文摘
氧化应激的特点是一个积累的活性氧(ROS)和炎性疾病的进展中发挥着关键作用。我们假设缺氧和炎症活动诱发氧化应激在牙周韧带(PDL)通过激活NOX4。人类主要PDL成纤维细胞和脂多糖刺激Porphyromonas gingivalis(LPS-PG)牙周病原体细菌在常氧和缺氧条件下。通过定量PCR,免疫印迹、免疫染色和特定的ROS分析我们确定NOX4, ROS和几个氧化还原系统。健康和炎症牙周组织收集评估NOX4通过免疫组织化学和氧化还原系统。我们发现显著增加NOX4水平在PDL细胞(缺氧或炎症刺激后)的组合刺激后更加明显。这是伴随着一个重要upregulation ROS和过氧化氢酶()。然而,长时间的孵化与刺激诱导减少过氧化氢酶显示崩溃的防护机械支持ROS增加和炎性口腔疾病的进展。分析发炎组织证实了我们的假设。总之,我们证明了NOX4和氧化还原系统的相互作用是至关重要的ROS形成口腔疾病过程中起着举足轻重的作用。
1。介绍
氧化应激描述代谢状态的活性氧(ROS)明显高于生理水平增加。ROS源自分子氧的减少不完全导致的累积氧化剂如过氧化氢(H2O2)或自由基和过氧化物超氧化物阴离子()。它们不断在细胞生成的副产品的正常有氧代谢途径通过氧化磷酸化链。外在因素,如辐射、缺氧、吸烟、热、创伤、化疗、生长因子、细胞因子可能增加活性氧的形成(1- - - - - -3]。低或生理的ROS水平可以激活胞内信号通路相关的增殖,分化,和其他细胞功能,而不受控制的释放可能会破坏DNA,脂类,蛋白质可能导致突变或致癌作用[4- - - - - -7)尽可能多的癌细胞也增加活性氧的水平。因此,ROS的入侵和发展促进肿瘤通过基质金属蛋白酶(MMP)激活。
主要的活性氧,,主要是由单胺氧化酶类,所谓NADPH-oxidase (NOX)蛋白质,在配合物我和第三的电子传递链8]。氮氧化物蛋白表达在多种组织和代表唯一已知的酶系统,其主要生理功能是产生活性氧。他们促进氧的还原过氧化物用NADPH作为电子供体(9]。这些酶是第一次描述了在吞噬细胞呼吸破裂是一个重要的防御机制对细菌。在过去几十年5氮酶(NOX 1 - 5)和两个双氧化酶类(Duox) Duox1 Duox2,发现了被证明是表达不仅在吞噬细胞,而且在上皮细胞,脂肪细胞,或心脏成纤维细胞9,10]。
NOX4 NADPH-oxidase家族成员,原本Renox,第一次被描述在肾细胞强烈表达(11]。后来,NOX4也发现在其他类型的细胞,如内皮细胞、成纤维细胞,角质细胞,破骨细胞(9,11,12]。通常transmembranously位于酶调节响应endoplasmatic网压力(13],剪切应力[14)、缺氧或缺血(15,16]。此外,细胞因子如转化生长因子(TGF -)1、肿瘤坏死因子(TNF)和胰岛素样生长因子- 1 (IGF)诱导NOX4表达式(9,17]。此外,这种酶似乎是一个细胞的氧传感机制的一部分。这是支持的事实之间存在多个交互NOX4,缺氧诱导因子- 1α(HIF-1)、活性氧(18,19]。NOX4-derived活性氧与各种相关流程,例如,细胞凋亡,胰岛素信号传导,细胞分化、衰老和骨重建9,20.,21]。
限制ROS的潜在有害影响几个保护机制已经进化。在线粒体解偶联代谢是一个机制来调节活性氧的生产。在健康细胞,过量的活性氧是分解的保护性的抗氧化机制。根据他们的催化功能活性氧解毒过程,这些氧化还原酶被分组在不同系统或家庭,如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽系统,或硫氧还蛋白。此外,也有非酶的或小分子包括维生素C和E,丙酮酸、黄酮类化合物、辅酶q,类胡萝卜素,许多植物的抗氧化剂参与活性氧清除(6]。
