文摘
BALB / c株老鼠是独一无二的,他们开发鼠浆细胞瘤(MPC)由于炎症引起的姥鲛烷在腹膜腔注油。Th17在这工作Treg, B1, B2,和NHC淋巴细胞的数量由腹膜环境BALB / c,易感疲劳,和C57BL / 6小鼠,不开发MPC油处理后,进行了研究。两油菌株表现出降低水平的Th17淋巴细胞,Treg淋巴细胞无显著变化,B淋巴细胞的数量急剧减少。然而,只有原油带来BALB / c显示水平的提高自然辅助细胞骨髓瘤(NHC)这可能是重要的归纳。
1。介绍
BALB / c小鼠建立小鼠浆细胞瘤(MPC)在腹腔内政府的姥鲛烷(2、6、10、14-tetramethylpentadecane)的一个组成部分,矿物油(1- - - - - -5]。il - 6, TGF -β1,其他因素需要B淋巴细胞转化政策委员会(6- - - - - -8]。il - 6块Treg细胞的分化(9,10)抑制autoreactive T细胞和调节免疫功能通过释放TGF -β1和il - 10 (11),但它促进促炎Th17细胞的生成,特点是ROR的表达γt转录因子和IL-17的生产,导致生产的多种促炎细胞因子和neutrophil-attracting趋化因子(12]。
先天淋巴细胞群被称为自然辅助细胞(NHC)的细胞因子也可能参与炎症过程(13]。这些细胞在淋巴集群周围的脂肪组织,这被称为FALCs (fat-associated淋巴集群),标记,如c - kit,本来,IL7R, IL33R [13- - - - - -17]。NHC参与B1细胞增殖(13]。
B1淋巴细胞B细胞亚群,明显不同于通常研究B2。而B2 CD23+和CD43−CD23、B1细胞−和CD43+。B1细胞进一步分为B1a (CD5+)细胞和B1b (CD5−)。B1是自我更新和在腹膜、胸膜腔及其主要功能是本构自然IgM抗体的生产,提供早期保护各种病原体(18- - - - - -21]。B1a细胞监管属性,因为他们的il - 10的生产(21- - - - - -24),促进T细胞扩张(25,26]。然而,B1细胞通常autoreactive [18),但不清楚它们是如何监管,防止自身免疫。
这项研究的目的是确定是什么让BALB / c容易骨髓瘤发展结果的姥鲛烷油引发的炎症反应在腹膜腔。
2。方法
2.1。老鼠
BALB / cAnNHsd和C57BL / 6 nhsd雌性小鼠,7 - 8周大,从哈伦实验室购买,S.A. de简历老鼠处理在任何时候根据官方墨西哥笔名- 062 z00 - 1999标准制造,产品生产技术规范、护理和使用实验动物。姥鲛烷注射不需要使用麻醉剂,止痛剂、镇定剂。腹腔内管理执行姥鲛烷在动物虽然总是温柔但坚定地处理,避免了斗争和压力。该方法用于小鼠安乐死是暴露在二氧化碳(有限公司2)。
2.2。石油感应
小鼠腹腔注射500μL姥鲛烷(P2870 Sigma-Aldrich),在天0,60岁,120。我们用描述的方法通过波特和蜡,1.5毫升的姥鲛烷在3 0.5毫升剂量间距为2个月(5]。
2.3。Obtention腹膜的内容和肠系膜和间皮的组织
七个月后最初的姥鲛烷处理、油和控制老鼠鼠标菌株都是牺牲和腹膜的内容得到了如前所述[27]。一块皮肤切开腹部暴露间皮和腹腔被引入5毫升的RPMI 1640中(31800 - 022年Gibco)。腔是大力按摩和内容是吸气使用相同的注射器。油的BALB / c小鼠发展MPC七个月后,这组腹膜内容由于大量积累腹水直接吸气。从细胞和体液被离心分离腹膜内容。Obtention FALCs肠系膜组织和识别的区域(NHC fat-associated淋巴集群)与甲苯胺蓝进行描述(13]。然而,油老鼠两株FALCs区域没有明显可检测。肠系膜和间皮的组织收集菌株只在七个月后感应和保存在石蜡块(1,28,29日]。
2.4。淋巴细胞流式细胞仪测定
从腹膜细胞测定原油带来内容得到控制和老鼠在七个月。Th17确定细胞被刺激在4小时50 ng / mL的PMA的存在(佛波醇12-myristate 13-acetate 8139页,σ)和500 ng / mL Ionomycin(10634年Ionomycin钙盐,Sigma-Aldrich)。在过去的两个小时,Brefeldin (00 - 4506, eBioscience)和蛋白质运输抑制剂(554724年,BD GolgiStop)补充道。Treg Th17细胞与纯化鼠抗小鼠preincubated CD16 / CD32克隆2.4 g2(553142年,BD Pharmingen)阻止Fc受体。随后100年的细胞外进行染色μL (PBS-F (PBS / 2%流式细胞仪缓冲区)和特定的抗体,在黑暗中30分钟。