文摘

背景。呼吸道感染哮喘急性加重的主要原因,中性粒细胞炎症占主导地位和与类固醇难治性哮喘相关联。结构在哮喘气道细胞不同于nonasthmatics;然而,如果中性粒细胞不同是未知的。我们研究了中性粒细胞在病人有良好的免疫反应()和次优()控制哮喘症状。方法。外周血中性粒细胞从(ACQ < 0.75,),(ACQ > 0.75,),而健康对照组(HC) (与细菌(有限合伙人(1)刺激μg / mL), fMLF(100海里)),和病毒(咪喹莫特(3μR848 (1.5 g / mL)μg / mL),聚我:C (10μg / mL))代理人或住鼻病毒(RV) 16 (MOI1)。浮在表面的游离收集1 h后中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)和基质金属蛋白酶- 9 (MMP)测量或CXCL8 24小时后释放。结果。本构不增强中性粒细胞与HC相比。fMLF刺激中性粒细胞从但不是产生50%的HC的水平。fMLF诱导MMP-9受损和而HC。fMLF刺激CXCL8但不是MMP-9呈正相关,FEV₁和FEV₁/ FVC。和反应类似于其他刺激。结论。循环中性粒细胞哮喘是不同的;然而,这可能是有关气流限制而不是哮喘控制。

1。介绍

主要治疗哮喘是一种长效的组合受体激动剂放松平滑肌在航空公司和皮质类固醇减少肺部炎症(1]。然而,即使在高一些病人服用这些药物的剂量仍没有响应。这些不受控制或难以治疗哮喘患者通常有一个中性表型(2,3];然而一群患者类固醇耐火嗜酸性表型也存在(4,5]。这些病人不仅无法获得救济也遭受更频繁和严重的症状加重(6,7]。

哮喘发作可能引发的一系列provokers最常见的呼吸道感染。病毒感染已被广泛研究和鼻病毒(RV)是最常检测到的病毒在加剧成人(8]。细菌感染没有严格检查但也似乎是临床上重要的(9]。呼吸道感染高威胁来自不受控制的哮喘病人,因为他们可以触发发作严重,总是把有限的病人住院治疗方案(10,11]。

中性粒细胞是体内最丰富的免疫细胞;他们的主要效应的作用是控制感染。CXCL8是一个强有力的中性粒细胞化学引诱物,中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)有强大的抗菌性,和基质金属蛋白酶- 9 (MMP)激活抗菌肽是重要的,所有这些由中性粒细胞释放。瞬态嗜中性和中性粒细胞炎症免疫反应的正常阶段病原体(12];然而,哮喘慢性气道炎症发生在稳定(2,13,14]。接受研究的205名患者中,多元线性回归表明气道嗜中性类固醇使用(没有联系15),和哮喘病人气道嗜中性发生在皮质类固醇天真(16]。此外,中性粒细胞数(2)和中性粒细胞炎症介质如CXCL8 (17),不18],MMP-9 [19)升高严重哮喘患者的气道和这些水平与疾病严重程度(2,20.]。

它已经表明,结构细胞,上皮细胞和平滑肌细胞等,在哮喘气道nonasthmatic相比是不同的细胞在形态和功能(21- - - - - -24]。相信这些功能异常驱动其他航空公司的变化引起哮喘的标志。我们之前发现循环中性粒细胞从哮喘患者改变他们对病毒的反应模拟,R848通过产生高浓度的CXCL8 [25),和表达映射在中性粒细胞数量性状发现免疫功能紊乱特征相关的变体(26]。然而,到目前为止还没有被调查,如果患者中性粒细胞功能不同症状控制不佳,尽管服用中度到高剂量类固醇治疗。嗜中性粒细胞功能障碍可能发生在这些患者会在某种程度上,占更大的这组患者的炎性介质加载。

中性粒细胞在骨髓中产生和有一个相对较短的寿命27,28]。鉴于我们之前发现的不同反应肺与循环中性粒细胞(29日),以确定如果中性粒细胞已经进入肺,和之前不同的有效控制哮喘我们比较响应对细菌和病毒模拟循环中性粒细胞避免任何潜在的肺部炎症环境的干扰。我们提出,从有效控制哮喘患者中性粒细胞有先天免疫缺陷可能使pathogen-induced发作。

