文摘

目前研究的目的是调查的保护作用3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol (AC-Rsv) LPS-induced急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。肺损伤的组织学检查,评价了wet-to-dry重量比率,和细胞计数和支气管肺泡灌洗液中蛋白质含量。炎症是由MPO评估活动,在肺和细胞因子分泌细胞。结果表明,AC-Rsv显著降低小鼠的死亡率与LPS刺激。预处理的AC-Rsv减毒LPS-induced组织学变化,减轻肺水肿,减少血液血管渗漏,抑制肺MPO活动。更重要的是,AC-Rsv Rsv治疗肿瘤坏死因子的分泌,减少α、il - 6和il - 1β分别在肺部和NR8383细胞。进一步勘探表明,AC-Rsv和Rsv治疗缓解LPS-induced抑制SIRT1表达和抑制LPS的激活效应MAPKs和NF -κB激活在体外和体内。更重要的是,体内的结果也证明了保护Rsv对LPS-induced炎症的影响将被EX527中和SIRT1 in-hibited时。综上所述,这些结果表明,AC-Rsv保护肺组织对LPS-induced ARDS衰减炎症通过p38 MAPK / SIRT1的途径。

1。介绍

急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是一种常见和严重的并发症主要是直接造成的肺损伤,如吸入的有毒物质,和间接系统性疾病,包括脓毒症和严重的创伤。ARDS导致高发病率、高死亡率和高昂的医疗费用(1]。尽管采用lung-protective整体通风和重症监护病房(ICU)医院ARDS患者的死亡率仍高于40% (2]。脓毒症被认为是最重要的原因之一ARDS的发生和发展。众多研究宣称,炎症可能直接或间接影响肺endothelia和激活炎症细胞的肺血流动力学,如中性粒细胞,单核细胞,淋巴细胞,促炎介质,包括细胞因子、蛋白酶、环氧酶(3,4]。虽然有各种抗炎的干预和治疗肺部炎症过程,ARDS的死亡率仍然高于可接受(5]。

内毒素,也被称为脂多糖(LPS),是一种革兰氏阴性细菌的细胞壁主要成分格式也被公认为最重要的病原体无法治愈的炎症。证据表明,有限合伙人可以激活中性粒细胞,气道上皮细胞和肺泡巨噬细胞趋化因子的过度生成,如没有,cox - 2, TNF -α,il - 1β,il - 6。几项研究已经解决核转录因子的激活,(NF)κB和增殖蛋白激酶(MAPK)通路负责促炎细胞因子的过度生成(6,7]。更重要的是,大量的证据表明,肿瘤坏死因子-α和il - 1β可能降低德国产业投资银行(IkB吗α尤其是)和把NF -κB在几分钟内从细胞质到细胞核,这将进一步放大炎症过程(8]。此外,overgeneration炎症介质中发挥了关键作用,破坏alveolar-capillary屏障和渗透率。因此,它可能会找到新的方法来干扰具有重要意义治疗ARDS的炎症过程。

白藜芦醇(Rsv)几百年来被称为根粉蓼属植物cuspidatum现在广泛存在于葡萄、坚果和红酒(9]。此外,白藜芦醇是一种最深入研究天然化合物,因为它表现出保护影响多种疾病,如心血管疾病(10,11[],癌症12,13),和炎症(14,15]。也有大量的证据表明白藜芦醇展出其药理特性通过干扰无声的表达和活动信息监管机构1型(SIRT1),它已被证实能扮演一个关键的角色在转录和转录后的调控基因表达的组蛋白和非组蛋白的蛋白脱乙酰作用[16]。尽管白藜芦醇保存多个生物活性,但它从未被作为临床药物的药代动力学和生物利用度的属性(17),3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol (AC-Rsv),白藜芦醇的前体药物在2002年首先报道(18),克服了一些短缺和结果在肺(Rsv的积累19]。更重要的是,从我们的实验室和其他团队的研究显示,AC-Rsv减毒海水吸入诱导肺损伤大鼠和减少γ-射线相关死亡小鼠(20.,21]。

在目前的研究中,我们已经表明,AC-Rsv施加保护作用有限合伙人暴露诱发的小鼠的ARDS调制SIRT1的表达式。此外,我们的研究结果表明,AC-Rsv在肺组织的保护作用可能是通过抑制衰减肺水肿和肺的炎症p38增殖蛋白激酶(MAPK)的途径。

