文摘
的冬虫夏草物种一直是一个很好的来源的化合物具有抗癌和抗炎的活动。最近,我们报道了一种新型复合(4-isopropyl-2 6-bis (1-phenylethyl)苯酚,KTH-13)与抗癌活动隔绝冬虫夏草bassiana并创建了几个衍生品来增加它的药理作用。在这项研究中,我们测试了k - 013衍生品之一,4-isopropyl-2, 6-bis (1-phenylethyl)苯胺1 (KTH-13-AD1),关于macrophage-mediated炎症条件下抗炎活性。KTH-13-AD1明显抑制一氧化氮(NO)的生产和活性氧(ROS)在脂多糖(LPS)和硝普酸钠- (SNP)治疗macrophage-like细胞(RAW264.7细胞)。同样,这种化合物也减少mRNA的表达诱导没有合酶(间接宾语)和肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α),通过rt - PCR和实时PCR分析。有趣的是,KTH-13-AD1强烈减少NF -κB-mediated和核易位NF -荧光素酶的活动κB家族的蛋白质。按照KTH-13-AD1抑制NF -的上游信号通路κB激活,包括我κBα、IKKα/β一种蛋白激酶,p85 / PI3K和Src以时间和剂量依赖性的方式。Src的自身磷酸化和NF -κB超表达中观察到Src也被KTH-13-AD1镇压。这些结果强烈表明KTH-13-AD1具有强大的抗炎功能通过抑制的Src / NF -介导的κB管理循环。
1。介绍
在先天免疫的情况下,炎症反应介导的巨噬细胞,肥大细胞,对抗传染性病原体和中性粒细胞组成的一个重要障碍,如病毒、真菌和细菌,以及化学毒素(1,2]。在先天免疫的细胞成分,巨噬细胞被视为中央炎症细胞,识别外部病原体使用特殊的表面受体(例如,toll样受体(通常),广泛分布于人体。炎症反应由巨噬细胞及其在病理生理学作用之前研究[3]。巨噬细胞被激活的脂多糖(LPS)通过其counterreceptor, TLR4。活化巨噬细胞诱发各种细胞内的信号级联,包括Src,麦克米兰,phosphatidylinositide 3-kinase (PI3K),一种蛋白激酶的抑制剂κ(我κB)激酶(IKK)αβ,我κB (4- - - - - -6]。信号通路也刺激核的核转位因子——(NF)κB和激活蛋白AP-1,引发炎症基因的表达,导致分泌的炎症介质(如一氧化氮(NO)、活性氧(ROS)、前列腺素E2(铂族元素2)、趋化因子和细胞因子(例如,肿瘤坏死因子(TNF)α))(7- - - - - -9]。最近,充足的证据表明,不加以控制,长期炎症反应可以导致严重的免疫性疾病,包括糖尿病、感染性休克、癌症、关节炎、心血管疾病。炎症反应的理解和探索策略抑制炎症因此被认为是适当的方法来降低疾病的发病率(10- - - - - -13]。
的冬虫夏草属包括冬虫夏草,蛹虫草,冬虫夏草pruinosa,冬虫夏草bassiana生长在韩国、日本、中国和刚果。的冬虫夏草属可以通过传统的路线和管理是改善各种炎性疾病,包括编年史支气管炎、哮喘和湿疹。的生物和药理作用冬虫夏草antifibrotic属抗氧化、抗病毒,抗炎,antinociceptive,反血管增生,抗血小板聚集,抗糖尿病的14,15]。研究也证明了丁醇的抗炎机制(BF)和己烷(高频)的分数冬虫夏草bassiana(16]。然而,负责工厂的特定化合物的抗炎作用尚未阐明。最近,我们孤立的一个有前途的新颖化合物[KTH-13: 4-isopropyl-2 6-bis (1-phenylethyl)苯酚)的抗癌活性冬虫夏草bassiana(17]。尽管这部小说这种化合物的化学结构,建立了其总合成和衍生化的方法来开发更有效的分子。到目前为止,近60化合物新合成和测试来检查他们的活动采用试验和抗增殖活动。,有趣的是,KTH-13-amine-diastereomer 1 [4-isopropyl-2 6-bis (1-phenylethyl)苯胺1 (KTH-13-AD1)]据报道有更强的活动比原始化合物在抗癌方面的活动(数据未显示)。在这项研究中,因此,我们进一步旨在演示KTH-13-AD1潜在的抗炎,KTH-13的衍生物,探索其使用激活巨噬细胞的作用机制。
2。材料和方法
2.1。材料