2。材料和方法

2.1。志愿者招募

这个项目是人类研究伦理委员会批准,悉尼大学的毕业典礼之前。志愿者医生诊断哮喘,稳定的疾病,没有报道研究招募了呼吸道感染的症状。健康的志愿者还被招募的控制。参与者需要18岁以上,英语流利。排除标准包括如果他们怀孕了,晕倒在静脉穿刺过程中,或有血液传播感染或条件。所有志愿者提供书面知情同意和被要求完成一个标准化的问卷关于年龄、性别、哮喘症状,哮喘药物的使用,和吸烟史。病人还完成了基线呼吸量测定法在1秒用力呼气量(FEV₁)、用力肺活量(FVC)。参与者与哮喘被要求保留他们的短效受体激动剂至少6小时,24小时长效受体激动剂和吸入激素(ICS)。

2.2。分类的哮喘患者

参与者与哮喘分层基于他们的哮喘控制问卷(ACQ)得分30.]。减少ACQ < 0.75点是用来识别控制哮喘30.]。参与者与哮喘控制不佳(ACQ≥0.75)也有变量气流限制(PD的证据₁₅< 15毫升食盐水或标准挑战代理,postbronchodilator FEV的变化₁> 200毫升的12%,> 12%最大流量变化至少1周,或FEV₁可变性> 12%的两个测量在两个月内)和服用至少吉娜步骤3维护联合治疗。提供了患者信息表1和2。

2.3。中性粒细胞隔离

从外周血中性粒细胞分离收集从志愿者和没有哮喘修改标准协议(29日,31日,32]。短暂,40毫升的血混合着10毫升酸柠檬酸葡萄糖(ACD), 10毫升的磷酸缓冲盐(PBS)(美国Gibco,卡尔斯巴德,CA)和6毫升的10%右旋糖酐(美国圣安娜议员生物医学)和离开20分钟在室温下沉淀发生。顶层是删除,覆盖聚蔗糖Paque-PLUS(通用电气医疗集团,小都,英国),490克和离心10分钟。浮在表面的丢弃,粒细胞的颗粒细胞是resuspended剩下30秒的无菌水溶解红细胞渗透性与等量重建前2 x PBS。细胞培养30分钟在4°C CD16磁珠(Miltenyi研究,Bergisch,德国)运行通过一个磁柱前按照制造商的指示。之前的协议的优化显示典型的纯度是99%或更大的苏木精和伊红染色。主要的污染细胞是嗜酸性粒细胞(< 1%)。

2.4。RV16

RV16被塞巴斯蒂安·约翰斯顿教授慷慨捐赠,英国伦敦帝国理工学院。RV16是生长在海拉细胞通过标准程序和传染性滴定度由滴定分析描述(33]。

2.5。刺激中性粒细胞toll样受体(TLR)受体激动剂和RV16

中性粒细胞是resuspended 1%胎牛血清(的边后卫)(Glendarach生物制品,墨尔本,澳大利亚),1% 1 M玫瑰(Gibco),和1%的青霉素和链霉素RPMI 1640 (Gibco) 1×10⁶细胞/毫升。细胞离开如果与EC(负控制)或刺激₅₀基于剂量反应曲线的每个toll样受体激动剂浓度为CXCL8生成发布(数据未显示):1μg / mL有限合伙人(西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州,美国),3μg / mL咪喹莫特(美国圣地亚哥Invivogen), 1.5μg / mL R848 (Invivogen)和10μg / mL聚我:C(西格玛奥德里奇),除了fMLF(西格玛奥德里奇)(100海里)是基于先前的报道(34]。中性粒细胞与RV16也刺激感染复数(MOI) 1感染性粒子/细胞以前公布的(25,35]。细胞培养在37°C公司为5%₂为NE和MMP-9测量1小时或24小时CXCL8测量。浮在表面的游离细胞和中性粒细胞颗粒被收集并存储在−80°C进行分析。

2.6。CXCL8酶联免疫吸附试验(ELISA)

CXCL8生产使用夹心ELISA测定重复。特定的ELISA试剂盒的研发系统(明尼阿波利斯,美国)使用根据制造商的指示。检出限为15.6 pg / mL。

2.7。中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)活性测定

NE活动从开曼群岛以重复使用荧光测定的化学物质(安阿伯市,美国)根据制造商的指示。荧光读数从样本与已知浓度的标准曲线不确定浓度。检出限为3.1 ng / mL。

2.8。MMP-9 Zymography

bicinchoninic酸测定(西格玛奥德里奇)运行所有样本按照制造商的指示获得总蛋白浓度。Zymography是根据以前公布的方法(36]。总蛋白质的短暂,200 ng加载到明胶1%聚丙烯酰胺凝胶的每个车道。这种凝胶是CaCl然后蛋白酶激活₂激活前一夜之间缓冲与考马斯亮蓝染料染色。的决心是乐队pro-MMP-9使用大小标记和MMP-9标准。微执行与Carestream分子成像软件拍摄的图像在一个柯达形象站综合科学(澳大利亚)车来确定相对褶皱变化相比,媒体控制。

