文摘

在这项研究中,我们调查了第四套(AS-IV)的作用的主要有效成分之一从中草药提纯黄芪在老鼠身上,LPS-induced急性炎症反应在活的有机体内并分析了可能的潜在机制。老鼠被分配到四组:vehicle-treated控制动物;AS-IV-treated动物(10毫克/公斤合著。AS-IV每天腹腔注射6天);LPS-treated动物;和AS-IV + LPS-treated动物。我们发现AS-IV治疗显著地抑制LPS-induced血清MCP-1和TNF水平增加82%和49%,分别。AS-IV也抑制LPS-induced upregulation不同器官的炎症基因的表达。肺mRNA水平的细胞粘附分子,MCP-1, TNFα、il - 6和TLR4明显减弱,肺嗜中性粒细胞浸润和激活强烈抑制,所反映的髓过氧物酶含量下降,当老鼠用AS-IV预处理。也观察到类似的结果心脏、动脉、肾和肝脏。此外,AS-IV显著抑制LPS-induced NF -κB和AP-1 dna结合蛋白在肺和心脏的活动。总之,我们的数据提供了新的在活的有机体内证据表明AS-IV有效抑制LPS-induced调制NF -急性炎症反应κB和AP-1信号通路。我们的研究结果表明,AS-IV可能有用的预防或治疗炎症性疾病。

1。介绍

内皮细胞是炎症反应的主要目标,以及他们的损伤会导致血管病变和器官功能障碍(1]。细菌内毒素LPS直接抒发一些急性炎症反应在内皮细胞,包括生产的细胞粘附分子,如E-selectin,血管细胞粘附molecule-1 (VCAM-1)和细胞间粘附molecule-1 (ICAM-1),和其他促炎介质,如肿瘤坏死因子α、il - 6和单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1)。在一起,这些促炎介质引起白细胞粘附血管和轮回成底层组织,导致内皮损伤和功能障碍与脓毒症(1]。虽然这些促炎介质需要一个适当的宿主防御反应,他们的失调可以导致耐火低血压,心血管hyporeactivity,血管内凝血,多器官功能衰竭和死亡2,3]。

炎症基因转录的规定已被证明是由特定的信号通路和转录因子,如NF -κB和AP-1 [4,5]。特别是,NF -κB通路影响宿主防御传染性病原体通过上调炎症基因导致急性中性粒细胞炎症和全身炎症反应综合征(5]。在正常条件下,NF -κB位于细胞质与抑制剂,以非活性的形式κb在回应刺激,例如,通过有限合伙人,我κB我磷酸化κB激酶。磷酸化后,我κB是ubiquitinated和退化,允许NF -κB把原子核,结合DNA启动子区域,诱发炎症基因转录。各种代理块NF -κB信号已被证明减少促炎介质的表达(6- - - - - -9]。因此,抑制NF -κB在病理炎症激活将保护状态。

黄芪是一种使用最广泛的中国草药治疗许多疾病,包括心血管疾病、肾炎、肝炎、糖尿病(10]。也已经在欧洲和美国多年来作为食品补充剂。从药理研究和临床实践表明,证据黄芪具有广泛的活动,包括免疫调节(11,12[]、心血管保护13- - - - - -15],抗炎作用[16- - - - - -18],hepatoprotection [19,20.)、糖尿病(21,抗癌22),和神经保护23]。

的生物活性成分黄芪根代表三个类化合物:皂苷、多糖和黄酮类化合物(24]。通过化学退化和13C核磁共振检查,第四套的结构(AS-IV) 3点——确定β-D-xylopyranosyl-6-O -β-D-glucopyranosyl-cycloastragenol (C41H68年O14;MW = 784.9) (25]。的主要有效成分之一黄芪,AS-IV用作标记质量评价的特征黄芪在中国药典和已被证明施加强有力的心血管和抗炎作用6,10,26- - - - - -30.]。我们曾表明AS-IV抑制LPS和肿瘤坏死因子α全身的粘附分子表达和NF -κ人工培养的内皮细胞(B激活6]。然而,在活的有机体内目前缺乏证据支持这种活动。因此,在这项研究中我们调查AS-IV是否可以抑制LPS-induced实验小鼠急性炎症反应。

2。材料和方法

2.1。动物和实验过程

女性C57BL / 6 j小鼠,12周大,体重20 g,买来杰克逊实验室(巴尔港,我)和位于特定的无菌条件和温度和湿度环境(12 h光/暗周期)和无限制地自来水和其它5001周的饮食(麦迪逊,哈伦Teklad WI)。调查符合指导实验室动物保健和使用的综述了NIH,所有动物程序和俄勒冈州立大学机构批准的动物保健和使用委员会。