硝普酸钠(SNP), 3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT) dihydrorhodamine 123 (DHR123),异硫氰酸荧光素(FITC)葡聚糖,抗坏血酸和有限合伙人(大肠杆菌0111:B4)从西格玛化工有限公司购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。胎牛血清,RPMI 1640人获得Gibco(美国纽约大岛)。小鼠巨噬细胞的细胞株RAW264.7和人类胚胎肾细胞(HEK) 293从美国购买类型文化集合(罗克维尔市,医学博士,美国)。从Calbiochem PP2得到(La Jolla、钙、美国)。荧光素酶结构包含绑定推动者NF -κB和AP-1教授涌的礼物,有年轻(釜山国立大学、釜山、韩国)和李,他肯定是个令人扫兴的人(庆北国立大学、大邱、韩国)。含磷的和总p65蛋白特异性抗体,p50, c-Fos c-Jun,我κBα、IKKβ,AKT p85 Src,麦克米兰,核纤层蛋白A / Cβ肌动蛋白从细胞信号技术(美国贝弗利,MA)。引物(表1)在我们实验室设计合成了Bioneer(大田、韩国)。
2.2。制备KTH-13-AD1
合成KTH-13-AD1(图1(一)),4-isopropylaniline溶液(4.00克,29.6更易)在二甲苯(14毫升)与苯乙烯混合(9.48克,91.1更易)和CF3所以3H(1.0毫升,11.4更易)。允许反应混合物加热到160°C和搅拌24 h。当时的反应是允许冷却至室温下挥发物被移除真空。由此产生的残渣被硅胶柱层析法纯化(己烷:层= 9:1)提供所需的KTH-13-AD1(2.60克,7.57更易,1:1非对映体)在26%的收益率棕色油。红外(IR)光谱KTH-13-AD1被记录在一个力量顶点70分光光度计,在cm中−1。乐队具有强大(s),中等(m)和弱(w)。1H核磁共振(NMR)谱的这种化合物被记录在JEOL JNM-AL400 (400 MHz)谱仪。化学变化是在ppm从四甲基硅烷溶剂作为内部标准(CDCl共振3:δ7.27 ppm)。数据报告如下:化学位移,多重性(s =单线态,d =紧身上衣,t =三联体,q =四方,和m =多重态),耦合常数(Hz)和集成。13C NMR光谱被记录在JEOL JNM-AL400 (100 MHz)谱仪完成质子解耦。化学变化是在ppm从四甲基硅烷溶剂作为内部标准(CDCl共振3:δ77.16 ppm)。低分辨率的质谱进行一个安捷伦6890 n的GC(惠普公司(hewlett - packard Co .),帕洛阿尔托,加州,美国。
(一)
(b)
(c)
(d)
1H NMR (400 MHz, CDCl3,非对映异构体1):δ7.40 - -7.12 (m, 12 h), 4.07 (q,J= 6.9赫兹,2 h), 3.29 (br年代,2 h), 3.00(9月,J= 6.9赫兹,1 h), 1.67 (d,J= 7.1赫兹,6 h), 1.37 (d,J= 7.1赫兹,6小时);13C NMR (100 MHz, CDCl3):δ145.8,139.4,138.9,130.2,128.7,127.5,126.3,123.5,40.2,33.7,24.4,22岁,2;红外(整洁):3471 (s), 3384 (s), 3060 (m), 3024 (m), 2982 (s), 2869 (s), 2293 (w), 1947 (w), 1878 (w), 1803 (w), 1623 (s), 1600 (s), 1471 (s), 1450 (s), 1373 (m), 1318 (m), 1257 (m), 1172 (m), 1027 (m), 881 (s), 761 (s)、700 (s)厘米−1;LR-MS (ESI):m / z计算出C25H30.N ([M + H]+344.2)344.2,发现。
2.3。细胞培养
RAW264.7和RPMI1640 HEK293细胞培养中补充10% heat-inactivated的边后卫,谷氨酰胺,抗生素(青霉素和链霉素)37°C公司5%2的气氛。在每个实验,细胞分离刮刀。检查在2×10的细胞密度6细胞/毫升透露,死细胞的比例一直根据< 1%台盼蓝染料排除作为生存的准则。