2.9。数据和统计分析

统计分析,数据是正常(日志₁₀)在正常测试之前进行(Kolmogorov-Smirnov达和皮尔森和Shapiro-Wilk正常测试;GraphPad棱镜6)。他们被视为正态分布是否通过的三个正常测试。一个配对以及或单向方差分析(方差分析)与Dunnett执行后续测试后如果数据正态分布或者Wilcoxon匹配弗里德曼以及或测试邓恩的多重比较测试数据被非参数。双向方差分析与图基的后续测试进行了比较健康的控制,控制哮喘,有效控制哮喘。对于一些数据集,进行相关性分析。确定了重大的改变。

3所示。结果

3.1。病人的特点

研究临床特点人口详细表1和2。患者所有年龄和性别匹配的平均年龄大约60年,每组由主要的男性。根据定义,ACQ是不同的两个哮喘组(好症状控制:平均0.32,次优的症状控制:指1.33)没有FEV的差异₁%三个病人组之间的预测;然而FEV₁/ FVC %比例显著减少控制和有效控制哮喘患者与健康对照组(表1)。大多数参与者控制哮喘患者服用短效受体激动剂(82%)(表1)只有55%的每日服用一个包含吸入器的ICS(表2)。然而,这组除1例联合治疗间歇性地在过去的12个月里(表2)。所有的参与者与次优控制服用短效哮喘症状受体激动剂(表1随着联合治疗(表)2)。

3.2。微分CXCL8释放从中性粒细胞哮喘患者

所有细菌和病毒模拟包括有限合伙人,fMLF咪喹莫特,R848和保利我:C诱导显著CXCL8从中性粒细胞释放与健康对照组和控制,有效控制哮喘患者(数字1(一)和1 (b))。有趣的是,RV16诱导CXCL8只有在中性粒细胞从控制和有效控制哮喘患者(图1 (c))。从有效控制哮喘患者中性粒细胞缺乏CXCL8回应fMLF大约一半与健康对照组相比(图1(一))。还有一个趋势来自控制哮喘患者中性粒细胞释放更少的CXCL8回应fMLF是类似的大小从有效控制哮喘患者中性粒细胞(图1(一))。所有其他兴奋剂诱导类似生产CXCL8所有三组之间。

3.3。微分不释放从中性粒细胞哮喘患者

fMLF是唯一病原体模仿从中性粒细胞诱导NE在所有三组(图2(一个))。有趣的是,我们发现,在基线,中性粒细胞从控制哮喘患者增强东北释放健康对照组相比(图2(一个))。此外,这种差异还发现当刺激fMLF(图2(一个))。RV16没有诱导不从中性粒细胞释放的三组。

3.4。微分MMP-9释放从中性粒细胞哮喘患者

有限合伙人,fMLF,咪喹莫特诱导MMP-9从中性粒细胞释放所有三组(数字3(一个)和3 (b))。类似CXCL8数据,fMLF刺激中性粒细胞从控制和有效控制哮喘患者缺乏MMP-9响应相对于健康对照组(图3(一个))。有趣的是,R848选择性地诱导MMP-9在中性粒细胞来源于控制和有效控制哮喘患者,但不是在健康对照组(图3 (b))。RV16没有诱导MMP-9从中性粒细胞释放的三组调查。

3.5。FEV₁%预测和FEV₁与fMLF诱导CXCL8 / FVC %比例相关

进一步调查,如果差异fMLF诱导CXCL8和MMP-9控制和控制哮喘患者气道阻塞有关,我们进行了相关分析。我们发现,FEV₁%预测和FEV₁/ FVC %比例呈正相关,fMLF诱导CXCL8释放(数字4(一)和4 (b)),但不是fMLF诱导MMP-9释放(数字4 (c)和4 (d))。ACQ之间没有相关性和fMLF诱导CXCL8 (0.106)或MMP-9 (,)。包年之间没有相关性被发现历史和fMLF诱导CXCL8 (,)或基底CXCL8 (,)。同样,之间没有相关性被发现日常ICS剂量和fMLF诱导CXCL8 (,)或基底CXCL8 (,)。我们还发现基底CXCL8释放和FEV之间没有相关性₁%预测(,)或FEV₁/ FVC %比(,)。