氧化应激是获得越来越多的利益作为一种重要的辅助因子在不同的口腔和牙齿疾病的病因和发病机理包括牙髓的或粘膜炎症,肿瘤发展,或牙周炎的炎症过程。第一个证据ROS在牙周组织的存在和作用是由这些分子呼吸破灭后的检测多形核的淋巴细胞(PMNLs)牙周损伤(22]。从那时起,ROS的含义及其降解酶SOD和猫在牙周疾病的发病机制一直是由几组(23- - - - - -26]。高活性氧水平可能也是一个链接元素之间的肥胖,糖尿病,动脉粥样硬化,和慢性牙周炎27]。此外,还有许多干预研究调查抗氧化剂和抗氧化剂微量元素在牙周治疗包括使用口冲洗和牙膏。这些研究提供了有益的证据,但某些抗氧化物种之间的联系和致病机制仍下落不明22]。这也是对ROS和氧化还原系统的出现在人类口腔健康或牙周组织。
牙周组织包括牙槽骨、牙齿和齿龈以及牙周韧带(PDL)连接牙齿和周围的牙槽骨。PDL的胶原结构函数作为shock-reabsorbing屏障保护组织免受机械力(28]。这些力量可能诱发局部缺氧和炎症(29日]。研究表明,牙周致病菌Porphyromonas gingivalis(p . gingivalis)引发慢性牙周炎的发生和持续时间30.]。p . gingivalis是一种革兰氏阴性厌氧细菌属于红色的复杂的口腔微生物区系依照他们的致病性31日]。p . gingivalis是最著名的牙周病原体和是与artherosclerosis和心血管疾病相关。模仿牙龈沟的微环境,它的特点是低氧张力(32在我们的实验中,我们包括缺氧条件。自p . gingivalis是一种厌氧细菌,缺氧牙龈沟代表这些细菌扩散的理想场所。此外,炎症本身可能导致组织缺氧的发展由于耗氧量的增加,例如,通过入侵的免疫细胞(33]。
居民在牙周膜细胞也参与炎症和免疫过程导致细胞因子(即。白介素- 1 (IL)或肿瘤坏死因子-)或趋化因子释放这可能会进一步增强炎症(34]。PDL成纤维细胞负责维护、改造和维修的PDL的细胞外基质。他们的免疫调节能力被证明在一些最近的研究(35,36]。当地的活性氧积累可以促进促炎细胞因子的诱导与连续激活的巨噬细胞37)最终导致牙周破坏通过基质金属蛋白酶(38]。
在体外在细胞水平上研究评估氧化应激一直专注于牙龈成纤维细胞,而PDL细胞很少分析。低锌环境下,人类PDL成纤维细胞显示增加氧化应激(39]。类似的结果被发现后尼古丁、乙醇或金属接触后被取消的不同抗氧化剂治疗(40,41]。刺激实验在人类牙龈成纤维细胞(hgf)支持我们的假设,PDL细胞在牙周疾病可能发挥关键作用。作者表明,暴露在脂多糖p . gingivalis(LPS-PG)或有限合伙人大肠杆菌(LPS -大肠杆菌)过氧化物浓度增加26],活性氧的水平和表现[42),促炎细胞因子在胶质瘤(43]。ROS redox-sensitive转录因子的激活,激活核factor-kappaB (NF -κB) (43),这是极度参与调节细胞因子和MMP的表达。NF - - -的重要性κB还演示了NOX4之间的交互,HIF-1和活性氧18,19]。
然而,证据的介入PDL细胞细菌或低氧诱导活性氧的形成是失踪。也是如此的平衡NOX4牙周膜和氧化还原系统。因此,本研究的目的是定义在PDL NOX4和活性氧的形成的作用,特别是在炎症和缺氧事件。我们假设ROS是由缺氧和炎症刺激导致PDL细胞和牙周组织的不平衡NOX4和氧化还原系统激活。目前的研究将提高氧化应激所扮演的角色的知识在牙周组织中可能改善口腔疾病的诊断和治疗策略。
2。材料和方法
2.1。隔离和PDL细胞的特征
人类牙周韧带成纤维细胞收获来自caries-free和牙周健康的前磨牙患者12岁至17岁的年),它必须提取由于矫正的原因。排除标准是急性或慢性炎症。没有药物的病人;他们收到后在提取和局部麻醉镇痛提取。伦理委员会批准,波恩大学的家长和患者津贴。细胞收获如前所述[44]。总之,收集细胞中间部分的牙根,以避免污染细胞来源于齿龈和口腔细菌。利用外植体技术,PDL细胞在杜尔贝科的基本培养基培养(DMEM,表达载体,卡尔斯鲁厄,德国)补充10%胎牛血清(的边后卫,英杰公司),100单位的青霉素、链霉素和100毫克/毫升(Biochrom,柏林,德国)37°C在湿润的气氛中5%的有限公司2。细胞从九个不同个体的表型的分析已知PDL标记(碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC),骨桥蛋白(OP) periostin,和S100 A4)在第三段40]。后表型出现三个细胞株汇集在第四或第五段和用于实验。
