文摘

目的。本研究旨在探讨氢盐水对胰腺癌的治疗潜力缺血/再灌注(I / R)损伤的老鼠。方法。八十异位胰腺移植(HPT)进行syngenic老鼠。受体被盲目地随机分成以下三组:HPT组和富氢生理盐水的两组,进行移植和政府(HS > 0.6毫米6毫升/公斤)或生理盐水(NS, 6毫升/公斤)通过尾静脉再灌注开始时(HPT + HS集团HPT + NS组)。胰腺和血液样本被在再灌注后12小时。的氢盐水对I / R损伤的保护作用进行评估,确定组织病理学的改变和测量血清参数,氧化分子跟压力,促炎细胞因子。结果。氢盐水的政府产生显著的保护胰腺I / R损伤的老鼠。组织病理学观察改进和恢复胰脏功能受损。此外,肿瘤坏死因子-α,il - 1β,il - 6 HPT + h组明显减少。此外,有明显的抑制性影响胰腺癌中SOD、GPx丙二醛水平和相当大的招聘,抗氧化剂。结论。富氢生理盐水治疗显著减弱小鼠胰腺I / R损伤的严重程度,可能通过减少氧化应激和炎症。

1。介绍

近年来,胰腺移植已经成为治疗胰岛素依赖型糖尿病患者的首选(1- - - - - -3]。然而,移植胰腺炎由于缺血/再灌注(I / R)损伤最严重的并发症之一,在术后早期(4]。Postimplantation胰腺炎引起的I / R负责观察胰腺移植和后相当大的发病率在20%以上的患者进行胰腺移植(5]。在嫁接其他组织的情况下,氧自由基引起直接膜损伤,表达粘附分子,和嗜中性粒细胞浸润,调解的损害。许多因素导致再灌注期间oxygen-derived自由基的生成,包括内皮功能障碍、内源酶,白细胞招募(6]。氧化应激诱导的I / R损伤的主要机制在胰腺移植7]。自由基和促炎细胞因子可以破坏细胞膜和亚细胞结构,含有大量的磷脂和蛋白质,导致脂质过氧化反应和随后的结构和代谢的改变,导致细胞凋亡和坏死。早期研究表明,超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)减少腺水肿和组织损伤诱导的I / R胰腺(8]。Postimplantation I / R可能造成或引起的胰腺炎由prooxidative和抗氧化失衡。这一理论发展了一个新的治疗策略减少I / R损伤基础上补充外源性抗氧化剂。

最近,沢和他的同事们第一次报道,氢气作为一种抗氧化剂,有可能在许多常见疾病的预防和治疗作用引起的氧化应激(9]。2010年,吉等人报道,吸入氢显著抑制I / R-induced脑损伤通过选择性地消除毒性氧自由基(10]。后,有更多的研究调查可能的治疗氢盐水对肾的影响,心肌、肺肠,I / R损伤大鼠(11- - - - - -14),表明活性氧和活性氮物种增加缺血和再灌注,负责组织损伤。

氢的潜在影响胰腺I / R损伤还没有检查。进一步研究氢的潜在的保护作用,我们开发了一个老鼠的异位胰腺移植模型,允许同时测定功能,生化和形态学参数。第一本研究的目的是探讨氢生理盐水的治疗效果的I / R损伤胰腺移植后移植物。第二,我们旨在确定氢生理盐水的保护作用之间的关系及其抑制氧化应激。

2。材料和方法

2.1。动物

雄性Wistar鼠购买来自四川大学实验动物中心(成都,四川,中国)。平均体重的老鼠实验的时候是200±50克。动物们被安置在一个控制温度与光12小时(22±1°C)和12小时黑暗周期(光,08:00-20:00;黑暗,20:00-08:00)。动物们适应一周之前任何实验。这项工作中所使用的动物获得了人道关怀遵守制度动物保健指南和四川大学的一个委员会的批准。手术和实验程序都按照制度动物保健指南。