4所示。讨论

在这项研究中我们发现,从患者中性粒细胞哮喘fMLF与健康对照组相比有不同的反应。然而,我们没有看到从患者中性粒细胞差异——与有效控制哮喘。RV16诱导CXCL8和R848诱导MMP-9发生于——只有中性粒细胞和有效控制哮喘组而不是中性粒细胞从健康控制。fMLF刺激导致的中性粒细胞缺乏MMP-9生产控制哮喘患者和缺乏CXCL8 MMP-9在有效控制哮喘患者。此外,东北是不同的监管和控制哮喘患者持续升高。增加本构释放最有可能占fMLF刺激中性粒细胞从控制哮喘患者中观察到的差异。我们还发现fMLF诱导CXCL8 MMP-9释放与肺功能但不ACQ、吸烟史、或ICS使用。

气道上皮细胞和平滑肌细胞在哮喘(从根本上改变了21- - - - - -24),即使增长几个周期在体外他们剥夺了在哮喘气道改变信号,我们提出,在中性粒细胞抗菌功能同样会不正常有效控制哮喘。我们提出将在循环中性粒细胞缺乏免疫反应的有效控制哮喘患者可能会导致更严重或持久的呼吸道感染,最终恶化了。这项研究提供了有价值的和新奇的见解循环中性粒细胞炎症反应。

在这项研究中我们调查很感兴趣如果中性粒细胞进入气道组织之前已经失调可加剧哮喘的患者炎性改变的信号。因此,我们选择使用外周血中性粒细胞,我们认为适合的调查可能的这些细胞的差异。由于中性粒细胞释放到骨髓的循环我们相信这细胞群最好的反映了中性粒细胞功能没有进一步分化信号期间提供外渗和气道腔。

房车是一个主要的沉淀剂viral-induced在哮喘急性加重(8]。中性粒细胞迁移到航空公司在RV感染(38,39),但他们的角色在抗病毒免疫中尚不清楚是他们感染RV的能力尽管表达ICAM-1 [40),附件蛋白的血清型房车用于这项研究。目前尚不清楚为什么房车诱导CXCL8在这项研究中。没有复制我们曾表明,房车绑定ICAM-1足以导致一些细胞因子释放41但并不是所有的肺细胞[42]。toll样受体(通常),尤其是TLR 3, TLR 7, TLR 8,检测病毒,通常他们的激活导致典型的天生的激活。可能如果房车吞噬,TLR 3, TLR 7, TLR 8出现在吞噬小泡可能被激活。或者细胞表面TLR 3 (43,44可以发现病毒的存在。

我们发现RV16可以引发哮喘CXCL8中性粒细胞是小说,虽然小感应观察的临床意义是有问题的,需要小心地解释。然而,房车的滴定度在活的有机体内可能远高于我们过去吗在体外(报道1000 TCID /毫升在鼻灌洗液45]);因此,我们推测RV可能发生更大的反应在活的有机体内。也是合理的,更严重的疾病患者更敏感,相对较小的炎性细胞因子的变化生产由于更多的中性粒细胞的累积效应。RV16 CXCL8感应的失调可能在哮喘急性加重的发病机制中发挥作用和持续的气道嗜中性,但这需要进一步调查。

fMLF, fMLF细菌衍生蛋白质和配体的受体刺激中性粒细胞迁移,产生炎症介质,并释放颗粒和活性氧46]。我们观察到兴奋剂和疾病的具体应对fMLF的变化。我们相信这些变化并不相关fMLF受体表达因为在同一个控制哮喘患者;fMLF诱导CXCL8释放是大约一半的反应健康对照组但不释放增强。

NE和MMP-9蛋白酶和中性粒细胞嗜苯胺蓝的和白明胶酶颗粒,分别为(47]。像所有的蛋白酶,需要严格监管,确保本地化的酶的感染;否则会发生组织损伤。我们观察到,即使在相同的刺激条件下,NE和MMP-9释放不同的监管,即缺乏fMLF诱导MMP-9响应但增广fMLF诱导不响应控制哮喘患者的中性粒细胞。这个微分调节的位置可能是由于这些产品在不同类型的颗粒和不同倾向从中性粒细胞在某些刺激条件下被释放。然而,这些机制的进一步研究是本研究的范围之外,可能是未来研究的课题。

