文摘
扩大医疗设备的治疗慢性肾脏疾病(CKD),我们探讨了促进内生N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline合成时的效用(Ac-SDKP),增强了血管紧张素转换酶的抑制。雄性BALB / c小鼠接受单侧输尿管结扎(UUO)或外部假针灸操作和管理并且Ac-SDKP交付通过皮下渗透微型泵或卡托普利治疗口腔填喂法。UUO七天后,有显著减少胶原蛋白1和胶原蛋白的表达在肾脏Ac-SDKP或卡托普利治疗,有一个趋势减少胶原IV,αsma, MCP-1与控制。然而,没有明显衰减的间质损伤或观察巨噬细胞浸润。这些发现是在相反的观察其他模型和强调这一事实可能需要更长的治疗时间在BALB / c小鼠产生抗炎作用Ac-SDKP处理与未经处理的小鼠相比。找到一个有效的治疗方案CKD需要微调的药理学的协议。
1。介绍
进展的慢性肾脏疾病(CKD)终末期肾病(ESRD)收敛在一个共同的特点是致病机制途径导致进步的间质纤维化,管周毛细血管损失和破坏的功能肾单位(1]。目前,肾素-血管紧张素系统(RAS)封锁与血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂或血管紧张素ⅱ受体拮抗剂(ARB)是目前最有名的治疗策略延缓慢性肾病的进展。然而,它仍然明显,CKD ESRD继续不断进步(2)尽管最大RAS抑制加上严格的血压和血糖控制。寻找一种新型治疗性剂延缓慢性肾脏病已经转向N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline (Ac-SDKP)。
Ac-SDKP是一个内生的四肽调节多能造血干细胞的增殖3]。它通常出现在循环4),由ACE完全退化。有数据表明,除了抗增殖对造血系统的影响,Ac-SDKP可能拥有心脏和肾脏抗炎和antifibrotic属性在高血压大鼠模型(5,6),急性心肌梗塞7),和急性anti-GBM肾炎(8]。此外,血管紧张素转换酶抑制剂的研究已经阐明,renoprotective行动可能介导通过Ac-SDKP [9]。然而,在活的有机体内研究解剖Ac-SDKP renoprotective效果的健壮的模型,概括人类慢性肾病的病理变化是缺乏。
ESRD CKD的进化是复制的单侧输尿管的阻塞(UUO)小鼠模型。典型,巨噬细胞招聘开始的第三天。此外,阻力指标与增加基质沉积和合成管状纤维化也许可以加速萎缩发生输尿管的结扎后一个星期内(10]。这些病变是高度可再生的各种小鼠菌株包括BALB / C小鼠(11]。在这项研究中,我们探讨了潜在renoprotective Ac-SDKP UUO小鼠模型的影响。
2。材料和方法
2.1。单侧输尿管梗阻的小鼠模型
所有动物实验委员会批准使用的动物生活在香港大学的教学和研究,按照美国国立卫生研究院进行指导的实验室动物保健和使用。
雄性BALB / C小鼠(实验动物单位,香港大学,香港)进行了虚假的操作或单侧输尿管梗阻(UUO) 12周的年龄,如前所述[5,12]。短暂,老鼠接受全身麻醉期间,左侧输尿管是通过和结扎midabdominal切口暴露的。Sham-operated小鼠没有结扎输尿管暴露和操纵。UUO老鼠接受了以下治疗:(i)车辆(控制),(2)Ac-SDPK, (iii)卡托普利。Ac-SDKP交货1毫克/公斤/天通过外科手术植入皮下渗透微型真空泵(美国Alzet,库比蒂诺,CA)。卡托普利是由口腔填喂法30毫克/公斤/天。所有老鼠都牺牲在7天,所有动物的左肾是收获进行进一步分析。收获的肾脏都是嵌入在10%的中性缓冲福尔马林组织学检查或snap-frozen在液氮和存储−80°C进行进一步的蛋白质组学分析。牺牲之前,收集血液样本的测量等离子体Ac-SDKP水平,酶免疫分析法工具包(贝尔坦公司制药、法国)。
2.2。RNA提取和实时PCR