2。材料和方法

2.1。动物和代理

成年雄性昆明小鼠(在18到22岁的g)得到的动物中心第四军医大学(西安,FMMU,中国)。捕获的老鼠在air-filtered,温控单元与等于明暗周期和免费的食物和水。所有实验过程和治疗动物被批准的机构FMMU动物保健和使用委员会根据美国国立卫生研究院的宣言指导护理和使用实验动物(1985年出版数量85 - 23日修订)。

有限合伙人(大肠杆菌脂多糖,055:B5)和EX527从σ获得化学公司(圣路易斯,密苏里州,美国)。白藜芦醇(3、5、4′-trihydroxystilbene)购买从西安草植物技术公司(西安,中国),纯度在98%以上。3、5、4′-Tri-O-acetylresveratrol (AC-Rsv结构显示在图1由药学部门)是合成药物化学的FMMU高效液相色谱纯度> 99%。酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒TNF -α、il - 6和il - 1β已经从研发公司购买(研发系统公司)。髓过氧化酶(MPO)活动分析工具已经购买从建成生物工程研究所(中国南京)。抗体,包括anti-p-NF -κB, anti-NF -κB, anti-p-p38 MAPK, anti-p38 MAPK、anti-SIRT1 anti-p-ERK anti-ERK,反β肌动蛋白,已经购买了从圣克鲁斯生物技术有限公司(圣克鲁斯、钙、美国)。

2.2。建模和分组

为了探索保护AC-Rsv对死亡率的影响,老鼠收到20毫克/公斤LPS腹腔内注射(溶解在0.9%盐水和0.22毫米膜过滤)有或没有预处理的不同剂量AC-Rsv(25、50或100毫克/公斤体重)7天。从不同组小鼠的死亡率(后每12 h 84 h)有限合伙人。

在AC-Rsv的保护作用研究LPS-induced ARDS,小鼠随机分为4组:控制;有限合伙人(5毫克/公斤);有限合伙人(5毫克/公斤)+ AC-Rsv(50毫克/公斤);AC-Rsv(50毫克/公斤)。老鼠在有限合伙人+ AC-Rsv组使用50毫克/公斤AC-Rsv了7天,有限合伙人在上届政府注入了90分钟的AC-Rsv因为我们之前的结果表明,血液中的Rsv浓度达到峰值90分钟后口服AC-Rsv。老鼠从所有组牺牲后12 h有限合伙人注入。此外,有限合伙人的浓度(20毫克/公斤,5毫克/公斤)选择根据先前的研究22]。

2.3。组织学评价

从不同的组肺组织相同的叶和4%多聚甲醛固定24小时,然后嵌入石蜡。肺样本切成5μ米厚的部分deparaffinized后和脱水。之后,片肺样本与苏木精和伊红染色。最后,所有切片在显微镜下检查和捕获(德国徕卡)。

2.4。肺Wet-to-Dry重量比率

肺样本获得12 h后注射LPS和尽快重;之后,所有的样品都在烤箱恒重干在70°C 72 h,重了。最后,wet-to-dry重量比率计算每个样本的湿重除以干一个。

2.5。支气管肺泡灌洗液(BALF)分析

在实验结束时,肺被宿舍从老鼠和灌洗5次1毫升冰冷的PBS(磷酸缓冲盐)。清洗液体的采收率90%以上。然后,BALF离心机在1000 rpm 5分钟在4°C。上层清液收集和蛋白质含量是由BCA法,根据标准曲线,计算结果和数据被表示为μ每毫升(g蛋白质μg / mL)。另一方面,细胞质量resuspended血红细胞裂解缓冲液和细胞总额由使用血细胞计数器。

2.6。MPO活性分析

在肺组织MPO活性是评价代表中性粒细胞在肺的积累受到有限合伙人。短暂、肺癌样本均质在寒冷的PBS(肺组织PBS 1: 10),和匀浆上清液被离心法收集在1000 rpm 5分钟4°C。MPO活性评价根据制造商的指示和价值观与分光光度计测量在460海里。

2.7。细胞培养和治疗

肺泡巨噬细胞细胞系,NR8383写明ATCC(美国)的购买和维护火腿的F12培养基中含10%胎牛血清在37°C在湿润的气氛中含5%股份有限公司₂和95%的空气。

为了评估Rsv的保护效应在LPS刺激NR8383细胞,细胞被分为四组:控制;有限合伙人(1μg / mL);有限合伙人(1μ40 g / mL) +白藜芦醇(μg / mL);白藜芦醇(40μg / mL)。收集细胞不同群体进行进一步调查后治疗12 h。有限合伙人的浓度在这个实验中选择根据先前的研究22]。

