文摘

在创伤性脑损伤(TBI)神经炎症机制的分析得到了越来越多的兴趣。在这种情况下某些免疫活性的细胞可能起着重要的作用。有趣的是,在实际的文学存在只有少数研究专注于单核细胞和粒细胞在创伤性脑损伤病人的角色。在这方面它最近报道,脉络丛代表早期选择性障碍的脑损伤后白细胞。因此本研究的目的是评估的早期动态CD14 +单核细胞和CD15 +粒细胞严重创伤性脑损伤后脑脊液的病人对BBB的完整性。仪流分析进行分析CD14 +单核细胞和CD15 +粒细胞人口在外伤性脑损伤患者的脑脊液。脑脊液和血清白蛋白的比率作为衡量并行BBB的完整性进行评估。接受腰椎穿刺的患者脑脊液样本的选择性外科手术得到控制。整体15例严重创伤性脑损伤后入学。10个病人进行控制。 In patients, the monocyte population as well as the granulocyte population was significantly increased within 72 hours after TBI. The BBB’s integrity did not have a significant influence on the cell count in the CSF.

1。介绍

创伤性脑损伤(TBI)尤其流行在年轻的成年人1),代表死亡的主要原因之一,持续损害的神经认知功能。结果主要是由最初的创伤造成的物理影响,其次取决于程度的二次损伤大脑的脑水肿、颅内压增加,延迟细胞破坏(2]。这些二次损伤机制可能是负责创伤性脑损伤后神经赤字的发展演进的分钟数天甚至数月后的主要机械损伤(3]。二次损伤的延迟发生率机制表明,可能有一个时间窗治疗干预措施减少脑组织损伤和改善神经功能的结果(3]。因此改善创伤性脑损伤后的复杂流程的理解(3)是至关重要的发展的一个有效的神经保护治疗。虽然全身细胞免疫反应的关键作用在患者多个创伤已经被几个作者强调,只有数量有限的研究分析细胞反应的关键炎症细胞如单核细胞和粒细胞在创伤性脑损伤后脑脊液(CSF)的患者(4- - - - - -6]。单核细胞CD14的特征,56 kDa细胞膜锚定蛋白(7,8]。同时,碳水化合物抗原CD15(碳水化合物抗原3-fucosyl-N-acetyl-lactosamine)近似分子质量165和105 kDa的膜糖蛋白表达嗜中性粒细胞(9,10]。在生理条件下的CSF分开外围和脑血流量的血脑屏障(BBB)。在分析动力学的单核细胞和粒细胞在创伤性脑损伤后脑脊液的患者,问题出现潜在的细胞内容发生变化是否由于中断BBB或通过一定的机制仍然需要解释。众所周知,CSF的白细胞计数外周血相比低得多。因此BBB中断可能会导致增加白细胞后脑脊液细胞由于破坏血管渗漏。

因此本研究的目的是评估的分数CD14 +单核细胞和CD15 +粒细胞CSF后创伤性脑损伤的患者开始时承认,直到72小时(小时)后创伤性脑损伤。BBB完整性的影响单核细胞和粒细胞CSF的数量也是在这种背景下评估。

2。患者和方法

2.1。研究设计和患者集体

研究大学的伦理委员会批准的协议(参考号330/03)。入选标准为未来的招生是孤立封闭的创伤性脑损伤的存在,最初的格拉斯哥昏迷评分(GCS)≤8点(即。、严重脑损伤),证明颅内出血(ICB)首次头颅ct扫描(有条件现金转移支付;创伤性脑损伤后90分钟内),执行的指示将外部脑室引流导管(EVD)。排除标准是一个历史的先前存在的神经,恶性或慢性炎症性疾病。书面知情同意时获得病人恢复意识。在剩下的无意识的情况下,近亲或法定代表人是假定同意要求。