AS-IV购买质量植物化学物质LLC(新泽西爱迪生),和股票的解决方案是用丙二醇(西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州)和汉克的进一步稀释缓冲盐溶液(哈佛商学院)。有限合伙人(血清型055:B5大肠杆菌,西格玛奥德里奇)股票的解决方案是在哈佛商学院准备的。老鼠被随机分配到4组如下:(i)控制动物收到车辆的日常ip注射丙二醇与哈佛商学院6天后跟一个i.p。哈佛商学院注射;(2)AS-IV-treated动物收到10毫克/公斤合著AS-IV每日ip 6天一个i.p紧随其后。哈佛商学院注射;(3)LPS-treated动物收到每日腹腔注射丙二醇与哈佛商学院6天后跟一个ip注入0.5μg / g合著的有限合伙人;及(iv) AS-IV + LPS-treated动物收到了6天每天AS-IV ip单ip注射LPS紧随其后。动物是牺牲了哈佛商学院或有限合伙人注射后3小时。根据我们之前的观察,3 - h时间点和有限合伙人剂量为0.5μg / g b.w.选择(31日]。在一些研究中,老鼠被随机分配接受ip注射LPS和牺牲后1、3、8、24小时。每组由4到5的动物。牺牲后,血液和组织收集进行进一步分析。

2.2。血清炎症介质

血清浓度MCP-1, TNFα、sVCAM-1 sICAM-1被定量测定比色夹心ELISA(研发系统、明尼阿波利斯、MN)。的敏感性分析是MCP-1 2 pg / mL, TNF 5 pg / mLα,30 pg / mL sVCAM-1 sICAM-1。

2.3。组织mRNA水平的炎症介质

从不同器官分离总RNA使用试剂盒试剂(生活技术,培育城市,CA)。互补脱氧核糖核酸的合成进行了使用高容量cDNA归档工具(技术)。信使rna水平的VCAM-1、ICAM-1 E-selectin、P-selectin MCP-1, TNFα,il - 6、髓过氧物酶(MPO),toll样receptor-4(TLR4),glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)被实时qPCR量化。所有的引物和探针购买工具包(分析需求,生活技术)。提供的化验是20 x PCR引物的混合物和TaqMan小沟粘合剂6-FAM dye-labeled探针与nonfluorescent 3′末端淬火。TaqMan定量PCR(40周期在95°C 1分钟15秒和60°C)进行使用TaqMan普遍PCR反应混合液(生命技术)在96 -孔板ABI棱镜7500序列检测系统(技术)。获得相对量化,两条标准曲线和一个目标基因在每个板块构造和内部控制GAPDH基因。标准曲线被绘制生成阈值周期值数量的日志输入cDNA,用来量化目标基因的表达GAPDH基因在同一样本。归一化后的内部GAPDH在每个示例,结果表示为GAPDH百分比或褶皱的控制。

2.4。肺蛋白髓过氧物酶的浓度

右肺叶的一部分是均质,和肺组织匀浆的胞质部分准备使用核提取试剂盒(活跃的主题,卡尔斯巴德,CA)。肺胞质MPO是量化使用MPO酶联免疫吸附试验设备(Hycult生物技术、普利茅斯会议上,PA)根据制造商的指示。每个样本归一化的肺MPO浓度与胞质蛋白浓度和表达为ng MPO /毫克组织蛋白质。

2.5。核转录因子

核从肺和心脏提取准备使用核提取试剂盒(活动主题)。分析的核转录因子的激活,ELISA-based化验(活动主题)是用来确定NF - dna结合活性κB (p65)和AP-1 (c-fos)。证实了绑定的特异性竞争与野生型或突变的寡核苷酸。

2.6。统计分析

数据计算意味着±SEM和分析通过方差分析与费舍尔PLSD事后考验。统计学意义是 。

3所示。结果与讨论

急性炎症的病理生理学引发的细菌内毒素LPS的特点是生产多种促炎细胞因子和趋化因子、粘附分子的表达,中性粒细胞和单核细胞的浸润炎症组织。由于感染性休克的病理的复杂性,主要工作都集中在识别新的抗炎药物,防止促炎的过程的早期阶段基因表达的关键炎症介质(32]。

我们曾表明AS-IV抑制LPS和肿瘤坏死因子α全身单核细胞粘附分子表达和顺向依从性,通过调节NF -κ人工培养的内皮细胞(B信号通路6]。我们现在提供新的证据表明,AS-IV展品强抗炎活动在活的有机体内通过衰减LPS-induced通过抑制NF -急性炎症反应κB -和AP-1-mediated炎性信号通路在老鼠身上。

