文摘

类风湿性关节炎(RA)的特征是炎症细胞浸润,纤维母synoviocytes (FLS)入侵扩散,和关节破坏。循环GMP-AMP合成酶(cga)是一种胞质DNA传感器,诱发免疫激活。在这项研究中,我们检查是否注册会计师在RA FLS的过程中发挥作用。在这项研究中,注册会计师在RA-FLS与OA FLS的过表达。肿瘤坏死因子α刺激引起注册会计师在RA FLS的表达式。过度的海巡署促进了注册会计师的扩散和可拆卸的抑制RA FLS的扩散。注册会计师过度增强生产促炎细胞因子和基质金属蛋白酶(MMPs)以及一种蛋白激酶ERK的磷酸化TNFα刺激FLS的。相比之下,海巡署沉默抑制促炎细胞因子和基质金属蛋白酶(MMPs)以及一种蛋白激酶ERK的磷酸化TNFα刺激FLS的。这些结果表明,注册会计师激活一种蛋白激酶ERK途径,促进风湿性关节炎的炎症反应FLS的,和的发展策略针对注册会计师可能人类RA治疗的潜力。

1。介绍

类风湿性关节炎(RA)是一种慢性全身性自身免疫性疾病,其特征是增生性滑膜炎、滑膜组织增生,软骨和骨的破坏。呈synoviocytes (FLS)在关节炎的发展至关重要1,2]。RA关节激活FLS的扩散及其分泌物如促炎细胞因子和基质金属蛋白酶(MMPs)中扮演关键的角色滑膜增生的发展,持续的炎症,关节炎的关节和关节破坏(3]。

最近,最近几项研究已经显示角色I型干扰素(ifn)在RA患者的发病机理4]。与I型干扰素通路相关基因变异与RA发展有关,以及与临床特征(5,6]。胞质DNA传感器,循环GMP-AMP合成酶(注册会计师),据报道已经激活干扰素生产所需通过刺通路(7,8]。最近的研究涉及注册会计师的关键作用在自身免疫性疾病小鼠模型的Aicardi-Goutieres综合症和先天和适应性免疫反应在人类狼疮的特性(9- - - - - -11]。然而,注册会计师在RA中的作用仍然是未知的。在这项研究中,我们研究了注册会计师是否参与了人类通过影响RA-FLS RA的发病机制。

2。材料和方法

2.1。病人和控制

滑膜组织取自8 RA患者和8骨关节炎(OA)患者接受膝盖关节镜或更换手术在医院。血清样本从所有患者手术前进行。所有受试者完成了2010年美国风湿病学院(ACR) RA和OA的诊断标准12,13]。知情同意是获得所有的病人,研究协议是我们医院的伦理委员会批准(IRB-S1126)。

2.2。隔离和读者的文化

滑膜组织被绞成碎片2到3毫米大小和扩散的细胞培养瓶底部RPMI 1640介质(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA) 6小时37°C。接下来,组织和完成孵化RPMI 1640中补充10%胎牛血清在湿润的气氛中含5%股份有限公司₂。媒介改变了每三至五天被小心翼翼地和不依从组织块。FLS的进一步增长在四到六个段落。滑液的细胞学表型特征的文化,第三段细胞与小鼠单克隆抗体染色(mAb)人类异硫氰酸荧光素(FITC) CD14和藻红蛋白(PE) -CD90(美国eBioscience,圣地亚哥,CA)和显示,2.8% CD14和97.0% CD90表达式,以流式细胞术。

2.3。定量rt - pcr(存在)

从FLS的总RNA提取使用试剂盒试剂(美国生活表达载体技术,卡尔斯巴德,CA)根据指令。互补DNA合成使用逆转录系统(豆类,大连,中国),和海巡署记录被发现使用cGAS-specific引物PCR扩增(转发:5′-TAACCCTGGCTTTGGAATCAAAA-3′;反向:5′-TGGGTA CAAGGTAAAATGGCTTT-3′)。β肌动蛋白作为内部参考基因控制使用特定的引物(转发:5′-ACGCATCTGGCAGTACGTCTA-3′;反向:5′20 GTTCTTACTCGGGTTGAG-3′)。实时定量PCR进行使用1μ每口井的L(互补DNA, TaqMan大师混合(美国应用生物系统公司,培育城市,CA),使用ΔCT方法和结果进行了评估和计算数量的副本是标准化的β肌动蛋白在同一个样本副本。