2.2。临床和手术

外部脑室引流(EVD)导管(美国总部TraumaCath, Integra神经科学)被放置在侧脑室的锋角使用CT透视引导持续监测颅内压(ICP)和排水CSF (11]。CT扫描后进行控制的正确放置引流,病人被称为重症监护室(ICU)和治疗脑外伤基金会根据指南(12]。如果15毫米汞柱以下ICP仍然至少72小时没有甘露醇管理或脑脊液引流,EVD被移除。

2.3。抽样程序

第一次取样后立即发生的插入EVD(90±45分钟后住进医院)。进一步的样本获得的12、24、48和72小时后创伤性脑损伤。在每一个采样时间点(4毫升的排水CSF, 5毫升的外围血清血,和5毫升的EDTA血液收集。500年μL (CSF被送到实验室医学研究所的大学医院总数的测定细胞计数和CSF白蛋白水平。血清白蛋白水平的血液被用于测定外周血的医学研究所的实验室。白蛋白水平是必要的评价血脑屏障(BBB)。EDTA的血液被送到实验室研究所的医学和用于外围微分血液计数。

2.4。荧光标记

荧光激活细胞分类(流式细胞仪)分析,3毫升的脑脊液样本离心机在4°C 10分钟与1200克立即移除上层清液和加工。细胞颗粒resuspended于200年μL FC缓冲悬挂(0.01米磷酸缓冲盐,pH值7.2,1%的牛血清白蛋白,和5%胎牛血清(FCS;0.02%的南3))。

20μL的再悬浮与3孵化20分钟μL fluorochrome-labeled抗体在黑暗中在冰上。所有抗体CD14 TC和CD15 FITC (Caltag实验室、德国汉堡)被用于single-stain数组。溶解的红细胞,500年μL流式细胞仪赖氨酸溶液(Caltag实验室、德国汉堡),然后使用悬浮培养另一个10分钟。洗后用500μL PBS(5%胎牛血清(FCS;0.02%的南3佩滕科弗,德国慕尼黑)两次,暂停再次离心10分钟每分钟1200发子弹在4°C。

2.5。流仪结果

流式细胞仪分析使用四通道史诗XL恢复期流式细胞分析仪(beckman coulter、Krefeld、德国)与一个风冷15 mW 488海里氩离子激光器。FITC的530纳米过滤器(异硫氰酸荧光素)和TC > 650纳米过滤器(三色、Caltag实验室、德国汉堡)应用。数据采集得到使用世博会32软件(beckman coulter, Krefeld,德国)。光谱补偿和仪器设置适当调整。应用流体学和仪器定期检查使用FlowCheck珠子(beckman coulter, Krefeld,德国)。各自的分析,血细胞计数器计数5000个事件列表中(细胞)模式。免费WinMDI软件(版本2.8,Bio-Soft净(13])是用于数据分析。抗体阳性细胞被确定为最积极的一面散射与TC (CD14)和FITC (CD15)阳性细胞,分别。抗体阳性细胞被算作细胞总数的百分比。

2.6。血脑屏障功能的评估

为了确定CD14 +单核细胞和CD15 +粒细胞动力学与创伤后BBB破坏,脑脊液和血清白蛋白(比 )是在每个采样时间点计算。白蛋白水平进行评估通过使用标准化的浊度分析(Cobas Integra白蛋白,罗氏诊断,曼海姆,德国)。根据Reiber和费尔根豪尔, 是一个敏感参数分析的BBB [14]。在这项研究中,BBB的干扰评估如下: 值低于0.007被认为是正常的,值0.007和0.01之间的轻度功能障碍,适中的值在0.01和0.02之间,高于0.02作为BBB的严重障碍。正常和轻度功能障碍被定义为完整的BBB而中度和严重功能障碍被定义为BBB中断。评估的影响BBB对单核细胞的动态的功能,注册病人分为两组:组我展示一个完整的BBB和组II BBB的缺陷。