2.2。细胞实验
细胞被播种(50.000细胞/)six-well盘子和融合增长到80%。细胞培养在常氧(21%啊2和5%的公司2(1%)或缺氧条件O2和5%的公司2153年INCO, O2/公司2孵化器;Memmert GmbH是一家现代化的、12月7、德国)2,4,8、24、48小时或不增加1μg / mL超纯脂多糖Porphyromonas gingivalis(LPS-PG)(美国圣地亚哥Invivogen)。在开始研究之前,我们分析了PDL细胞的剂量反应对NOX4和H的可诱导性2O2释放LPS-PG治疗。最大感应检测刺激后1μ克/毫升LPS-PG和没有进一步增加观察LPS-PG浓度提高时。
2.3。基因表达分析
与4 M细胞细胞溶解guanidinthiocyanat(罗斯,卡尔斯鲁厄,德国)和总RNA提取使用酸硫氰酸胍盐/苯酚/氯仿萃取法(45]。共有1μg的RNA是reverse-transcribed cDNA Moloney使用200 U的小鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶(Bio-Rad,慕尼黑,德国)。cDNA表达被实时PCR (rt - PCR)检测到使用特定引物(18岁:前轮驱动:CGGCTACCACATCCAAGGAA,牧师:GCTGGAATTACCGCGGCT NOX4:前轮驱动:TCTGCCTGTTCATCTGGCTCTCCA,牧师:AGCCAAGAGTGTTCGGCACATGGGTA)和绿色SYBR荧光染料在ViiA7检测系统(应用生物系统公司,达姆施塔特,德国)。两个μ20 L (cDNA作为模板μ包含10 L反应混合物μL QuantiTect SYBR绿色主人混合(试剂盒、希尔登,德国)。混合物最初被加热到50°C 2分钟和95°C 15分钟紧随其后的是40周期在95°C与变性15秒和退火和延伸60°C 1分钟。互补脱氧核糖核酸是规范化的具体数量的看家基因18岁和cDNA表达计算相对表达各自的控制。
2.4。免疫印迹
蛋白定量,皮尔斯BCA蛋白质化验设备(美国罗克福德热科学)使用。后添加4 x样品缓冲(50毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值6.8,2% (w / v) SDS, 5% (v / v) 2-mercaptoethanol, 0.0125%溴酚蓝,和1%甘氨酸),50μ克每车道总细胞溶解产物受到7.5% sds - page和转移到硝酸纤维素(0.2μ米孔隙大小;施莱克尔& Schuell Microscience Dassel,德国)。蛋白质转移的效率、平等加载染色证实了膜与朱红色年代(西格玛奥德里奇,慕尼黑,德国)。膜在一夜之间被封锁在4°C和5% (w / v)脱脂牛奶TBS-T(10毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.5,100毫米氯化钠和0.05% Tween-20)和洗TBS-T孵化前的兔多克隆抗体对NOX4 (Abcam,剑桥,英国)在室温下2 h。美国圣克鲁斯ß-Actin(圣克鲁斯生物技术)作为平等的标志蛋白质装载。与TBS-T洗涤后,合- - - - - -(辣根过氧化物酶)共轭anti-rabbit IgG抗体(新英格兰生物学实验室)补充道。免疫反应性的蛋白质被化学发光可视化(Amersham化学发光设备)和暴露在x光片(爱克发、Mortsel、比利时)。Densitometrical分析使用免费的图片处理软件ImageJ 1.43 (http://rsb.info.nih.gov/ij/)。
2.5。Amplex红试验
过氧化氢(H2O2)检测、商用N-acetyl-3 7-dihydroxyphenoxazine (Amplex红色)过氧化氢/过氧化物酶测定工具包(分子探针,尤金或)使用。无色试剂与过氧化氢反应(H2O2用辣根过氧化物酶(合)催化H2O2端依赖氧化nonfluorescent Amplex红色荧光resorufin红。这只试验检测过氧化氢的释放,因为大小的合阻止它进入线粒体。因此,与500年PDL细胞被孵化μL Amplex红色和0.1 U /毫升过氧化物酶添加在37°C为30分钟。吸光度测量在565 nm 1, 2, 4小时。在的过程中,激发光强度是控制到最低推荐赵et al。46]。