3.1。AS-IV抑制LPS-Induced增加血清MCP-1和肿瘤坏死因子α在老鼠身上

治疗小鼠AS-IV 6天没有影响体重的变化而HBSS-treated控制动物。之前的平均体重为20.8±0.6克和20.8±0.5 g日AS-IV治疗。控制动物,平均体重为20.2±0.3克,19.9±0.4克,日- hbs治疗。我们第一次调查的影响在LPS-induced AS-IV系统性炎症反应通过确定血清水平的MCP-1, TNFα和可溶性细胞粘附分子,sVCAM-1 sICAM-1。治疗小鼠AS-IV仅6天没有影响血清相比,这些炎症介质水平HBSS-treated控制动物。正如所料,3小时有限合伙人注射后,显著增加血清MCP-1和TNF水平α观察(图1)。有趣的是,预处理的动物AS-IV显著抑制LPS-induced增加血清MCP-1(图1(一))和肿瘤坏死因子α(图1 (b))分别82%和49%。具体来说,MCP-1水平分别为15.2±2.0 ng / mL AS-IV + LPS处理小鼠,相比81.8±9.5 ng / mL动物只接受有限合伙人;肿瘤坏死因子α水平142±9 pg / mL 35和279±pg / mL,分别为( , )。然而,AS-IV没有抑制LPS-induced增加血清sVCAM-1和sICAM-1浓度(数据没有显示)。

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图1
AS-IV抑制LPS-induced增加血清MCP-1和肿瘤坏死因子α在老鼠身上。老鼠被随机分配到4组如下:(i)控制动物收到车辆的日常ip注入hbs 6天一个i.p紧随其后。哈佛商学院注射;(2)AS-IV-treated动物收到10毫克/公斤合著AS-IV每日ip 6天一个i.p紧随其后。哈佛商学院注射;(3)LPS-treated动物每天收到ip注入车辆hbs 6天后跟一个ip注入0.5μg / g合著的有限合伙人;及(iv) AS-IV + LPS-treated动物收到了6天每天AS-IV ip单ip注射LPS紧随其后。三个小时后,哈佛商学院或注射LPS,动物被牺牲和血液收集。血清MCP-1 (a)和肿瘤坏死因子α(b)由ELISA测定。数据显示的平均值±SEM每组五个动物。 相比动物只接受有限合伙人。
3.2。AS-IV抑制LPS-Induced Upregulation炎症基因表达的小鼠肺和其他组织

调查是否AS-IV抑制LPS-induced急性炎症反应在小鼠器官,我们评估基因表达的炎症介质在肺,心,主动脉,肾脏和肝脏LPS-exposed老鼠,使用实时qPCR分析。治疗小鼠AS-IV本身并不影响基因表达的细胞粘附分子和促炎介质(数字2- - - - - -6)。正如所料,治疗的老鼠与LPS 3小时强烈调节炎症基因表达的所有组织检查(数字2- - - - - -6)。预处理的老鼠AS-IV显著抑制粘附分子的LPS-induced增加肺mRNA水平:VACM-1了73%,ICAM-1了60%,E-selectin了79%,P-selectin71%,其他促炎介质:MCP-1了85%,肿瘤坏死因子α了42%,il - 6了83%,TLR430% ( , )(图2)。类似的抑制效应AS-IV也观察到心脏(图4),主动脉(图5)、肾(图6),肝脏(数据未显示)。