总RNA被孤立肾皮质的使用NucleoSpin RNA /蛋白质工具包(Macherey-Negel, Duren,德国)。mRNA的表达是由ABI 7500年分析实时PCR系统(美国应用生物系统公司,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指示。简而言之,两个微克总rna的反向转录cDNA,随后放大使用SYBR绿色主人混合引物:ICAM-1, forward-TGGCCTGGGGGATGCACACT reverse-GGCTGTAGGTGGGTCCGGG;MCP-1, forward-CTCTTCCTCCACCACCAT reverse-CTCTCCAGCCTACTCATTG;TGF -β,forward-AGGGCTACCATGCCAACTTCT reverse-CCGGGTTGTGTTGGTTGTACA;Col1, forward-TGTGTGCGATGACGTGCAAT reverse-GGGTCCCTCGACTCCTACA;Col3, forward-ACGTAGATGAATTGGGATGCAG reverse-GGGTTGGGCAGTCTAGTG;Col4, forward-CCGGGATTTACTGGACCACC reverse-CCCTTGCTCTCCCTTGTCA;αsma, forward-GTGCTATGTCGCTCTGGACTTTGA reverse-ATGAAAGATGGCTGGAAGAGGGTC。数据分析使用SDS软件(应用生物系统公司)。mRNA表达规范化β肌动蛋白和作为相对褶皱变化控制老鼠。
2.3。肾组织学
石蜡包埋肾部分(4μ米)脱蜡使用标准序列技术,沾染了周期性acid-Schiff试剂。肾皮质的组织学变化在显微镜下检查通过大功率(×400)。Tubulointerstitial损害从0 - 5评分(1≤10%;2 = 10 - 25%;3 = 26 - 50%;4 = 51 - 75%;6≥95%)如前所述13,14]。肾纤维化的变化确定马森的三色的彩色肾脏部分。
2.4。免疫组织化学
免疫组织化学分析进行石蜡包埋肾部分(4μm)如前所述15]。部分淬火3%过氧化氢,被2% BSA,然后用anti-F4/80染色过夜(AbD Serotec, Kidlington,英国),anticollagen 1, anticollagen 3抗体(美国南部生物技术、伯明翰、AL)。彩色部分随后被孵化与过氧化物酶共轭二次抗体(美国Dako Carpinteria, CA)。immunocomplexes是可视化使用民建联衬底从想象+系统(Dako)。所有的部分都安装前与苏木精复染色。F4/80的数量+细胞tubulointerstitium计入10等效大功率(400 x)字段和表达为细胞的平均数量每平方毫米。
2.5。免疫印迹分析
从肾皮质组织提取蛋白质里帕裂解缓冲(微孔,贝德福德,妈,美国)。等量的蛋白质在12% sds - page凝胶和转移到解决PVDF膜。阻止5%脱脂乳后,膜与反在一夜之间被孵化αsma (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),随后孵化与过氧化物酶共轭二次抗体。immunocomplex是可视化与发射极耦合逻辑主要化学发光(通用电气医疗集团,白金汉郡,英国)使用ChemiDoc XRS +系统(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。量化的蛋白质乐队是由ImageJ程序(NIH,贝塞斯达,医学博士,美国)和规范化β肌动蛋白水平。
2.6。统计分析
所有数据都表示为均值±SEM从三个独立的实验。组之间的差异被未配对的评估t以及使用GraphPad棱镜,版本5 (GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)。数据被认为是具有统计学意义;;与相应的群sham-operated老鼠;;与UUO-vehicle动物在同一操作组。
3所示。结果
3.1。Ac-SDKP水平
sham-operated和车辆老鼠相比,卡托普利管理水平显著升高内源性Ac-SDKP的等离子体。外生Ac-SDKP政府也能够实现supraphysiological等离子体肽水平(图1)。
3.2。形态学研究结果
肾脏从对照组以及nonobstructed侧肾脏的小鼠组操作显示没有组织学异常形态学检查。肾脏输尿管的结扎的阻碍发达国家严重的间质纤维化和肾小管萎缩而肾小球保存完好,未受影响。阻力指标受伤也许可以合成的水平与对照组相比有统计学显著性。然而,Ac-SDKP或卡托普利管理后,没有明显的衰减观察间质损伤(图2)。
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3.3。Ac-SDKP对炎症的影响