2.6。免疫荧光
为此,PDL细胞培养在封面融合滑落至60%。PDL细胞染色常氧或缺氧条件下对NOX4和氧化还原系统的存在和缺乏LPS-PG。缺氧条件下获得通过将氧浓度的细胞在一个孵化器O可以调整到1%2、平衡公司为5%2和N2在孵化的气氛(153年INCO, O2/公司2孵化器;Memmert GmbH, 12月7,德国)。在实验的最后,被媒介;细胞被洗了三次与PBS和固定250μL冷却甲醇/丙酮(1:1)−20°C 10分钟。解决办法是删除和细胞保持在室温下10分钟晾干。与3% BSA-PBS阻塞后10分钟,细胞被孵化与抗体(Ab)针对NOX4 (Abcam),猫,或者SOD (Abcam) 1: 50在PBS, 3% BSA, 2小时。细胞被洗前与PBS特有的二级Ab (PBS稀释1:400)添加了额外的90分钟。细胞被覆盖在幻灯片DAPI包含安装介质(Dako)。第二天细胞与A1的蔡司Axio成像仪扫描荧光显微镜(HBO 100;德国卡尔蔡司,耶拿),一个AxioCam MRc相机(卡尔蔡司)和AxioVision 4.7软件(卡尔蔡司)。密度分析使用免费的图片处理软件ImageJ 1.43 (http://rsb.info.nih.gov/ij/)。量化的相对荧光强度是由测量每个细胞与细胞区域的强度。获得灰度图片,每个处理使用的工具“颜色”和“分离通道”ImageJ导致红、绿、蓝color-fractionated灰度图片为每个通道。只有绿色分离照片是用于计算的相对荧光强度。
2.7。免疫组织化学
从临床牙周组织健康的病人(我)以及来自患者的诊断牙龈炎(II)和牙周炎(III)从三个不同的病人为每个组。诊断牙龈炎和牙周炎是由牙科诊所的医学专家。牙龈炎的特点是可逆的齿龈的局部炎症反应,可见发红,肿胀,出血。相比之下,牙周炎影响四个不同的结构:齿龈,牙周韧带,牙齿和牙槽骨。因此,被诊断为牙周炎的增加探测深度、出血,和附件损失由射线照片。组织磷酸盐固定在4%多聚甲醛24 h,其次是水合作用和在一个提升乙醇系列脱水,石蜡包埋。后来,4μ米厚的石蜡包埋部分准备、deparaffinized水化,冲洗TBS, pH值7.4 10分钟,然后浸泡在含有700毫升70毫升甲醇30%的H2O245分钟在黑暗中阻断内源性过氧化物酶活性。之后,组织部分被冲洗和preincubated TBS / BSA 4%为20分钟,以避免非特定的背景染色。孵化的单克隆抗体主要NOX4 (Abcam,剑桥,英国)和多克隆抗体的过氧化氢酶和SOD (Abcam) 1: 100 TBS的工作解决方案/ BSA在4°C一夜之间进行调湿室。随后,部分在TBS洗和孵化peroxidase-labeled聚合物共轭山羊anti-rabbit免疫球蛋白作为现成的解决方案(设想;Dako / S,斯特鲁普、丹麦)30分钟在室温下在湿室。抗体复合物可视化使用diaminobenzidine 10分钟导致棕色染色。此后,幻灯片冲洗,迈耶的苏木精复染色,再次冲洗,淹没了。消极的控制由遗漏的主要抗体,以及主数据和辅助使用TBS / BSA抗体的染色过程。最后,组织部分进行了分析使用蔡司AxioScop 2显微镜(卡尔蔡司,耶拿,德国)。
2.8。统计分析
所有的实验进行了一式三份并给出mRNA量化手段SD。方差分析结果进行了比较;Dunnett和Tukey-Kramer测试进行后续测试的计算处理和对照组之间的差异是否显著。一个0.05被认为是重要的价值。
3所示。结果
3.1。NOX4
人类主要PDL细胞常氧和缺氧条件下孵化的存在与否LPS-PG (1μg / mL)。治疗LPS-PG诱导时间显著增加的mRNA表达NOX4比未经处理的控制(图1(a))。详细NOX4 mRNA水平显著增加两小时后LPS-PG刺激;增加达到显著水平(4倍)后4小时()。NOX4 mRNA水平与LPS-PG 8个小时的刺激后达到顶峰,之后回到基线水平。