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图2
AS-IV抑制LPS-induced炎症基因表达的小鼠肺。老鼠被随机分配到4组如下:(i)控制动物收到车辆的日常ip注入hbs 6天一个i.p紧随其后。哈佛商学院注射;(2)AS-IV-treated动物收到10毫克/公斤合著AS-IV每日ip 6天一个i.p紧随其后。哈佛商学院注射;(3)LPS-treated动物每天收到ip注入车辆hbs 6天后跟一个ip注入0.5μg / g合著的有限合伙人;及(iv) AS-IV + LPS-treated动物收到了6天每天AS-IV ip单ip注射LPS紧随其后。三个小时后,哈佛商学院或注射LPS,动物被牺牲了收集和组织。总RNA从肺孤立。使用实时定量PCR炎症基因表达是量化。正常化后内部控制GAPDH基因,为每个目标基因的结果表示为GAPDH百分比。数据显示意味着±5动物的SEM /组。 相比动物只接受有限合伙人。
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图3
AS-IV抑制LPS-induced基因和蛋白质表达的髓过氧化酶(MPO)在小鼠肺。面板(a),老鼠被随机分配接受ip注射LPS和牺牲后1、3、8、24小时。面板(b)和(c),老鼠被视为中描述的传奇人物2。从肺总RNA和胞质蛋白分离。肺MPO基因表达是量化描述的传奇人物2。肺MPO蛋白质决心使用酶联免疫试剂盒详细描述部分2。信使rna的数据显示为褶皱控制内部控制规范化后GAPDH基因。数据显示意味着±4到5动物的SEM /组。 相比动物只接受有限合伙人。
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图4
在老鼠心中AS-IV抑制LPS-induced炎症基因的表达。老鼠被视为中描述的传奇人物2。总RNA分离的心,和炎症基因表达是量化描述的传奇人物2。数据显示意味着±5动物的SEM /组。 相比动物只接受有限合伙人。
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图5
在小鼠主动脉AS-IV抑制LPS-induced炎症基因的表达。老鼠被视为中描述的传奇人物2。总RNA从主动脉分离,炎症基因表达是量化描述的传奇人物2。数据显示意味着±5动物的SEM /组。 相比动物只接受有限合伙人。
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图6
AS-IV抑制LPS-induced炎症基因表达在小鼠肾脏。老鼠被视为中描述的传奇人物2。总RNA从肾脏孤立,和炎症基因表达是量化描述的传奇人物2。数据显示意味着±5动物的SEM /组。 相比动物只接受有限合伙人。
3.3。在肺AS-IV抑制LPS-Induced嗜中性粒细胞浸润和激活

多形核中性粒细胞(中性粒细胞)和其他吞噬细胞,单核巨噬细胞等,发挥着至关重要的作用在急性炎症和组织损伤,我们评估肺髓过氧化酶(MPO),证据确凿的PMN-specific生物标志物(31日,33,34后),有限合伙人的挑战。MPO迅速释放中性粒细胞激活时,触发转录upregulation mRNA和MPO的新蛋白质合成。因此,upregulationMPOmRNA水平也反映了中性粒细胞激活在急性肺部炎症反应(31日,33]。如图3(一个)、肺MPO信使rna在非常低的水平控制动物;然而,有限合伙人治疗诱导时间upregulation肺MPO基因的表达,达到3 h和仍然可以提高到8 h,然后24小时后下降。这些数据表明渗透和LPS-treated老鼠的肺间质中性粒细胞的激活时间的方式,这是符合我们之前的结果表明TNFα治疗诱导MPO信使rna和蛋白质水平的增加,酶活性和形态的积累在小鼠肺组织中性粒细胞(33]。然而,预处理小鼠AS-IV显著抑制LPS-induced增加MPO信使rna水平27% ( , )(图3 (b))。这进一步证实了肺MPO蛋白质水平,从6±1增加ng /毫克组织蛋白质控制动物325±67 ng /毫克组织蛋白质LPS-treated动物和显著减少AS-IV治疗80%至71±9 ng /毫克组织蛋白( , )(图3 (c))。随着肺中性粒细胞激活在急性炎症的主要目标(31日,33,34),这些数据支持了这样的观点,即AS-IV抑制中性粒细胞浸润肺/招聘LPS-induced急性炎症反应期间和随后的组织损伤。

3.4。AS-IV抑制LPS-Induced NF -κB和AP-1 dna结合蛋白在小鼠肺和心脏的活动

我们认识到,NF -κB在LPS-induced转录调控中起着重要的作用,大多数炎性基因导致感染性休克的发展,多器官功能衰竭和死亡(5,32]。临床相关性,NF -κB激活在急性炎症和脓毒症患者增加,与临床严重程度和死亡率(35]。调查可能的信号通路介导的抑制作用AS-IV LPS-induced炎症基因转录,我们评估了NF -核内容κB亚基,p65 AP-1亚基,c-fos,指标的核易位和激活的转录因子。NF - dna结合活性κB (p65)和AP-1 (c-fos)检测到低水平的控制和AS-IV-only-treated动物的肺和心脏组织。AS-IV独自没有造成NF -κB或AP-1激活肺或心脏(图7)。有限合伙人NF -明显增加κB在肺和心脏活动15.8和11.5倍,分别;AS-IV治疗显著抑制NF - LPS-induced激活κ分别为42%和54%,( , )(图7(一))。有限合伙人也大力增加AP-1激活了9.6和25.3倍,分别在AS-IV治疗显著降低LPS-induced AP-1活动41%和49%,分别在两个肺和心脏 , )(图7 (b))。