2.7。数据分析

数据给出平均值±标准平均误差(SEM)。比较病人的价值观和控制值或病人价值在录取的时候,数据分析采用方差分析(方差分析排名)为非参数数据根据克鲁斯卡尔-沃利斯。分析的显著差异随着时间的推移使用Student-Newman-Keuls测试进行方差分析。为确定特定差异邓恩的测试执行。水平的重要性设置为≤0.05。所有统计分析3.0σ统计软件包(SPSS Inc .,芝加哥,美国)使用。

3所示。结果

3.1。病人和人口数据

总共23例孤立的严重创伤性脑损伤患者登记(8女性和15名男性;年龄46±5年)。八个病人死于创伤性脑损伤后24小时内,因为治疗耐药脑肿胀和/或脑干的突出,因此必须被排除在外。脑脊液从10获得控制患者(5女性和5男性;44±9岁)接受了选修脊髓麻醉的下肢骨科手术。

3.2。动态CD14 +单核细胞

对照组的基线值单核细胞人口为2.6±0.6%。在承认单核细胞计数在创伤性脑损伤病人组为2.32±0.6%,不是对照组明显不同。单核细胞的数量增加到4.10±1.0%在12小时,4.61±1.4%在24小时,5.26±1.0%在48小时。尽管连续增加观察,没有统计上的显著差异相比,入学水平。此外,单核细胞数量在12、24、48小时没有显著不同的基线水平相比健康对照组。然而,创伤性脑损伤后72小时单核细胞人口占6.48±0.8%,从而显著提高相比,价值的承认。此外单核细胞数量明显高于基线水平相比健康对照组(见图1)。


图1
动态CD14 +单核细胞。图形演示的CD14 +单核细胞数量的百分比(%)脑脊液细胞在不同的采样时间点。数据平均值±标准给出了错误的意思。 相对于对照组; 与承认。
3.2.1之上。组我(完整的BBB, )

在承认CD14 +单核细胞计数的患者完整的BBB为2.61±0.9%,没有明显不同的基线水平相比对照组。比例增加到4±1.5%和4.34±1.4%在创伤性脑损伤后12小时和24小时,分别。细胞计数仍不显著不同的细胞相比,在入学水平。此外,没有显著差异的基线水平相比对照组。在创伤性脑损伤后48小时人口占6.40±1.5%,这是明显高于对照组的基线水平( )。在72小时CD14 +单核细胞进一步增加到一个值为6.91±1.0%。这是明显高于对照组的基线值和进气值相比显著升高。

3.2.2。第二组(BBB中断, )

入学的时候单核细胞人口占1.89±0.9,只有但不会显著提高创伤性脑损伤后12小时(4.25±1.6%)。在24小时人口下降到3.53±1.1%的水平相比,仍然没有意义价值的承认(0小时)。此外,单核细胞的数量的时候承认,创伤性脑损伤后12小时,24小时没有明显不同的基线水平相比对照组。创伤性脑损伤后48小时和72小时的数量分别为5.02±3.2%和5.83±1.4%,分别;值都明显高于价值的承认以及基线水平的对照组。

3.2.3。BBB评价

关于评价的BBB组之间没有明显差异,我与完整的BBB和组II中断BBB在定义的采样点(0,12、24、48和72小时后创伤性脑损伤;参见图2)。


图2
动态CD14 +单核细胞和血脑屏障的功能。图表展示了CD14 +单核细胞的数量百分比(%)的CSF细胞。图在白色展示数据的完整的患者血脑脊液屏障( ),而图中灰色演示数据的患者中断血脑脊液屏障( )。数据平均值±标准给出了错误的意思。 相对于对照组; 与承认。
3.3。动态CD15 +粒细胞

对照组值占0.98±0.2%。CD15 +粒细胞的人口已经大大提升在入学(9.15±1.6%)相比,基线水平的控制。在12小时的值增加到24.65±1.6%,因此入学时间点相比显著提高。粒细胞数量分别为25.9±3.1,34.3±5.0,25.5±3.5,24日,48和72小时,分别,这样的价值观仍明显比入学水平升高以及基线水平的控制(见图3)。