2.4。没有生产
RAW264.7细胞巨噬细胞(1×106细胞/毫升)培养18 h,使用KTH-13-AD1(0到200μ30分钟),进一步孵化有限合伙人(1μg / mL) 24 h。KTH-13-AD1的抑制作用LPS-induced没有生产由分析水平使用格里斯试剂,如前所述[18,19]。在550 nm (OD OD550年)测量使用SpectraMax 250标(分子器件、桑尼维尔,美国)。
2.5。活性氧测定的一代
细胞内ROS水平的决心通过记录荧光的变化造成的氧化荧光探针DHR123。简单地说,5×105RAW264.7细胞暴露于KTH-13-AD1(0到150μ米)30分钟,然后孵化与SNP在37°C(0.25毫米)20分钟诱导活性氧的生产。这些细胞被进一步孵化20μ为30分钟的荧光探针DHR123 37°C。荧光的程度,这与细胞内ROS水平,确定使用FACScan流式细胞分析仪(正),先前报道(20.]。
2.6。吞噬吸收测量
测量RAW264.7细胞的吞噬活性,我们修改之前报道的方法21]。RAW264.7细胞(5×104)使用KTH-13-AD1(0到150μ100年米)1 h, resuspendedμL磷酸缓冲盐(PBS)含1%人类AB血清,然后孵化FITC-dextran(1毫克/毫升)在37°C为20分钟。反应是停止通过添加2毫升冰冷的PBS包含1%的人类血清和0.02%的叠氮化钠。细胞被洗了三次与冷PBS-azide和分析FACScan流式细胞分析仪(美国正欲,圣何塞,CA),先前报道(20.]。
2.7。流仪结果
FITC-dextran或RAW264.7细胞ROS水平决定通过流仪分析(22,23]。RAW264.7细胞(2×106细胞/毫升)处理存在与否的KTH-13-AD1 FITC-dextran(1毫克/毫升)或DHR123 (20μ米)和染色洗缓冲区包含2%的兔血清和1%的叠氮化钠在PBS然后孵化direct-labeled抗体对冰额外的45分钟。与染色缓冲洗涤三次后,染色细胞分析在FACScan流式细胞分析仪(正)。
2.8。细胞生存能力测试
RAW264.7细胞(1×106细胞/毫升)培养18 h,之后KTH-13-AD1(0到150μ最后24米)添加或8 h的文化。的细胞毒性效应ATS-E3 KTH-13-AD1被评估使用传统的MTT测定,先前报道(24,25]。最后3 h(文化、10μL MTT方法(10毫克/毫升在PBS, pH值7.4)被添加到每个。孵化了添加15%十二烷基硫酸钠(SDS)对每个好,而随着甲瓒(26]。吸光度在570 nm (OD570 - 630)测量使用SpectraMax 250标(BioTek坏Friedrichshall,德国)。
2.9。信使rna表达的分析使用逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr),
RAW264.7细胞(1×106细胞/毫升)培养18 h,使用KTH-13-AD1(0到150μ米)为30分钟,进一步培养与有限合伙人(1μg / mL) 6 h。KTH-13-AD1的抑制作用伊诺和TNF的表达α决定使用半定量rt - pcr和实时定量逆转录-聚合酶链反应(存在),先前报道(18,27]。引物(Bioneer、大田、韩国)中使用这些反应是列在表中1。
2.10。质粒转染和荧光素酶报告基因活性测定
HEK293细胞(1×106细胞/毫升)转染有1μg质粒的表达β牛乳糖和NF -κB-Luc或AP-1-Luc存在与否的一个诱导分子(MyD88, TRIF或HA-Src)。转染进行使用裴方法12-well盘子,正如前面概述(28,29日]。转染细胞转染48 h后的所有实验使用。细胞治疗KTH-13-AD1每个实验的最后8 h。荧光素酶检测进行使用荧光素酶检测系统(WI Promega,麦迪逊,美国),如前所报道(30.]。
2.11。制备的细胞溶解产物和免疫印迹分析