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图7
AS-IV抑制LPS-induced NF -κB (a)和AP-1 (B) dna结合蛋白在小鼠肺和心脏的活动。老鼠被视为中描述的传奇人物2。核中提取分离得到肺和心脏。dna结合活性的NF -κB (p65)和AP-1 (c-fos)被ELISA量化。数据显示意味着±5动物的SEM /组。 相比动物只接受有限合伙人。

我们的数据提供了新的证据,在LPS-induced AS-IV炎症基因表达的抑制作用主要是通过调节NF -κB和AP-1 dna结合活性。这些数据表明,AS-IV抑制NF -的能力κB和AP-1途径是主要的潜在机制导致其抗炎潜力在活的有机体内。良好的文档记录,“经典”TLR4在LPS信号通路中起着重要作用脓毒症(36]。TLR4承认有限合伙人从革兰氏阴性细菌和介导激活我的先天免疫反应κB激酶(IKK)和增殖蛋白激酶激酶(MKK),进而激活NF -κB和AP-1,分别5,36]。我们的研究结果进一步表明,AS-IV抑制LPS-inducedTLR4基因表达在肺部和心脏的30%和65%,分别为(数字2和4),这是符合其对NF -抑制的影响κB和AP-1激活在同一个组织。这些数据表明,抑制TLR4表达的机制之一可能是AS-IV影响这些通路的上游目标。一些在体外研究表明,AS-IV激活PI3K / Akt通路(29日),这是众所周知的,负调控LPS-induced调制NF -急性炎症反应κB和AP-1通路(9,37,38]。因此,PI3K / Akt激活可能是一个潜在的机制AS-IV的抗炎活性。此外,作为一种新颖抗氧化剂(39,40),AS-IV可能调节LPS-induced活性氧的形成和随后的激活redox-sensitive NF -κB和AP-1各级通路(40]。然而,所有这些机制在体外需要进一步调查体内。

我们研究的一个限制是,我们必须通过ip应用AS-IV注入生物,因为它是不佳。先前的研究在狗和老鼠发现,只有7.4%和3.7%,分别口服补充AS-IV被吸收(41,42]。这主要是由于AS-IV低脂肪的溶解性和低透光率在小肠43]。事实上,在中医AS-IV是临床上用于静脉注射(注射)治疗。在输液注射0.75毫克/公斤的AS-IV老鼠和狗0.5毫克/公斤,最大血浆浓度达到3.79µ和4.39克/毫升µg / mL,分别和消除半衰期( 分别是98分钟和60分钟(44,45]。最高浓度被发现在肺和肝组织(2.8 - -2.9µg / g) 1.5毫克/公斤AS-IV输液注射后,而心脏,肌肉,皮肤,肾脏含有适量(0.16 - -1.0µg / g) (45]。作为黄芪和AS-IV现在广泛应用于中药,也可以在欧洲和美国作为膳食补充剂,化学修改提高AS-IV的绝对生物利用度,同时保持其生物活性可能是未来研究的焦点。

4所示。结论

总之,我们的数据提供了新的证据,AS-IV抑制LPS-induced急性炎症反应在活的有机体内通过调节NF -κB和AP-1信号通路。我们的结果可能导致识别AS-IV天然化合物或化学提取药物,可能有助于预防或治疗炎性疾病。我们相信,其治疗效果的分子基础是有趣的,需要进一步调查。

缩写

AP-1: 激活蛋白1
AS-IV: 第四套
合著。 体重
GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶
ICAM-1: 细胞间粘附molecule-1
i.p。 腹腔内
注射。 静脉注射
IKK: 我κB激酶
IL: 白介素
有限合伙人: 脂多糖
MCP-1: 单核细胞化学引诱物蛋白1
MPO: 髓过氧物酶
NF -κB: 核转录因子κB
中性粒细胞: 多形核中性粒细胞
氧化还原: Reduction-oxidation
ROS: 活性氧
sICAM-1: 可溶性细胞间粘附molecule-1
sVCAM-1: 可溶性血管细胞粘附molecule-1
TLR4: toll样receptor-4
肿瘤坏死因子α: 肿瘤坏死因子α
VCAM-1: 血管细胞粘附molecule-1。

免责声明

这个工作的内容是完全的责任作者,不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Wei-Jian张设计并进行实验;鲍尔兹·费尔Wei-Jian张和分析数据及和批准最终的论文中写道。

确认

这项工作是由它卓越中心的格兰特P01 AT002034来自美国国立卫生研究院。作者感谢斯蒂芬·劳森仔细校对。