缺氧诱导NOX4在PDL细胞的表达,但在与LPS-PG刺激相比,最大的NOX4 mRNA upregulation检测后4小时(;图1(a))。随后,NOX4 mRNA表达下降;然而,它保持在一个更高的水平与对照组相比甚至24或48小时后(图1(a))。最高增加NOX4 mRNA表达检测后,两者的结合刺激(8.5倍),这是统计学意义比控制,甚至比LPS刺激下normoxia (;图1(a))。
证明是否增加mRNA表达之后,蛋白质含量的增加,免疫荧光染色对NOX4进行。NOX4检测主要在胞液和轻微程度的核心如果PDL细胞(图1(b))。得到更详细的信息的时间进程NOX4蛋白质诱导缺氧和炎症刺激后,我们进行了免疫印迹。2小时后只缺氧引起显著增加NOX4蛋白(),之后下降(图1(c))。在常氧条件下治疗显着海拔NOX4 LPS-PG诱导蛋白质经过4个小时的孵化相比单独控制和缺氧(;图1(c))。LPS-PG效应更明显在缺氧条件下相比其他组统计学意义(;图1(c))。24小时孵化后,改变NOX4蛋白质含量不再检测(数据未显示)。这些发现符合我们的信使rna结果即使我们发现时间差异。
3.2。H2O2形成
确定过氧化氢的一代,我们使用商用Amplex Red-horseradish过氧化物酶测定。PDL细胞显示较低的本构H2O2在常氧条件下生产。我们观察到的一个重要upregulation H2O2集中后的细胞培养上清液1,2,4小时LPS-PG的刺激。独自缺氧诱导显著增加H2O2形成相比time-matched控制(图2)。而在LPS组H2O2值最高的1小时后(图2和4小时后开始不断下降2),在缺氧条件下H2O2永久增加(图2)。比较有限合伙人和缺氧效应仅显示缺氧诱导显著高于H2O2积累在完整的观察期间()。然而,两者的结合刺激引起最高的H2O21小时后浓度相比不仅是重要的控制也比较有限合伙人和缺氧组(图2)。2小时后治疗LPS-PG不再是能够提高低氧诱导H2O2形成;还显著增加控制和LPS刺激相比,但不再相比低氧组。这是4小时后更加明显。
3.3。氧化还原系统
对活性氧的形成分析哪些保护机制参与我们的设置,我们确定氧化还原系统组件过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)在PDL细胞治疗后与常氧和缺氧条件下LPS-PG免疫荧光(数字3(一个)- - - - - -3 (b))。此外,从临床牙周组织健康的病人(I)以及患者的诊断牙龈炎(II)和牙周炎(III)从三个不同的病人获得NOX4每组和免疫组织化学染色,猫和SOD(数字4,5,6)。
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3.3.1。免疫荧光在PDL细胞氧化还原系统
PDL细胞显示本构在常氧条件下胞质过氧化氢酶表达。治疗LPS-PG和缺氧诱导PDL细胞形态学的变化,这是一个小时后的第一个明显的缺氧条件下孵化和与LPS-PG 2小时后(图3(一个))。如图3 (b),分析过氧化氢酶细胞质密度与常数单元区域显示的重要upregulation过氧化氢酶与LPS-PG PDL细胞刺激或缺氧后1 h (;图3 (b))。这也适用于低氧条件2 h后相比,所有其他组织。炎症刺激下(LPS)显著增加过氧化氢酶细胞质密度4小时后检测相比,所有其他组(;图3 (b))。相反,两者的结合刺激减少缺氧,以及LPS-induced影响后1,2,4小时。确定超氧化物歧化酶PDL细胞蛋白表达在任何时间点没有显著差异(;数据未显示)。
3.3.2。免疫组织化学NOX4和氧化还原系统的牙周组织部分
(牙周组织健康的牙龈和牙周韧带(PDL),牙龈炎,牙周炎)从三个不同的病人获得了每组。