2.4。免疫印迹

收集到的细胞悬浮在Laemmli样本缓冲区(美国Bio-Rad大力神,CA)包含5%β加,紧随其后的是煮5分钟。收集上清液,细胞溶解产物,蛋白质浓度测定用BCA化验设备(美国WI皮尔斯,阿普尔顿)。

等量的蛋白质样品(50μg)加载10% sds - page和转移到硝化纤维膜。5%脱脂牛奶的膜被封锁TBST缓冲2 h在室温和随后孵化主要抗体在4°C一夜之间,分别。随后孵化与各自HRP-conjugated二级抗体,和乐队是发达与ECL衬底和暴露在x射线胶片或扫描使用Tannon 5200 (Tanon,北京)根据制造商的指示。墨迹为使用ImageJ软件带强度进行了分析。对量化,每一个蛋白质的相对丰度是标准化β肌动蛋白控制。以下主要抗体被用于:反β肌动蛋白、anti-cGAS anti-phospho-AKT, AKT、anti-phospho-ERK1/2 anti-ERK1/2(所有从细胞信号技术,丹弗斯,妈,美国)。辣根peroxidase-conjugated anti-mouse或anti-rabbit免疫球蛋白(圣克鲁斯生物技术、钙、美国)作为二级抗体。

2.5。慢病毒载体建设

委员会pLKO。1lentiviral vectors targeting human cGAS (Thermo Fisher Scientific, Cat. # 129125) were used. Scrambled shRNA was cloned into the same vector and was used as control. Furthermore, full-length cGAS cDNA was cloned into lentiviral vectors pWPI and linked to IRES-GFP. The pWPI vectors expressing GFP only were used as the controls. The vectors were amplified in HEK293 cells and purified by CsCl gradient ultracentrifugation. Finally, acquired lentivirus particles were dialyzed at 4°C against sterile virus buffer and stored at −80°C.

2.6。细胞增殖实验

细胞增殖是确定被Zhang et al。14]利用CellTiter 96水一个解细胞增殖试验装备(Promega,北京),根据制造商的指示。简单地说,在1×10细胞被镀³细胞/在96 -孔板和不同时期的培养。在每个时期,20μL MTS添加到每个好然后孵化为4小时37°C。板块在490 nm读光谱光度测量的板读者(Bio-Rad、大力神、钙、美国)和参考波长为650 nm。刺激细胞增殖指数的计算作为干预组光密度(OD)值/空白对照组OD值。

2.7。量化的促炎细胞因子和基质金属蛋白酶

人类il - 1的蛋白水平β和il - 6在FLS的上层清液游离测量使用商用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(NeoBioscience,北京)根据制造商的指示。金属蛋白酶- 1是由荧光测定使用量化人类活动金属蛋白酶- 1 Fluorokine E装备根据制造商的协议(研发系统,明尼阿波利斯,美国)。MMP-3表达决心使用人类MMP-3 Quantikine酶联免疫试剂盒(研发系统,明尼阿波利斯,美国)。

2.8。一种蛋白激酶/ ERK激活ELISA测定

AKT / ERK激活InstantOne酶联免疫试剂盒(美国eBioscience,圣地亚哥,CA)是用于人类ERK1/2磷酸化的初步测量和AKT在RA FLS的溶解产物根据用户手册。简单地说,RA FLS的(2×10⁵细胞)感染了病毒载体48 h,然后与人类肿瘤坏死因子治疗α(100 ng / mL)额外的30分钟。裂解缓冲的细胞细胞溶解混合和准备的样品溶解产物(50μL)添加到strip-well ELISA试验板。添加后抗体鸡尾酒(50μL),板在室温下培养1 h微型板块瓶。洗后,井与检测试剂(100孵化μL)约15 - 20分钟,其次是停止反应与控制解决方案。最后,在450 nm测定吸光度。