探索SIRT1表达式之间的关系的研究和LPS刺激NR8383 Rsv的保护效应细胞,细胞被分成四组,正常对待火腿的F12培养基(控制),有限合伙人(1μ有限合伙人(1 g / mL)μg / mL) + EX527 (1μ米)+白藜芦醇(40μg / mL),有限合伙人(1μ40 g / mL) +白藜芦醇(μg / mL) 12 h。为进一步检查细胞被收集。顺便说一句,EX527首次溶解在二甲亚砜(DMSO)到1毫米,然后稀释的工作浓度(1μ米)和火腿的F12培养基。

2.8。细胞因子的测定

虽然它通常是关于变形的结果,选择ELISA分析TNF -的内容α、il - 6和il - 1β在肺和细胞为了为当前的研究提供补充数据。简单地说,从每一组肺组织均质在寒冷的PBS(肺组织PBS 1: 5)通过使用Tissue-Tearor和细胞治疗如上所述被重复冻结和均质溶解方法。从组织和细胞匀浆在12000转离心5分钟在4°C。肿瘤坏死因子-内容α、il - 6和il - 1β在上层的组织和细胞样本测量根据制造商的指示。

2.9。免疫印迹

在实验的最后,细胞和组织样本收集和总蛋白提取根据制造商的指示(Beyotime生物技术研究所、江苏、中国)。蛋白质浓度测定采用BCA法分析工具包(Beyotime)。煮沸后,从每组等量的蛋白质sds - page凝胶上分离和转移到聚偏二氟乙烯膜湿传输方法。膜被Tris-buffered脱脂奶粉5%生理盐水与渐变20其次是孵化与单克隆抗体在一夜之间对p-NF - 4°CκB (1: 200), p-p38 MAPK (1: 300), SIRT1 (1: 200), p-ERK (1: 200)β肌动蛋白(1:5000)。孵化后的二次抗体抗体重复清洗和孵化在室温下2 h。最后,通过增强化学发光免疫复合物可视化(ECL)系统(Amersham法玛西亚生物技术,阿灵顿高地,,美国)。

2.10。统计分析

与SPSS 17.0统计分析进行了窗户。数值变量表示为意味着±s.d组之间的差异由单向方差分析(方差分析)其次是Dunnett后的测试数据的分布被证实属于正态分布。的用于分析kaplan - meier方法和生存率较生存数据。统计学意义是公认的。

3所示。结果

3.1。AC-Rsv LPS-Induced死亡率在小鼠的影响

为了评估保护AC-Rsv对内毒素的影响,我们首先评估AC-Rsv LPS-induced死亡率在小鼠的影响。如图2老鼠的累积死亡率中(50毫克/公斤)和高剂量(100毫克/公斤)组分别为55%和65%,分别是显著低于LPS组(80%小鼠死亡)()。这些数据表明,AC-Rsv保护小鼠免受LPS-induced死亡和50毫克/公斤AC-Rsv展出采用的最佳保护效果进行进一步的研究。

3.2。AC-Rsv LPS-Induced肺形态学改变的影响

肺组织病理学结果表明样本控制(图3(一个))和AC-Rsv(图3 (d))组织表现出正常的肺肺泡结构清楚,而有限合伙人曝光导致炎症细胞浸润,肺泡损伤,增厚肺泡壁,形成透明膜(图3 (b))。然而,LPS-induced肺结构变化显著减弱了AC-Rsv预处理(图3 (c))。

3.3。AC-Rsv对LPS引起的肺部水肿的影响

wet-to-dry重量比率肺癌样本分别计算了不同群体为了评估肺水肿老鼠AC-Rsv有限合伙人有或没有预处理的挑战。如图3 (e),wet-to-dry比率显著增加肺的LPS组相比,控制(,)。然而,政府AC-Rsv后大大减少了肺水含量12 h有限合伙人注入。结果还表明,AC-Rsv治疗并不影响肺水含量。

3.4。AC-Rsv对LPS-Induced肺血管渗漏的影响

从所有四组BALF中细胞和蛋白质含量进行评估,以评估在肺血管渗漏和LPS刺激,以及在这方面确定AC-Rsv的保护效果。如数据所示3 (f)和3 (g),有限合伙人注入相比,BALF细胞增加,蛋白质含量与控制(),而AC-Rsv限制细胞和蛋白质从肺血管渗漏到肺泡与LPS刺激时()。同时,控制和AC-Rsv组之间没有显著差异。

3.5。AC-Rsv对LPS诱导的肺部炎症的影响

为了评估的影响AC-Rsv LPS-induced炎症在肺,MPO活性(图4肿瘤坏死因子-)和内容α、il - 6和il - 1β(数据5(一个)- - - - - -5 (c))测量。结果显示,注射LPS显著调节MPO的活性和增加的内容TNF -α、il - 6和il - 1β相比,肺与控制()。然而,预处理AC-Rsv显著降低MPO活性和抑制肿瘤坏死因子-的浓度α、il - 6和il - 1β在肺()。此外,结果表明,AC-Rsv单独治疗并不影响细胞因子的MPO活性和含量在肺部。