巨噬细胞浸润在阻塞肾脏相比显著增加控制肾脏。然而,没有显著减少介导通过Ac-SDKP管理或卡托普利(图3)。对淋巴细胞染色也证明UUO后增加渗透。同样,没有产生可观测的减量后Ac-SDKP管理或卡托普利(图4)。在音乐会,诱导ICAM-1(一个重要的趋化细胞因子介导的细胞粘附,使白细胞的轮回地区炎症)不是由Ac-SDKP表达下调或卡托普利(图9)。
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3.4。Ac-SDKP对纤维化的影响
UUO损伤诱导间质胶原原纤维的表达,马森的三色的染色(图5)。第三次我胶原蛋白和胶原蛋白的表达在肾皮质组织都显著增加了UUO比控制。这些都是政府的减毒Ac-SDKP和卡托普利。mRNA表达显著减少通过实时PCR被证明是由胶原蛋白免疫组织化学染色法减少胶原蛋白1和3在肾脏接受Ac-SDKP和卡托普利(数字6和7)。减少胶原IV的趋势,αsma, TGF -β,MCP-1表达式也观察到治疗组与Ac-SDKP和卡托普利(数字8和9)。
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4所示。讨论
单侧输尿管的阻塞(UUO)是一个健壮的模型会导致肾损伤表现为肾小管细胞损伤,间质炎症和纤维化(16]。从力学上看,当地趋化因子的表达后UUO吸引血液肾皮质间质巨噬细胞。反过来,细胞因子和生长因子分泌的炎症浸润导致积累激活αsma阳性纤维母细胞阻力指标空间也许可以在一个招聘的过程和管状epithelial-mesenchymal过渡(EMT) [10]。因此UUO模型是一个好的模型的调查抗炎和antifibrotic Ac-SDKP的属性。事实上,相比sham-operated老鼠,老鼠UUO阻力指标肾脏纤维化也许可以开发大量巨噬细胞浸润和皮层在结扎后第七天17]。
以前的在活的有机体内研究表明Ac-SDKP显著减弱阻力指标纤维化也许可以间质炎症和去氧皮质酮acetate-salt高血压老鼠(18和aldosterone-salt-treated老鼠5)和大鼠诱导急性anti-GBM肾炎(8]。最近的一项研究还发现有利影响抑制肾引起的炎症和纤维化的Ac-SDKP UUO Wistar鼠(19]。然而,在我们目前的研究使用BALB / C小鼠,阻力指标受伤也许可以合成水平没有明显不同车辆组和治疗组Ac-SDKP和卡托普利。加强我们的观察的有效性的重要肽水平的Ac-SDKP通过外源性政府实现Ac-SDKP组和卡托普利组ACE抑制。
也许可以解释这种差异的一个原因可能是不同时期的治疗。更短的治疗7天时间在我们的研究中,相对于14天在其他研究中,可能不允许足够的时间效应的差异。支持,UUO诱导胶原蛋白1和胶原蛋白3皮质组织中基因表达显著抑制Ac-SDKP建议antifibrotic优势。类似的趋势,但统计上微不足道,被发现αsma表达。因此,我们假设需要更长的治疗时间观察组织学形态差异的BALB / C小鼠Ac-SDKP处理与未经处理的小鼠相比。这些纤维化标志物的表达也改善了卡托普利,这似乎在暗示的行为Ac-SDKP平行卡托普利或血管紧张素转换酶抑制剂可能部分通过提高内源性水平Ac-SDKP行动。
肾间质炎症在感应中起着举足轻重的作用,间质性纤维化的传播特点是巨噬细胞和淋巴细胞浸润。与先前的研究相比,我们无法证明任何与Ac-SDKP管理的抗炎作用。是一致的,这种缺乏利益也同样观察卡托普利组。不确定是否这个结果从不同动物模型利用或雇佣足够的治疗时间。
总之,UUO模型在我们的研究让我们证明Ac-SDKP可以减弱纤维化的基因表达标记。缺乏形态的差异可能是由于发现治疗时间不足。因此,Ac-SDKP可以作为一个潜在的治疗治疗CKD的代理。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
支持本研究研究资助委员会的一般研究基金(批准号HKU7760/08M)的香港,中国的国家基础研究计划973项目没有。2012 cb517600(没有。2012 cb517606),香港肾脏病学会/香港肾脏基金会研究基金会资助。吴围汉族姚和郝贾部分支持的温斯顿·梁先生,香港混凝土和水泥和石膏有限公司大陆,和一个养老基金建立了“余教授在肾脏学”授予悉尼c·w·唐。