2.2。制备富氢生理盐水

氢盐水被教授慷慨地提供Xue-jun太阳(在第二军医大学、上海、中国)。饱和富含氢的盐水制备如前面描述的方法和存储在4°C在一个大气压下铝袋(13]。

2.3。实验设计

36个动物被分为18捐赠者和18受体,和18异位胰腺移植(HPT)进行,冷缺血时间(威斯康辛大学解决方案在4°C)的12个小时。受体被盲目地随机分成三组和治疗如下:HPT集团HPT +氢生理盐水组(HPT + h),和一对+生理盐水组(HPT + NS)。saline-treated组收到富含氢的盐水(> 0.6毫米,6毫升/公斤)或生理盐水(6毫升/公斤),分别通过尾静脉再灌注开始时。两种盐只管理到接受者的时候移植再灌注,而不是用于胰腺保护解决方案在检索和冷缺血。这些动物被牺牲在伤后12小时收集样本。六只老鼠进行了剖腹手术是虚假的操作组(所以)。每组动物牺牲在12小时再灌注后收集样本。

2.4。胰腺移植

麻醉:手术前,老鼠被吸入麻醉乙醚和戊巴比妥的腹腔内注射(25毫克/公斤)。供体手术:出手技术被用来驱逐胰腺,和这种技术被李et al。(前面描述的15在另一项研究[]和修改16]。成功后进行剖腹手术麻醉,然后胃左动脉,肝动脉、胆总管结扎和切断。我们分开的门静脉肝门和胰腺的网膜分隔。幽门、十二指肠的结扎和分离,结扎后和结肠扩张结肠动脉和静脉。我们的肠系膜上动脉的结扎胰腺、分离和结扎腹主动脉、肾动脉。插入到远端动脉插管,我们使用50 IU /公斤的肝素,以确保抗凝的动物。此后,胰腺是通过主动脉灌注冷林格氏溶液(50毫升,灌注压力50毫米汞柱),胰腺和门静脉包含主动脉段被移除。每个胰腺是存储在威斯康辛大学的解决方案在4°C 12小时。接受手术:收件人剖腹手术后,肾下的主动脉和腔静脉暴露与血管夹夹在血管分叉和肾血管的水平以下。主动脉和下腔静脉切开后,我们做了一个器官捐献者之间由8缝合线end-to-side吻合门静脉和下腔静脉之间的两个主动脉段。 Then the saline-treated groups received hydrogen-rich saline (>0.6 mM, 6 mL/kg) or normal saline (6 mL/kg), respectively, via the tail vein at the beginning of graft reperfusion. Then, the anastomosis clamps were removed to let the donor organ reperfuse. After these procedures, an enterovesical anastomosis was performed for pancreatic secretion drainage.

在每组动物牺牲在指定的时间后再灌注生化检测,收集样品。我们reanesthetized动物和打开腹部和收获的血液样本中获得的血清样本通过离心(1800 g×15分钟在4°C)。胰腺是小心地删除,胰腺组织被组织病理学检查。部分切除组织在中性10%福尔马林固定石蜡和嵌入式,剩下的样品立即被浸在冰冷的NS和均质。

2.5。组织学检查

胰腺组织的石蜡切片染色后与hematoxylin-eosin消除石蜡。在光学显微镜下,组织学评估是由独立的病理学家那些盲目的动物分组。专家评分伤病的严重程度基于水肿,炎症、坏死范围从0到3,施密特描述等。17]。

2.6。血清学测定参数与胰腺的功能

胰岛素的血清浓度、脂肪酶和淀粉酶测定评估胰腺的功能。胰岛素是由放射免疫检定法测量使用商业分析(INSULIN-CT;口的集团CIS生物国际Gif /伊薇特、法国)。自动enzyme-based比色测定(日立7170生化分析仪、东京、日本)进行确定血清淀粉酶和脂肪酶。

2.7。测定血清细胞因子水平

血清样本准备检测肿瘤坏死因子-α(TNF -的水平α),interleukin-1β(il - 1β)和白细胞介素- 6 (il - 6)使用商业定量酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(研发系统,明尼阿波利斯,美国)根据制造商的指示。血清样本中的蛋白质含量由Coomassie蓝色的测定。