3.6。AC-Rsv对MAPK / SIRT1通路在肺的表达

为了进一步说明AC-Rsv展示如何保护效应的机制对内毒素LPS诱导,MAPK / SIRT1的表达途径被免疫印迹评估。结果(图6)显示,政府的有限合伙人显著减少了SIRT1表达和增加的表达p-p38 MAPK, p-ERK, p-NF -κB ()。然而,预处理AC-Rsv显著下降p-p38 MAPK, p-ERK, p-NF -κB表达和增强SIRT1在肺的表达与LPS刺激()。

3.7。白藜芦醇对一代的炎症介质的影响在NR8383细胞刺激有限合伙人

基于AC-Rsv减毒LPS-induced肺损伤的结果,我们进一步评估其中间代谢物的影响,白藜芦醇,有限合伙人NR8383细胞上的挑战,因为所有AC-Rsv将成为Rsv体内(19]。结果(数据5 (d)- - - - - -5 (f))表明LPS刺激增加了一代的TNF -α、il - 6和il - 1β在NR8383细胞相比与控制(),而白藜芦醇显著逆转这一趋势和降低TNF -的形成α、il - 6和il - 1β()NR8383细胞暴露于有限合伙人。更重要的是,没有明显差异在趋化因子控制和白藜芦醇组之间的内容。

3.8。白藜芦醇对表达的影响在NR8383细胞MAPK / SIRT1的途径

我们进一步评估白藜芦醇是否可以调节NR8383细胞MAPK / SIRT1的表达途径像AC-Rsv在有限合伙人挑战肺。p-ERK, SIRT1的表情,p-p38 MAPK和p-NF -κB一直在评估细胞刺激有限合伙人一起治疗Rsv与否,和结果(图7)表明LPS刺激抑制SIRT1的表达和调节p-p38 MAPK, p-ERK, p-NF -κB表达NR8383细胞(),而白藜芦醇治疗逆转这一趋势就像AC-Rsv在LPS刺激肺部。

3.9。SIRT1抑制剂中和白藜芦醇NR8383细胞的保护作用刺激有限合伙人

NR8383细胞暴露在正常文化,有限合伙人,有限合伙人+ EX527 + Rsv,和有限合伙人+ Rsv 12 h,然后SIRT1的表达和一代的细胞因子被免疫印迹和ELISA方法评估,分别。结果(图8(一个))表明,SIRT1表达式被显著抑制LPS与控制相比,虽然Rsv治疗有效逆转的减少SIRT1的表达式。令人吃惊的是,cotreatment EX527和Rsv抵消Rsv的提升影响SIRT1的表达。

另一方面,结果(数据8 (b)- - - - - -8 (d))评价细胞因子的产生表明LPS刺激增加了一代的TNF -α,il - 1βil - 6, Rsv治疗逆转这一趋势。类似影响SIRT1的表情,coincubation EX527和Rsv没有抑制这些细胞因子的产生。

4所示。讨论

ARDS是一个严重的不同因素引起的系统性炎症的表现可能会进一步导致多器官功能障碍综合征(插件)有很高的死亡率2]。先前的研究已经表明,应对炎症细胞和炎症介质的分泌是ARDS的主要发病机理(23,24]。也有研究的机制和治疗ARDS体外和体内,取得了实质性的进展的了解这种疾病。然而,在临床可用的治疗仍然是有限的,因此它是有意义的探索新的药理治疗ARDS。

作为一种天然多酚,白藜芦醇(Rsv)已被证实具有许多药理作用[10- - - - - -15]。Rsv从未被作为临床药物的半衰期短,生物利用度低、定位。然而,这些不足在一定程度上克服了AC-Rsv管理相比,肺20倍AC-Rsv Rsv的浓度增加与Rsv管理局(19]。因此,我们调查的保护效应在LPS-induced AC-Rsv ARDS和结果显示,AC-Rsv能减少小鼠的死亡率受到有限合伙人和减弱肺损伤通过限制泄漏的液体从血管到肺肺泡、抑制细胞因子的浓度,减轻LPS引起的异常表达式MAPK / SIRT1的表达式。