Treg和Th17细胞识别、PerCP仓鼠Anti-Mouse CD3ɛ克隆145 - 2 - c11(553067年,BD Pharmingen)和FITC鼠Anti-Mouse CD4克隆RM4-5(553046年,BD Pharmingen),为B1细胞,PerCP鼠Anti-Mouse CD5克隆53 - 7.3(553025年,BD Pharmingen) FITC鼠Anti-Mouse CD43克隆S7(553270年,BD Pharmingen), PE鼠Anti-Mouse CD11b克隆M1/70(553311年,BD Pharmingen)和APC鼠Anti-Mouse CD19克隆1 d3(550992年,BD Pharmingen)。细胞内染色之前,Treg和Th17细胞被固定在4°C和permeabilized 30分钟30分钟37°C和鼠标都在黑暗中Foxp3缓冲区设置(560409年,BD Pharmingen)。Th17细胞内染色和Treg细胞与PE进行鼠Anti-Mouse IL-17A克隆TC11-18H10(559502年,BD Pharmingen)和PE鼠Anti-Mouse Foxp3克隆MF23(560408年,BD Pharmingen),分别为30分钟100年卷μ在黑暗中L PBS-F。最后,分析了细胞在FACSAria血细胞计数器,使用Davia软件。
2.5。NHC细胞和恶性浆细胞
Nine-micron部分被剪切了肠系膜和间皮的组织保存在石蜡块。组织学部分受到水化和暴露治疗,和特定的使用相应的初级和二级抗体进行染色。NHC的主要抗体识别细胞克隆EP10 CD117 / c - kit(芝加哥商品交易所296年AK, Biocare医疗)和Biotin-SP-AffiniPure山羊Anti-Rabbit免疫球蛋白(111-065-003,杰克逊ImmunoResearch)作为二级抗体。恶性浆细胞染色与纯化鼠Anti-Mouse CD138克隆281 - 2(553712年,BD Pharmingen)和Peroxidase-AffiniPure山羊Anti-Rat免疫球蛋白(112-035-062,杰克逊ImmunoResearch)。
2.6。细胞因子测定
细胞因子测定两品系小鼠腹水,控制和经济在7个月,与商业套件eBioscience:小鼠il - 6 ELISA准备——Set-Go(88 - 7064),人类/鼠标转化生长因子β1 ELISA Ready-SET-Go !第二代(88 - 8350),鼠标il - 10 ELISA Ready-SET-Go !第二代(88 - 7105),鼠标il - 4 ELISA Ready-SET-Go !(88 - 7044),鼠标IL-9 ELISA Ready-SET-Go !第二代(88 - 8092),鼠标IL-13 ELISA Ready-SET-Go !(88 - 7137),鼠标IL-5 ELISA Ready-SET-Go !(88 - 7054),鼠标干扰素γELISA Ready-SET-Go !(88 - 7314),和鼠标IL-33 ELISA Ready-SET-Go !(88 - 7333)。
2.7。统计分析
每个测试的结果所代表的值5个或更多独立的实验。的非参数Mann-WhitneyU是利用GradPad棱镜程序显示图形和12.0σ情节分析考虑价值显著差异,,
3所示。结果
3.1。货币政策委员会在BALB / c小鼠
肿瘤细胞在间皮和结节状白色组织BALB / c小鼠油被CD138的存在+(图1)。
3.2。Th17和Treg细胞的决心
Treg (Foxp3+CD3+CD4+)和Th17 (CD3+CD4+IL-17+)流式细胞术测定细胞在两种菌株,七个月后石油感应和控制老鼠。对Th17决心PMA / Ionomycin细胞被激活。不激活Th17细胞减少两菌株诱导小鼠(数字2(一个)和2 (b)),尽管原油带来更高比例的Th17细胞被发现在C57BL / 6小鼠相比,经济BALB / c(图2 (b))。Treg细胞分析的差异在七个月后感应并不重要。然而当诱导小鼠菌株比较,Treg细胞的百分比在BALB / c(图更高3 (b))。
(一)
(b)
(一)
(b)
3.3。B1细胞测定
B1a (CD19+43+CD11b+CD5+),B1b (CD19+43+CD11b+CD5−)[19,30.,31日),和B2 (CD19+)从腹膜细胞测定内容BALB / c和C57BL / 6经济和控制小鼠通过流式细胞术在七个月后归纳。所有B细胞数量减少的原油带来两株小鼠(数字4(一)和4 (b))。
(一)
(b)
3.4。NHC细胞测定