2.8。检测水平的丙二醛(MDA)和胰腺组织中SOD、GPx活动

新鲜的胰腺组织样本放入离心管。丁羟甲苯是添加到均质胰腺组织蛋白酶抑制剂。然后,混合物在10000×g离心10分钟在4°C。上层清液用于测定。胰腺组织中的MDA水平检测使用一个商业MDA - 586试验装备(OxisResearch,波特兰,或美国)根据制造商的指示。组织中的MDA含量归一化与总蛋白(pmol /毫克)。胰腺的SOD活性测定使用商业分析工具(美国安阿伯市MI),遵循制造商的指示。这个分析工具使用四唑盐的检测超氧化物阴离子生成黄嘌呤氧化酶和次黄嘌呤。组织总蛋白浓度测定使用商业套装(南京建成Corp .)、南京、中国),和SOD活性表示为U /毫克的蛋白质。胰腺组织中的GPx活性测定根据屋和情人节描述的方法18]。GPx催化氧化的谷胱甘肽(GSH)的H₂O₂和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)(减少形式)转换为NADPH +在反应(氧化形式);GPx活性从而可以探测到340纳米的吸光度。

2.9。统计分析

所有的实验结果都表现为平均值±标准偏差(SD)。组间显著差异在数据被学生相比以及。一个小于0.05被认为是具有统计学意义的价值。

3所示。结果

3.1。组织病理变化

胰腺的组织病理学检查表明,所有的动物接受移植的迹象postischemia胰腺炎严重水肿的形成,炎症浸润,细胞坏死。HPT + h组,这些组织学变化与动物相比大大减少明显接受生理盐水再灌注前,组织病理学评分(表就是明证1)(图1)。这些结果表明,氢盐水可能与胰腺组织的组织病理学变化的缓解。

3.2。血清学参数与胰腺的功能

I / R诱导显著减少血清胰岛素浓度()(图2(一个))。氢盐水的政府部分恢复HPT + h组的胰岛素水平和较显著地增加了HPT + NS组。有显著增加大鼠的血清淀粉酶和脂肪酶含量受I / R损伤HPT组,HPT + NS组,HPT + HS组相比,所以组()(数据2 (b)和2 (c))。氢盐水政府的淀粉酶和脂肪酶水平显著降低HPT + HS组与HPT + NS组()。这些结果表明,氢盐水可能有利于胰腺的内分泌功能的恢复,减少贪污胰腺炎的严重程度。

3.3。血清细胞因子水平

与所以组相比,血清TNF -的水平α,il - 1β,il - 6 HPT组显著增加,HPT + NS组,HPT + HS集团()。此外,氢生理盐水治疗血清细胞因子的部分逆转这些参数;水平明显低于水平与生理盐水治疗后(图3)。我们的研究结果表明,氢盐变弱I / R治疗创伤性胰腺的炎症。

3.4。氧化分子跟压力

脂质过氧化作用的标志,胰腺MDA水平表明氧化应激的程度由I / R损伤引起的。虽然增强了MDA含量在所有受伤的动物,海拔似乎明显被富含氢的盐水治疗(;图4(一))。此外,由于氧化应激过程,在大鼠胰腺组织SOD活性患有I / R损伤与虚假的操作组相比明显下降。富氢生理盐水治疗显著衰减减少(;图4 (b))。此外,胰腺GPx活性明显降低受伤的老鼠;然而,富氢生理盐水治疗有效地改善胰腺GPx活性的(;图4 (c))。我们的研究结果显示,富氢生理盐水治疗变弱I / R胰腺创伤性氧化应激。

4所示。讨论

在目前的研究中,I / R诱导强烈的氧化应激,特点是脂质过氧化物增加,损耗的酶(SOD和氧化酶)抗氧化剂,胰腺。氢盐水治疗产生了强大的抗氧化作用,降低MDA和恢复自由radical-derived产品抗氧化状态的胰腺受I / R。这一发现表明,氢可能发挥其疗效在I / R损伤通过抑制氧化应激的过度激活或纠正prooxidative /抗氧化失衡。

I / R损伤器官移植等所有相关的问题(19)中明显恶化糖尿病患者由于高水平的氧化损伤(20.]。I / R诱发postimplantation胰腺炎的发展,胰腺移植后负责相当大的发病率。移植引起的胰腺炎I / R可能涉及各种因素,从而刺激不同的分子途径,导致不同的生理并发症。氧化应激的作用的I / R损伤胰腺演示。氧自由基诱导细胞和组织损伤不仅通过直接导致细胞膜损伤,还通过提高粘附分子的表达,促进炎性浸润。