作为ARDS的标志(25],肺水肿是由障碍alveolar-capillary壁垒和增加富含蛋白质的液体的过滤进入肺泡空间(26]。在目前的研究中,细胞含量和蛋白质含量在BALF和肺部水肿为了量化测量的大小肺水肿和小血管通透性。结果显示,政府的有限合伙人增加肺组织含水量和增强渗透细胞和泄漏的富含蛋白质的液体从血管进入肺泡,而预处理AC-Rsv显著降低肺W / D比率,降低BALF中蛋白质的浓度,抑制了细胞的分泌血管LPS引起的肺泡。

已经证实,炎症是ARDS的另一个字符;此外,中性粒细胞和巨噬细胞是主要的执行官LPS-induced肺部炎症细胞(27]。髓过氧化酶(MPO)是一个独特的中性粒细胞胞质颗粒组成必不可少的杀死吞噬病原体。因此,MPO活性显著相关中性粒细胞积累和担任炎症的标志28]。在当前的研究中,人们已经发现,MPO活性显著增加肺12 h有限合伙人曝光后,虽然预处理AC-Rsv显著降低MPO活性。此外,组织病理学研究表明AC-Rsv预处理与血管明显减少了中性粒细胞浸润肺肺泡。

LPS刺激以及激活中性粒细胞可能会进一步诱发的生成和分泌大量的炎症介质和趋化细胞因子,其中TNF -α,il - 1β介质特征,il - 6参与ARDS的发生和发展29日]。这些趋化因子也涌入相关,积累、高度破坏性的和激活细胞参与炎症;更重要的是,肿瘤坏死因子-之间的正反馈α和il - 1β和NF -κB将促进更多的NF -κB表达、磷酸化和易位到核这可能会进一步引起炎性反应导致严重损害肺组织(30.,31日]。在目前的研究中,人们已经发现,肿瘤坏死因子-α,il - 1β,il - 6在肺和NR8383细胞显著增加有限合伙人曝光,而治疗AC-Rsv和Rsv显著降低TNF -的生成和分泌α,il - 1β肺组织中il - 6和NR8383细胞,分别。

除了调节炎性细胞因子的表达,AC-Rev应该影响酶的激活和炎症介质参与发病机理。增殖蛋白激酶(MAPK)是守恒的细胞能量状态传感器可以被LPS激活(32,33]。更重要的是,激活MAPKs可能进一步导致肿瘤坏死因子等细胞因子的分泌——吗α和il - 1β等炎症介质的表达诱导一氧化氮合酶(间接宾语)和cyclooxygenase-2 (cox - 2)增强转录的NF -κB (34]。加上MAPKs, SIRT1也被视为一个关键传感器为炎症和代谢调制器,尤其是ARDS。此外,SIRT1之间的公司和MAPK在调停分子刺激没有反应或预处理是NF -密切相关κB (35,36]。根据这些线索,我们研究了SIRT1的表达和MAPK通路LPS-induced ARDS;结果表明,有限合伙人接触抑制SIRT1表达和增强p38 MAPK和ERK的磷酸化增加p-NF——紧随其后κB表达在体外和体内。然而,预处理AC-Rsv宽慰LPS-induced抑制SIRT1表达式和p38 MAPK的有限合伙人的影响限制,ERK和NF -κB在肺部和NR8383细胞。

进一步证实AC-Rsv的保护作用LPS-induced ARDS通过干扰SIRT1的表达,体外实验进行了cotreatment EX527和Rsv LPS刺激NR8383细胞。EX527是一种新型的SIRT1的高度选择性抑制剂能有效地抑制SIRT1的乙酰化酶活性(IC₅₀38 nmol / L) (37]。正如所料,LPS刺激减少SIRT1表达和肿瘤坏死因子的一代——增加α,il - 1β和il - 6,而Rsv治疗可以在一定程度上扭转这一趋势。然而,cotreatment EX527和Rsv抵消Rsv的衰减效应降低SIRT1的表达和加速代TNF -α,il - 1β和LPS刺激产生的il - 6。总的来说,这些结果表明,SIRT1激活的Rsv减毒NR8383细胞的炎症刺激有限合伙人,而抑制SIRT1的EX527可以中和Rsv的保护效应LPS-induced炎症和肺损伤。

总之,从目前的研究结果表明,AC-Rsv预处理治疗减毒LPS-induced ARDS通过抑制肺部水肿,抑制泄漏富含蛋白质的液体从血管到肺肺泡,并抑制小鼠的炎症过程。AC-Rsv的疗效的机制可能是通过MAPK / SIRT1的途径。虽然需要进一步的研究,目前的研究表明,AC-Rsv可能是一个潜在的治疗ARDS的代理。

利益冲突

作者没有利益冲突声明。

作者的贡献

李洁马和伊琳赵同样导致了论文。