2.9。统计分析

数据表示为均值和SEM(平均数标准误差)。每个结果代表三个独立实验的意思。使用学生的进行了比较以及(2组)或方差分析(超过2组)进行统计分析。所有使用SPSS 17.0分析(IBM . n:行情),阿蒙克,纽约,美国)。值小于0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。注册会计师在RA-FLS与OA FLS的过表达

注册会计师mRNA的相对表达细胞系和组织是由存在量化FLS的八个RA和OA患者。当规范化β肌动蛋白,意思是cga mRNA的表达水平在RA FLS的高于OA FLS的()(图1(一))。

为了进一步证实了这些结果,海巡署蛋白表达决心通过免疫印迹FLS的八个RA和OA患者。我们发现在RA FLS的海巡署表达明显升高与OA FLS的(图1 (b))。

3.2。肿瘤坏死因子α刺激诱导的注册会计师在RA FLS的表达式

肿瘤坏死因子α是RA发病机制和肿瘤坏死因子α现在抑制剂治疗RA的批准。在这项研究中,我们使用了TNFα随着刺激研究注册会计师在RA FLS的表达式。我们表明,注册会计师mRNA的表达水平增加时间的方式来响应与肿瘤坏死因子的刺激α(100 ng / mL)的实时定量PCR(图2(一个))。肿瘤坏死因子的30分钟α刺激我们的观察,海巡署mRNA表达最高(而控制,时间0)。这些观察被免疫印迹分析进一步验证了在蛋白质水平(图2 (b)),这表明注册会计师的表达增强在RA FLS的促炎的刺激下肿瘤坏死因子α,暗示注册会计师作为发起人RA发病和进展。为了验证这个假设,我们下一个注册会计师进行靶向治疗的免疫调节作用和机制进行了探讨,利用重组慢病毒注册会计师,在促进风湿性关节炎的炎症反应FLS的。

3.3。注册会计师对RA FLS的增殖的影响

评价注册会计师的病理意义为RA发展积累,我们在RA-FLS调制海巡署表达水平与海巡署表达质粒转染的细胞或成分。正如所料,注册会计师的转染表达载体增强注册会计师蛋白水平,而注册会计师的转染成分明显减少了注册会计师的蛋白质含量在肿瘤坏死因子的存在α刺激30分钟(图3(一个))。MTS试验表明,注册会计师超表达显著增加了RA FLS的扩散,而注册会计师击倒减少FLS的(数据的扩散3 (b)和3 (c))。

3.4。注册会计师进行靶向治疗对肿瘤坏死因子的影响α在RA FLS的全身炎症反应

我们调查了可能的注册会计师对肿瘤坏死因子的影响α全身的生产重要的促炎介质,包括细胞因子il - 1βil - 6,金属蛋白酶- 1,MMP-3。的蛋白质含量高于上层清液介质的RA FLS的生长在没有或肿瘤坏死因子的存在α通过ELISA进行评估。结果表明,FLS的感染cGAS-vector产生更高数量的il - 1βil - 6,金属蛋白酶- 1,MMP-3比FLS的感染控制(图4(一),当暴露于TNFα刺激了30分钟。AKT激活或ERK通路已经知道与FLS的和类风湿性关节炎的炎症反应。进一步探讨注册会计师的机制促进RA FLS的炎症反应,包括促炎介质生产如上所述,我们发现注册会计师AKT和ERK途径的影响。我们发现,过度的海巡署TNF的显著增加α介导ERK1/2和一种蛋白激酶磷酸化蛋白免疫印迹(图4 (b))。

3.5。注册会计师击倒对肿瘤坏死因子的影响α在RA FLS的全身炎症反应

此外,我们调查的可能影响注册会计师对TNF击倒α全身的生产重要的促炎介质和一种蛋白激酶ERK途径。结果表明,FLS的感染排气成分产生显著降低il - 1βil - 6,金属蛋白酶- 1,MMP-3比FLS的感染控制(图5(一个),当暴露于TNFα刺激了30分钟。AKT激活或ERK通路也显著减少通过排气成分免疫印迹在RA FLS的肿瘤坏死因子的存在α刺激30分钟(图5 (b))。