RAW264.7细胞(5×106细胞/毫升)清洗三次在寒冷的PBS补充1毫米原钒酸钠,resuspended裂解缓冲(20毫米Tris-HCl, pH值7.4,2毫米EDTA, 2毫米ethyleneglycotetraacetic酸,50毫米β二硫苏糖醇甘油磷酸酯1毫米原钒酸钠1毫米,特里同x - 100 1%, 10%的甘油,10μ10 g / mL抑肽酶μg / mL抑肽素,1毫米苯甲酰胺和2毫米PMSF),细胞溶解,声波降解法和旋转30分钟在4°C。的溶解产物被离心澄清在16000 g×10分钟4°C和储存在−20°C到使用。细胞溶解产物的可溶性分数免疫印迹,和总磷蛋白质水平的c-Fos, c-Jun, p50 p65,我κBα、IKK AKT p85 Src,麦克米兰,核纤层蛋白A / Cβ肌动蛋白是可视化的,因为之前报道(31日]。
2.12。统计分析
数据表示为平均值±标准偏差(SD),计算从一个()两个独立的实验。其他数据是代表三个不同的实验也得到了类似的结果。结果进行统计比较,分析了使用方差分析/菸害的事后考验和克鲁斯卡尔-沃利斯/ Mann-Whitney测试。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。所有统计测试进行了使用SPSS(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。
3所示。结果与讨论
在先前的研究中,我们和其他研究者已经报道了抗炎、抗癌、免疫调节活动冬虫夏草bassiana(32- - - - - -35]。不像其他的冬虫夏草物种,如蛹虫草和冬虫夏草,却很少有研究的活性成分上进行冬虫夏草bassiana。最近,我们发现了一个有前途的新的化合物称为4-isopropyl-2 6-bis (1-phenylethyl)苯酚与抗癌活性与一些癌症细胞系,如C6神经胶质瘤和mda - mb - 231 (33]。我们进一步建立了这种化合物的全合成方法,以促进其大规模生产和衍生。在这项研究中,我们测试了一个(KTH-13-AD1(图1(一)))的衍生品,特别是这种化合物是否能够抑制macrophage-mediated炎症反应。
如图1 (b),左面板的生产没有减少达70%剂量依赖性的方式通过KTH-13-AD1 LPS-stimulated macrophage-like RAW264.6细胞在150μ米,尽管它没有下调没有释放SNP,药物直接发布没有(36体外(图)1 (b)右面板)。这些结果表明,KTH-13-AD1不作为化学直接中和剂,而是作为一个调制器的生物合成在治疗后TLR4刺激有限合伙人。在类似的方式,彻底清除活动观察KTH-13-AD1只在100年和150年μ当应用于SNP-treated细胞(图1 (c)左面板),但不是在DPPH实验(图1 (c)右面板)。由于KTH-13-AD1没有抑制RAW264.7细胞(图的可行性1 (d)),结果表明,虽然这种化合物没有直接的抗氧化活性,它显示抗炎作用,间接抑制炎症介质的产生,如没有,人参皂苷类似,只有消炎(37,38]。但是,与这些化合物,黄酮类化合物(木樨草素,例如,槲皮素和山柰酚)和蒽醌类(例如,rhodoptilometrin),是许多药用植物的活性成分和已报告证明抗氧化和抗炎活动(39- - - - - -42]。
确定的机制KTH-13-AD1抑制没有生产,我们调查TLR4-mediated转录激活水平LPS-treated RAW264.7细胞用KTH-13-AD1预处理。首先,我们评估促炎基因的mRNA水平,包括伊诺和TNF -α使用实时定量和半定量的PCR。如数据所示2(一个)和2 (b)KTH-13-AD1 (150μ米)的mRNA水平显著降低伊诺和TNF -α,这表明KTH-13-AD1-driven抑制炎症反应发生在转录水平。自NF -κB和AP-1是代表转录因子调节炎症反应(43,44),我们决定的能力,这种化合物抑制NF -的激活κB和AP-1使用与启动子荧光素酶报告基因分析网站的NF -κB和AP-1。来确定KTH-13-AD1调节炎症基因启动子活动,我们进行预处理KTH-13-AD1 30分钟之前激活HEK293细胞随着PMA, PKC的活化剂诱发炎症信号通路(45]。如图2 (c)荧光素酶活动由NF -κB和AP-1 PMA,大大提高了500 - 40倍。有趣的是,KTH-13-AD1(100年和150年μ米)强烈抑制NF -κB-mediated荧光素酶活性(图2 (c),但不是AP-1(图左面板)2 (c)右面板)。