图3
动态CD15 +粒细胞。图表展示了CD15 +粒细胞的数量百分比(%)的CSF细胞在不同的采样点。数据平均值±标准给出了错误的意思。 相对于对照组; 与承认。
3.3.1。组我(完整的BBB, )

粒细胞的数量已经明显升高(8.61±1.3%)入学的基线水平相比对照组(0.98±0.2%)。在12小时后创伤性脑损伤的人口占26.96±2.6%,相比明显高于入学。粒细胞25.42±4.6%,33.38±7.0%,在24小时和22.27±4.6%,48小时和72小时,分别。这些人口相比仍明显高于入学。此外,粒细胞在我组明显高于对照组的基线水平相比,在每一个采样时间点。

3.3.2。第二组(BBB中断, )

粒细胞占14.92±1.0%的人口在入学,因此与对照组相比显著升高(0.98±0.2%)。在12小时和48小时的值增加到24.48±1.3%和28.37±2.9%,分别。在48小时粒细胞增加到35.80±7.6%,因此相比,明显高于入学。在72小时粒细胞下降到22.27±4.6%,因此没有进一步显著差异相比,入学水平。粒细胞的数量相比,第二组显著高于对照组的基线水平为每个采样时间点。

3.3.3。BBB评价

关于BBB的评价没有显著区别组我完整的BBB和组与BBB破坏(见图二4)。


图4
动态CD15 +粒细胞和血脑屏障的功能。图表展示了CD15 +粒细胞百分比的数量 所有的CSF细胞。图在白色展示数据的完整的患者血脑脊液屏障( ),而图中灰色演示数据的患者中断血脑脊液屏障( )。数据平均值±标准给出了错误的意思。 相对于对照组; 与承认。
3.4。CSF细胞总数

的绝对水平细胞(细胞总数)以及单核细胞和粒细胞的百分比不同采样点在表1,2,3。没有发现显著差异比较采样点在入学至基线水平。也有比较完整的患者和中断BBB没有区别。

表1
CSF细胞总数的病人。
表2
单核细胞计数在病人的脑脊液。
表3
患者的CSF粒细胞计数。
3.5。外周血单核细胞和粒细胞计数

在外周血单核细胞和粒细胞的人群提供了表4。没有明显改变随着时间的推移。

表4
外周血单核细胞和粒细胞。

4所示。讨论

在目前研究CD14 +单核细胞的动力学和CD15 +粒细胞在遭受创伤性脑损伤病人的脑脊液进行评估直接创伤后首次超过72小时。CD14 +单核细胞和粒细胞CD15 +细胞数量明显升高在创伤性脑损伤后的第一个72小时基线水平相比,进入医院以及健康对照组相比。对于一个潜在障碍的BBB之间没有显著差异被发现创伤性脑损伤患者完整的BBB和创伤性脑损伤患者中断BBB,分别。

只有孤立的创伤性脑损伤的患者包括避免增加外周血单核细胞和粒细胞的连续不造成创伤性脑损伤和一个潜在的偏见。除了入选标准的严重创伤性脑损伤(GCS≤8)和颅内出血的迹象被建立,以确保一个适当的脑部创伤发生可能导致检测和CSF细胞水平上的显著变化。总之入选标准导致临界条件,登记的病人,在这项研究应该进行的研究是未来研究的基础方面特别是潜在的创伤性脑损伤后的治疗选项修改以避免二次脑损伤。

一般温和的影响(甚至轻微)创伤性脑损伤的动力学单核细胞和粒细胞另外有趣的创伤性脑损伤的理解和大脑的过程发生在细胞水平上。然而收获CSF是非常困难的患者占不考虑得到一个EVD放置。在当前文学的几项研究报告检测pro -和抗炎介质如细胞因子、白细胞介素在患者的CSF (15]。然而,也有证据在文献中,二次脑损伤也可能开发不增加白细胞介素CSF (16]。在这种情况下功能的参与免疫活性的细胞如单核细胞(17- - - - - -21)和粒细胞(22,23在继发性脑损伤的形成。