炎性浸润中扮演一个重要的角色在胰腺损伤的发展过程中I / R损伤。肿瘤坏死因子等细胞因子-α,il - 1β扮演重要角色,il - 6的感应中性粒细胞激活和渗透,引起局部组织损伤和远程器官损伤21]。在目前的研究中,胰腺组织水平的细胞因子TNF -α,il - 1β,il - 6在I / R-induced胰腺损伤显著升高。脂质过氧化作用引起的活性氧是最重要的机制之一导致细胞损伤。羟基自由基攻击膜相关多不饱和脂肪酸,导致脂质过氧化和细胞损伤22]。MDA是一个氧化DNA损伤的敏感指标。SOD超氧化物阴离子自由基转化为H₂O₂,这是解毒为H₂O GPx等抗氧化酶。因此,这些抗氧化剂酶的缺陷可能导致过度的氧化应激。我们的研究表明,富氢生理盐水治疗显著减轻氧化应激后I / R损伤降低MDA含量,提高SOD、GPx的活动胰腺。

氧化应激及其合成生产活性氧引起的胰腺炎的发病机制中起重要作用的I / R损伤;许多研究人员一直在研究治疗潜在的抗氧化剂。Munoz-Casares的研究表明,褪黑素是一种抗氧化剂预防管理的一些组织氧化应激的标记23];另一项研究表明,褪黑激素也可以提高白细胞介素- 10”(il - 10)、肿瘤坏死因子-α,在血清淀粉酶浓度I / R损伤(24]。然而,表明大多数的抗氧化剂还没有足够的能力保护氧化应激损伤。同时表明,没有证据证明的持续管理antioxidant-based治疗与防治作用,硒、维生素C在重症急性胰腺炎(25]。否则,治疗与抗氧化剂,如β-胡萝卜素,维生素A,维生素E,可能导致生理紊乱和增加一些氧化应激相关疾病的死亡率(26]。

最近,沢等人报道,氢可以选择性地降低细胞毒性氧自由基诱导的I / R损伤(9]。此外,陈等人证明了氢氢生理盐水的盐有保护作用的L-arginine-induced急性胰腺炎由于其抑制氧化应激能力,细胞凋亡,NF-kB激活(27]。氢在细胞膜的能力迅速扩散,与细胞毒性反应ROS,随后抵御氧化损伤。因此,氢被认为是一个建立,安全,方便的抗氧化剂(9]。这个属性的氢提供了有价值的见解的潜在机制改善I / R创伤性移植胰腺炎。先前的研究已经表明,活性氧等^∙哦和氧化应激相关介质急剧增加胰腺移植与18小时冷缺血再灌注后保存在老鼠。符合这些报告,目前的研究还表明,氧化应激相关介质,如MDA、SOD、GPx,经历了在胰腺移植再灌注后显著增加,氢盐导致的和管理这些介质的明显降低。因此,我们推测hydrogen-mediated间隙^∙哦,和其他有害活性氧可能发挥重要作用在缓解胰腺I / R损伤的氧化应激。然而,胰腺移植之外,其他动物模型,如胰腺温暖缺血性损伤模型,应该建立进一步研究氢的作用和机制在胰腺I / R损伤的保护。

5。结论

我们的发现表明氢盐水有抗炎和抗氧化作用。这是一个有前途的治疗移植引起的胰腺炎I / R损伤的老鼠。胰腺I / R损伤,如血管外科、移植和胰腺损伤,经常发生,因为手术或医疗原因。还需要进一步的研究来证实临床价值和揭示了氢生理盐水的详细机制。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

程长,Jian-Dong任贡献同样这项工作,应该视为co-first作者。竹林罗,程长,Jian-Dong任了同样工作。

确认

作者要感谢教授Xue-jun太阳(第二军医大学、上海、中国)提供氢生理盐水和专家技术援助。这项研究是由军方支持的医疗研究基金会(没有。BWS12J020)和四川省卫生部门(没有。110479也没有。2011 yg-a12)。