4所示。讨论

肿瘤坏死因子α涉及在RA发病机制的每一个阶段,即通过增强自身免疫,维持长期炎性滑膜炎,促进关节损伤(15]。五anti-TNF药物,英夫利昔单抗、adalimumab certolizumab pegol,道,golimumab,现在批准治疗RA的在不同的国家(15]。在目前的研究中,我们使用TNFα全身的RA FLS的模拟RA的体外模型。我们发现,注册会计师在RA-FLS与OA FLS的过表达。肿瘤坏死因子α刺激引起注册会计师在RA FLS的表达式。过度的海巡署促进了注册会计师的扩散和可拆卸的抑制RA FLS的扩散。注册会计师过度增强生产促炎细胞因子和基质金属蛋白酶(MMPs)在肿瘤坏死因子α刺激FLS的。相比之下,海巡署沉默抑制促炎细胞因子和基质金属蛋白酶(MMPs)在肿瘤坏死因子α刺激FLS的。这些结果表明,注册会计师RA FLS的激活炎症反应,以及发展策略针对注册会计师可能人类RA治疗的潜力。

积累数据涉及一种蛋白激酶的激活ERK途径在RA的发病机制。AKT激活是一个重要的病理生理的改变与增殖相关RA滑膜。FLS的RA患者表达高水平的磷酸化AKT比从骨关节炎患者16]。PI3K / AKT信号通路在RA FLS的肿瘤坏死因子等促炎细胞因子可以激活α,AKT激活中起着至关重要的作用在刺激FLS的扩散和炎性细胞因子的生产(使炎症)和基质金属蛋白酶(导致软骨破坏)(17]。AKT激活的结果差别相应地,对这些基因在RA FLS的抗增殖和抗炎作用和大鼠关节炎(18]。其他风湿性关节炎的实验动物模型的研究也表明,得罪PI3K / AKT信号级联可以促进关节炎症,这表明AKT通路可能是一个潜在的治疗RA的目标(3]。

ERK信号通路也参与了RA的激活读者和骨关节炎的关节的破坏19]。ERK在RA滑膜和风湿性FLS的持续表达,和磷酸化激活的表达形式在RA滑膜远远高于OA的(20.]。ERK信号级联是众所周知的在RA发挥重要作用。抑制Ras / ERK信号提供了作为RA治疗的新方法,通过瞄准FLS的激活和骨破坏19]。Ras / ERK通路抑制剂可以阻止炎症细胞因子和基质金属蛋白酶的生产由RA FLS的侵袭性的FLS的得罪ERK的活化21]。我们的数据表明,针对注册会计师抑制ERK和AKT通路,表明潜在的注册会计师在RA的发病机制中的作用。

这部小说我们的研究发现,注册会计师可以促进风湿性关节炎的炎症。注册会计师的潜在作用在炎症和自身免疫性疾病最近被发现。综上所述,我们的结果表明注册会计师的重要作用/ STING-mediated胞质DNA-sensing通路的I型干扰素诱导树突状细胞(20.]。抗疟药抑制干扰素-β生产通过封锁cGAS-DNA互动(21]。Trex1(- / -)小鼠缺乏cga完全免受杀伤力,展览组织炎症显著下降,开发自身抗体和失败,暗示注册会计师自身免疫性疾病的关键驱动因素,这表明注册会计师抑制剂可能是有用的治疗Aicardi-Goutieres综合症和相关的自身免疫性疾病(9]。在这项研究中,我们首先确定本机注册会计师基因的表达在炎症FLS的RA患者。在体外,在炎症和肿瘤坏死因子等刺激α关节炎FLS的展览炎症反应,我们的研究表明,在这个过程中注册会计师的表情刺激时间mRNA和蛋白水平升高。总体而言,我们的研究强调,注册会计师是一种促炎因子通过调节ERK和AKT通路,这个监管注册会计师的影响首先在RA FLS的报告。

总之,我们已经证明了在这项研究中,注册会计师过度强有力地导致RA FLS的炎症反应。cGAS-mediated炎性反应的机制可能在于其调制ERK和AKT通路。目前的研究表明,过度的注册会计师或增强注册会计师活动FLS的RA的发展有重要贡献。免疫调节策略针对注册会计师可能治疗潜在的人类风湿性关节炎的治疗。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突与本文有关。