国家飓风中心(c - kit+)细胞测定肠系膜BALB / c和C57BL / 6小鼠oil-induction后七个月。NHC细胞增加原油带来只在BALB / c小鼠(数字5(一个)和5 (b))。
(一)
(b)
3.5。细胞因子测定
IL4、IL-5 IL-9 IL-13,正无穷γ、il - 6、il - 10, IL-33 TGF -β确定在两株腹水诱导后七个月。表1没有生产的il - 4、IL-13和IL-33,而IL-9同样由所有组。正,γ、il - 6和TGF -β水平(绿色)是原油带来增加动物;然而,没有发现显著差异BALB / c和C57BL / 6株之间。
只有在IL-5和il - 10株被发现(图之间的显著差异6(一)和6 (b)和表1粉色)。增加原油带来IL-5被发现在老鼠,但最高浓度C57BL / 6中被发现。il - 10高控制和诱导C57BL / 6小鼠与BALB / c小鼠相比,尽管原油带来减少细胞因子在C57BL / 6小鼠,相比与控制。
(一)
(b)
4所示。讨论
众所周知,只有BALB / c小鼠压力容易开发骨髓瘤的结果引起的炎症反应刺激腹腔内注射,通常姥鲛烷(4,29日]。
试图找出哪些是BALB的独特特点,允许对骨髓瘤的外表,我们注入BALB / c小鼠的姥鲛烷敏感菌株和小鼠C57BL / 6应变控制都不敏感,决定几个细胞和细胞因子在七个月后油治疗以及noninduced控制动物。
BALB / c和C57BL / 6株姥鲛烷治疗后开发了一个慢性炎症过程。大淋巴细胞浸润观察腹膜内容引起的压力,但更大程度的BALB / c(数据未显示)。
的外观在BALB / c小鼠骨髓瘤姥鲛烷治疗后观察到的七个月,与肿瘤的恶性浆细胞形态学和CD138+标记为已报告(28]。
在这个工作发现的规定Th17 Treg是原油带来不同原油带来BALB / c小鼠和C57BL / 6小鼠。
Th17细胞原油带来的菌株都减少老鼠控制相比,但从姥鲛烷Treg之间没有明显差异治疗小鼠和控制,这表明Th17的减少并不是因为Treg。然而当原油带来的两株小鼠相比,更大比例的Treg细胞和低比例的TH17细胞观察原油带来的BALB / c小鼠,而原油带来C57BL / 6小鼠显示值成反比。这将显示一个更大的努力试图控制BALB / c小鼠的炎症过程。
我们还发现亚种群减少B1, B1a和B1b和B2淋巴细胞在两种菌株原油带来的动物,可以解释为这些细胞的迁移到其他淋巴隔间。在适当的刺激,B1细胞腹腔转移到肠系膜淋巴结(mln),它们分化成antibody-secreting浆细胞(32,33]。
此外,一些生长因子产生的影响在同一炎症利基的BALB / c小鼠和基因原癌基因可能会影响这些B淋巴细胞恶性浆细胞的进化(6]。
紧张的一个重要区别是NHC的增加细胞只有在BALB / c。对这些细胞,但其重要性在先天反应已经报道,已经被确认为一种免疫促进因子;然而最近的研究表明,他们也参与肿瘤免疫微环境的形成。Bie等人提出,这些细胞在外周血非常密切相关的胃癌的免疫抑制微环境(34]。NHC的增加可能是先天反应的BALB / c小鼠炎症控制;然而,高数量的这些细胞可能影响发展的骨髓瘤。
研究的细胞因子,只有IL-5和il - 10在两个菌株之间表现出显著差异。细胞因子il - 4、IL-13 IL-33 IL-9,干扰素-γ、il - 6和TGF -β了无关紧要的结果(表吗1)。细胞因子il - 4、IL-13 IL-33不在或水平低于我们的检测极限。IL-9检测,但没有显著差异被发现之间的经济和控制动物。尽管有报道称,增加肺部炎症水平(35),IL-9似乎不相关的腹膜炎症。
正,γ、il - 6和TGF -β增加预期在炎症过程中诱导动物;然而,没有发现菌株之间的差异。
原油带来IL-5水平高两株小鼠。作为IL-5受体(IL-5R)股票β链GM-CSFR受体,它可以促进淋巴细胞增殖36- - - - - -38),可能NHC的增加。然而,增加IL-5 C57BL / 6株高也更高级别的控制老鼠。
C57BL / 6显示高正常水平的il - 10 (39),即使减少诱导C57BL / 6 il - 10的水平仍远高于诱导BALB / c。
因此,高浓度的il - 10在C57BL / 6小鼠可以防止IL-5 NHC诱导增加,从而避免货币政策委员会,在与BALB / c NHC淋巴细胞的扩张可能会推动其发展。
多发性骨髓瘤(MM)是一种原生质细胞的癌症在人类中,虽然近年来有了巨大的飞跃这一疾病的研究,MM原因尚不可知。小鼠模型中我们的工作表明,国家飓风中心的参与作为进一步研究的重要课题,也作为一个潜在的目标,一个有效的疗法。
5。结论
唯一重要的原油带来区别炎症过程两个菌株,而在C57BL / 6小鼠没有NHC的变化,这些细胞在BALB / c应变增加,这可能与骨髓瘤的激增有关。
利益冲突
作者宣称他们没有利益冲突的数据。