物模型咖啡因减少下肢缺血再灌注引起的肺部炎症虽然底层机制没有调查。

完善,炎症是一个关键机制协调远程器官缺血-再灌注损伤诱导的下肢(4,13),但机械技师鉴定的保护作用的咖啡因可以,在这个阶段,只从一个广泛的文献提到间接相关的研究。炎症介质的表达是严格监管的关键上游转录因子核因子-κB (NF -κB) (16]。能接受的数据也表明缺血再灌注可以激活NF -κB表达(17]。因此,它似乎是合理的保护,肺的抗炎作用的咖啡因可能采取行动,在某种程度上,通过抑制NF -κB激活。这个概念是由以前的数据,咖啡因会抑制NF -κB在endotoxin-stimulated激活小胶质细胞(18]。有趣的是,聚(ADP-ribose)聚合酶- (PARP -)对NF - 1是一个代数余子式κB炎症介质介导upregulation [19]。然而,在培养的上皮和内皮细胞中,咖啡因代谢物,在生理水平,抑制PARP-1 [20.]。此外,环腺苷酸(营)是一种强有力的抑制剂的NF -κB (21]。退化阵营严格监管的磷酸二酯酶和抑制磷酸二酯酶可以提高营水平进而抑制NF -κB活动(22]。相关的是,咖啡因是一种非选择性磷酸二酯酶抑制剂(23]。的引用文献,我们推测,咖啡因的抗炎作用的机制在下肢缺血再灌注还可能涉及到对抑制PARP-1和/或磷酸二酯酶的影响。

除了炎症,氧化应激在调解中扮演着关键角色的发展下肢缺血再灌注肺损伤(4,13,24,25]。先前的研究表明,下肢缺血再灌注的黄嘌呤氧化酶活性明显增加,促进了氧化剂代以及脂质过氧化而抗氧化剂的应用减轻急性肺损伤在这个模型(13,24,25]。众多证据文档咖啡因的直接清除自由基的能力(26]虽然也被认识到,咖啡因能够提高上游转录因子的表达核factor-E2-related因子2 (Nrf2)和下游抗氧化酶系统,包括超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(27]。在我们的研究中,肺MDA的水平,脂质过氧化作用的指标,显著增加了下肢缺血再灌注和增加显著衰减由应用程序的咖啡因,咖啡因的行动结果符合一种抗氧化剂。因此,我们的研究结果表明,一个组件的保护作用的咖啡因可能源自其行动通路介导的氧化应激。

在这种啮齿动物的研究中,咖啡因的保护作用是显而易见的。然而,咖啡因的疗效是否存在剂量依赖的相关性问题仍有待研究。如前所述,在本研究中使用的剂量的咖啡因的保护作用是基于50毫克/公斤咖啡因(ip)油酸引起的急性肺损伤小鼠(11]。有些矛盾的是在相同的研究中,两个低剂量的咖啡因,5和15毫克/公斤,加剧了油酸引起的肺损伤(11]。此外,低剂量的咖啡因的治疗潜力,也就是说,5到15毫克/公斤,也曾使用啮齿动物模型研究创伤性脑损伤的10),但这些剂量未能调制指数的创伤性脑损伤10]。尽管目前的研究只使用一个高剂量的咖啡因,这些不一致的文学发现对剂量和缺血性模型促使我们执行一系列测试的影响初步研究低剂量的咖啡因(即。,10 - 25毫克/公斤)调制的upregulation肺肿瘤坏死因子-α下肢缺血再灌注引起的。我们的初步数据表明,低剂量的咖啡因(10 - 25毫克/公斤)施加没有明显的调制的upregulation肺肿瘤坏死因子-α在下肢缺血再灌注(数据没有显示)。虽然需要更多的研究进一步的结论之前,尽管如此,这些数据清楚地表明,显著的抗炎作用与高剂量的咖啡因只能观察到。

进一步阐明,目前我们正在进行一项后续研究比较治疗潜力在100毫克/公斤咖啡因和50毫克/公斤咖啡因使用相同的模型。从后续研究获得初步数据显示,100毫克/公斤咖啡因可以显著抑制总细胞数的增加和蛋白质浓度BLAF下肢缺血再灌注诱导的大鼠(请补充图1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2015/361638)。然而,我们初步数据也显示,总细胞数和蛋白质浓度在BLAF老鼠接受下肢缺血再灌注+ 100毫克/公斤咖啡因没有显著不同于那些老鼠接受下肢缺血再灌注+ 50毫克/公斤咖啡因(补充图1)。这些数据似乎表明,咖啡因的治疗潜力100毫克/公斤和50毫克/公斤咖啡因是相同的。符合这个概念,我们因此推测,可能有一个上限效应有关的治疗潜力高剂量咖啡因缓解下肢缺血再灌注引起的肺部炎症。如果是这样,那么这将明确限制咖啡因的临床应用观察。前,还需要进行更多研究可以达到进一步的结论。

应该注意的是,这项研究证实,咖啡因施加显著的抗炎作用在缺血再灌注的早期阶段(即。,在6小时内)。然而,是否咖啡因可以产生长期效应对下肢缺血再灌注仍有待研究。

5。结论

咖啡因可在大鼠下肢缺血再灌注引起的肺部炎症。

信息披露

研究数据的一部分已经在麻醉学2014,美国麻醉医师协会的年度会议上,新奥尔良,洛杉矶,美国,2014年10月11日- 15日。

利益冲突

作者声明没有作者个人利益冲突在出版的材料。

承认

这项工作是支持由台北慈济医院授予首度登上周(tcrd - tpe - 102 - 12)和Chun-Jen黄(tcrd - tpe - 104 - rt - 1)。

补充材料

Supplmental图1演示了初步数据总细胞数的蛋白质含量(A)和(B)在支气管肺泡灌洗液(BALF)。假+ N / S: sham-operation +生理盐水组。假+网:假+ 50毫克/公斤咖啡因组。假+ C100:虚假的+ 100毫克/公斤咖啡因组。红外+ N / S:下肢缺血再灌注+生理盐水组。红外+网:红外+ 50毫克/公斤咖啡因组。红外+ C100:红外+ 100毫克/公斤咖啡因组。老鼠的假+网,假+ C100、红外+网和I / R + C100组织再灌注后立即收到咖啡因(intra-peritoneal注入)。为治疗车的影响,控制老鼠的假+ N / S和红外+ N / S组生理盐水(1.0毫升,intra-peritoneal注入)类似的时间点。单向方差分析与Bonferroni-Dunn测试是用于多个比较。 The significance level was set at 0.05. Data were derived from 3 rats from each group and presented as mean ± standard deviation. *P<0.05 the IR+N/S group versus the Sham+N/S group. #P<0.05 the IR+C50 group or the I/R+C100 group versus the IR+N/S group.

  1. 补充材料