有趣的是,我们发现了类似的患者中性粒细胞反应之间的有效控制哮喘和控制哮喘,特别是缺乏fMLF诱导CXCL8和MMP-9释放。嗜中性粒细胞功能是随着年龄增长而下降,这些变化包括吞噬能力降低(48,49],减少脱粒[50),减少了生成活性氧的能力(48]。在以往的研究中我们发现,中性粒细胞从哮喘患者平均年龄35岁有一个更大的倾向发布CXCL8 R848刺激相比nonasthmatic控件;然而,其他兴奋剂包括fMLF两组之间的相似(25]。在这项研究中,参与者的平均年龄62岁,我们没有观察到增强R848诱导CXCL8从中性粒细胞,而类似哮喘组和健康对照组之间的水平。此外,我们注意到缺乏CXCL8和MMP-9释放fMLF刺激可能表明,中性粒细胞功能下降是在那些更大的疾病,尤其是在识别的细菌。

航空公司的研究报告CXCL8水平与FEV负相关₁在哮喘的个体3,51,52]。这些研究测量CXCL8在支气管肺泡灌洗(BAL)和诱导痰标明总炎性介质加载在航空公司给的指示来源。在这项研究中我们发现,基底CXCL8释放中性粒细胞与肺功能不相关,表明中性粒细胞可能不是主要来源的细胞因子落下帷幕。然而,fMLF诱导CXCL8与FEV呈正相关₁和FEV₁/ FVC。通过FPR1受体fMLF刺激中性粒细胞。有趣的是膜联蛋白A1也激活fMLF受体(53]。皮质类固醇诱导膜联蛋白A1是一个主要的抗炎机制是有趣的推测,fMLF也可能表明类固醇不敏感的响应能力。

我们的研究也有一些局限性;参与者的数量很小,哮喘控制不佳的患者可能是异质的。一些参与者一个ACQ > 1.5,这是减少点以前相信,哮喘控制很差(30.]。当我们没有嗜酸性粒细胞计数有潜力,有效控制哮喘组可以包含类固醇耐火哮喘病患者嗜酸性。这些病人是不同于中性耐火材料尽管高剂量类固醇治疗哮喘病患者,因为他们有嗜酸细胞增多症和应对anti-IL-5抗体疗法(54,55]。详细的表现型和endotyping哮喘帮助感兴趣领域的个性化治疗方案(56]。我们的研究在这方面是有限的和未来的研究更大的人群可以解决这个问题。也越来越明显,中性粒细胞是一个非均匀的细胞执行各种功能,从经典的促炎反应免疫调节反应(57]。这个地区调查了我们的研究范围,但会密切关注感兴趣的中性粒细胞亚型不同哮喘的人群进行调查。

总之,之间没有显著差异被认为在中性粒细胞功能——和有效控制哮喘患者,因此不太可能中性粒细胞失调促使哮喘控制。然而,从哮喘患者中性粒细胞对致病性刺激似乎有不同的反应与健康对照组相比。这个功能障碍可能导致持续的或更高版本在哮喘患者对感染的易感性和可能与气道阻塞有关。

缩写

ACQ:	哮喘控制调查问卷
BDP-HFA:	Beclometasone dipropionate (hydrofluoroalkane推进剂)
CXCL8:	白介素8
:	在1秒用力呼气量
fMLF:	f-Met-Leu-Phe
FVC:	用力肺活量
集成电路:	吸入皮质类固醇
有限合伙人:	脂多糖
MMP-9:	矩阵metalloproteinase-9
不:	中性粒细胞弹性蛋白酶
房车:	鼻病毒。

伦理批准

这项研究是人类研究伦理委员会批准,悉尼大学。

同意

书面知情同意了所有的志愿者。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关。

作者的贡献

弗朗西斯卡·m·唐彼得·g·吉布森Gloria j . Foxley珍妮k·伯吉斯,凯瑟琳·j·贝恩斯和布莱恩·g·奥利弗提供项目的构思和设计。弗朗西斯卡·m . Tang和格洛丽亚j . Foxley进行招聘。弗朗西斯卡·m·唐完成所有细胞生物学,实验室工作和数据分析。所有作者论文的准备。

确认

这项研究是由国家卫生和医学研究委员会(NHMRC),澳大利亚。珍妮k·伯吉斯NHMRC职业发展奖学金不支持。1032695。布莱恩·g·奥利弗被NHMRC职业发展奖学金不支持。1026880。