在目前研究CD14 +单核细胞的人口和CD15 +粒细胞显著增加在第一个72小时后创伤性脑损伤的相应数量的对照组相比,甚至细胞数量在入学的时候。连续出现的问题是不是由于nonmodulated涌入这些细胞从外周血中脑脊液由于中断BBB或细胞是否穿越BBB通过一定的机制来描述。在这种背景下提出的结果表明,BBB的完整性没有重大影响的人群CD14 +单核细胞和CD15 +粒细胞在创伤性脑损伤后的第一个72小时的时间进程。除了没有明显下降的外周血单核细胞、粒细胞数量检测。因此我们的数据不支持的理论nonmodulated流入从外周血细胞。然而,细分与数量很小的团体 必须批判性解读从统计的观点。在这种背景下最近的出版物展示了单核细胞贩运的BBB使用透射电子显微镜在大鼠创伤性脑损伤模型(24,25]。在这方面施瓦茨和巴鲁克最近报道,脉络丛代表早期进入网站后白细胞损伤中枢神经系统(中枢神经系统)26]。Shechter等人最近还发现单核细胞主要通过脉络丛交通中枢神经系统损伤后(27]。这些发现可能有助于解释最近报道CD14 +单核细胞的数量急速上升,CD15 +粒细胞CSF在创伤性脑损伤患者的早期阶段在目前的研究中。

CD15 +粒细胞明显已经和近十倍增加录取的时候显示一个快速响应的创伤性脑损伤后粒细胞的数量。此外,粒细胞人口进一步增加;12小时后创伤性脑损伤的人口已经明显高于入学的时候。这些数据表明,粒细胞fast-responder和可迁移到足够数量的脑脊液。也关于细胞的动态数据提供初步证据表明,粒细胞可能发挥重要作用严重创伤性脑损伤后早期创伤后阶段。

CD14 +单核细胞的增加并没有导致更高水平的创伤性脑损伤后的单核人口到72小时。单核细胞的相对较慢的增长可能意味着这些细胞不是尽可能多的参与了创伤性脑损伤后的早期反应粒细胞。不过这可能只是表明比粒细胞单核细胞更固定或不是同等数量可以迁移到脑脊液。在这方面是非常有趣的确定激活细胞的人口在整个CD14 +单核细胞。因此,未来的工作需要进一步了解单核细胞在创伤性脑损伤的作用。

本研究的一个限制是提到的是,只有CD14 +单核细胞和CD15 +粒细胞动力学的不同原因进行了分析,由此产生的增加并不确定。在这方面必须说的放置一个EVD本身可以被认为是某种脑损伤。因此,CSF中的炎症反应可能是由于EVD的位置。这是一个潜在的偏见,不排除控制CSF组。对照组脑脊液获得通过腰椎穿刺的脊髓麻醉是一个完全不同的损伤模型关于CSF集合。然而我们的研究开始测量的影响免疫活性的细胞在创伤性脑损伤创伤后早期阶段。严格来说本研究比较了两个已知的创伤性脑损伤后炎症反应的事件(第一个事件(s)到90分钟前第二创伤性脑损伤的事件考虑放置EVD的创伤性脑损伤事件)与未成年人对照组脊髓损伤脊髓麻醉。这应该牢记在解释研究结果时还是劝告。因此进一步研究的局限性在于,第二个对照组患者因其他原因需要EVD或脑室分流比创伤性脑损伤(如脑积水)也包括能允许把一个EVD识别造成的潜在影响。我们不能提供数据的适当控制病人在我们的学术大学创伤。 Therefore a multicenter study should be considered for future investigation. However this study analyzed the dynamics of monocytes and granulocytes after severe TBI events which was an important first step that future research can build on.

总之CD14 +单核细胞的数量和CD15 +粒细胞显著增加相比,对照组的细胞群,甚至细胞群的时候承认在病人组,但它仍不清楚如何增加发生,是否增加影响创伤性脑损伤患者的结果。进一步的研究是必要的,我们的研究小组目前工作的重点。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。