它也被报道,MyD88 TRIF,适配器分子调控TLR4-mediated胞内信号通路(46),是良好的荧光素酶活性在HEK293细胞中诱导物47,48]。结果在图2 (d)支持这个结论,因为这些分子cotransfection增加NF -κB -和AP-1-mediated荧光素酶活性4000 - 250倍,分别见先前的研究[48]。比较这两个条件,MyD88-induced NF -κB激活被KTH-13-AD1强烈抑制,与100年μ米复合抑制活化的45%(图2 (d))。此外,KTH-13-AD1减少核易位的NF -κB亚基p65 p50 30和60分钟,尽管没有抑制在15分钟(图2 (e))。这些结果表明NF -κ影响激活NF - B信号通路κB二聚在30到60分钟KTH-13-AD1可能是一个潜在的目标。这些抑制模式KTH-13-AD1观察到治疗似乎也暗示NF -κB激活信号可能被一些上游信号及时监管单位。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
为了证明这种可能性,我们随后关注识别NF -κB监管认可这种化合物的途径。我们进一步研究了上游的磷酸化水平NF -κ激活蛋白。首先,我们决定我的磷酸化水平κBα,一个重要的步骤在NF -核易位κB (49]。我的磷酸化κBα被KTH-13-AD1 15岁、30和60分钟,虽然总形式的吗κBα在30和60分钟大大增加,而有限合伙人单独治疗(图3(一个)),这意味着这种化合物能够抑制磷酸化和退化的我κBα30分钟至1小时。此外,KTH-13-AD1减少IKK的磷酸化α/β我的上游,κBα5分钟(图3(一个))。同样,一种蛋白激酶的磷酸化和p85 / PI3K上游IKK激活酶,被KTH-13-AD1在3 - 5分钟(图3 (b))。此外,Src磷酸化发生1和3分钟也抑制了这种化合物(图3 (b))。证实了我们的结论,我们评估活动的细胞和细胞龛之间的剂量反应关系KTH-13-AD1假定的目标蛋白质的磷酸化水平,p85 / PI3K和Src。见图3 (c)的磷酸化p85和Src被KTH-13-AD1不断减少(100年和150年μ在相同的条件下)。作为这些结果强烈表明,假定的目标KTH-13-AD1 Src,我们接下来分析这种化合物是否能调节Src的自身磷酸化,使用一个超表达策略,先前报道(50,51]。如图3 (d)KTH-13-AD1(100年和150年μ米)显然Src磷酸化水平降低,这意味着Src直接调制这种化合物。这是进一步的推广活动支持的NF -κB, Src过度刺激,也被KTH-13-AD1(图3 (e))。基于这些结果,我们建议Src作为潜在的靶蛋白KTH-13-AD1-mediated抗炎行动。许多抗炎化合物,天然和化学合成,被发现对Src具有直接抑制活性激酶(50- - - - - -52]。此外,先前的研究已经报道了Src NF -下活动κB激活和炎症基因表达(51,53,54Src的),这意味着一个重要的角色在炎症反应和致癌活性。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
最后,为了证明KTH-13-AD1调节巨噬细胞吞噬吸收,FITC-dextran应用RAW264.7细胞在接触这种化合物。如图4由KTH-13-AD1没有抑制吞噬作用,以FITC-derived荧光(55,56];然而,在100年和150年观察显著增强μ米的浓度,这意味着复合刺激巨噬细胞吞噬作用,先天免疫应答的重要一步。这一结果表明,先天免疫反应可能由KTH-13-AD1通过不同的细胞机制。
总之,KTH-13-AD1展示了令人印象深刻的抑制炎性介质的生产,包括活性氧和不,没有诱导细胞毒性,而这种化合物强烈增强实验,表明KTH-13-AD1能够调节细胞反应和先天免疫相关。此外,NF -的转录激活κB和它的上游信号通路,由Src、p85 / PI3K和AKT,被KTH-13-AD1,总结在图5。因此,本研究建议KTH-13-AD1 KTH-13提取的化学模拟冬虫夏草bassiana作为抗炎药,临床效用。在将来的研究中我们将重点分析这种可能性。
信息披露
作者仅负责内容和论文的写作。
利益冲突
作者报告没有利益冲突。
承认
这项工作的支持下进行了“农业科技发展合作研究项目(项目没有。PJ009241),“农村发展管理、韩国。