NOX4。健康的牙周组织样品中只有很弱的免疫染色NOX4可以获得(数字4(一)和4 (b))。在PDL弱免疫反应性温和一些观察成纤维细胞的染色。在发炎组织从患有牙龈炎或牙周炎,强烈免疫反应性NOX4出现在角化细胞的胞质和更强的核发炎的牙龈上皮的基底层(数字4 (c)- - - - - -4 (d))。牙龈和PDL的成纤维细胞和白细胞等免疫细胞在血管,细胞溶质的免疫反应性主要是限制和细胞壁(数据4 (c)- - - - - -4 (d);见红色箭头)。
猫。几乎没有免疫染色可以在健康的牙龈上皮细胞(图5(一个))。在健康的自由人民党,主要PDL细胞附近齿根表面染色(图5 (b);见红色箭头)。在牙龈炎组织,疲软的牙龈角质细胞的染色可以看到类似于健康组织(图5 (c))。相反,在牙周炎患者的组织标本中可观察到一个强大的免疫反应性牙龈层可能指的是免疫细胞的细胞核染色像白细胞(图5 (d);见红色箭头)。
草皮。至于健康组织,牙龈上皮显示中度到强烈的角化细胞的免疫反应性主要是局限于细胞溶质(图6(一);见红色箭头)。在健康的牙周组织,牙龈和PDL成纤维细胞弱染色(图6 (b))。发炎组织相比,似乎基底上皮细胞染色更集中在齿龈炎标本(数字6 (c)- - - - - -6 (d))。此外,subepithelium显示局部细胞免疫反应性牙龈成纤维细胞和免疫细胞(图6 (c))。在牙周炎彩色部分,SOD疣状似乎局限于牙龈上皮细胞(图6 (d);见红色箭头)。牙龈发炎组织层显示没有免疫反应性的迹象。
4所示。讨论
讨论了氧化应激作为一种重要的辅助因子在几个口腔和牙齿疾病的病因和发病机制,例如,在牙周炎的炎症过程。第一个证据ROS在牙周组织的存在和作用是由这些分子呼吸破灭后的检测多形核的淋巴细胞(PMNLs)牙周损伤(22]。从那时起,ROS的含义及其降解酶SOD和猫在牙周疾病的发病机制一直是由几组(23- - - - - -26]。分析牙周膜细胞氧化还原系统是否受到炎症条件的影响,我们研究了缺氧和有限合伙人的效果Porphyromonas gingivalis(LPS-PG)牙周韧带细胞。我们表明,两种刺激诱导显著增加的NOX4和过氧化氢的重要upregulation生成。氮氧化物酶最初描述的吞噬细胞是负责对病原体的防御机制使用NOX-generated活性氧分子。直到那时,NOX4表达式中已经检测到nonphagocyte细胞肾细胞、破骨细胞、成骨细胞和真皮细胞(9,11,47]。在PDL细胞、缺氧和LPS-PG诱导NOX4 mRNA的显著增加。蛋白表达主要位于胞质,但同样在细胞核中。我们的发现符合布朗和Griendling谁表明,通常在不同的细胞跨膜分子是本地化的隔间(9]。
NOX4是活性氧的主要来源之一,一代高度,无所不在地表达了比其他家庭成员。Mandal和他的同事证明了除了它的抗菌功能NOX4不仅对破骨细胞,还负责preosteoblast分化通过活性氧积累加强NOX4的想法作为一个关键调节器在骨重建生理ROS含量(47]。动物研究支持的假设大量活性氧形成诱导骨吸收通过NOX4 [20.,21]。而生理水平的NOX4-generated PDL细胞ROS可能促进牙槽骨改建,大量活性氧积累在炎性牙周疾病可能会导致牙槽骨破坏支持牙齿脱落。我们首先证明NOX4调节牙周韧带成纤维细胞在细菌和缺氧事件。因此,自由人民党成纤维细胞可能是过多的活性氧生成的源泉,因此在牙周疾病尤为重要。
我们的研究结果支持当前结果确定氧化应激的作用在不同牙周疾病,结果表明NADPH-oxidases和氧化还原系统之间的平衡是维持细胞和组织内稳态的关键(22- - - - - -26]。然而,只有少数研究的上下文中使用人类牙周纤维母细胞氧化应激和没有一个评估NOX4和抵消氧化还原系统的作用在炎症条件下LPS-PG刺激和缺氧。增加了活性氧生成后被圣米格尔等人发现PDL与尼古丁刺激纤维母细胞抗氧化治疗后或乙醇废除(40]。他们完成了结果使用镍等金属离子PDL刺激这些细胞ROS增加活动表明金属细胞毒性作用,甚至镍过敏(41]。瞬态镍和钴等金属离子被模仿细胞缺氧的抑制作用主要是由于prolyl水解酶(pdh)和asparaginyl水解酶(factor-inhibiting HIF(富士康))。羟基化的抑制导致HIF-1核易位后跟不同基因的转录与低氧适应,免疫反应,或血管生成,因此间接支持我们的结果在缺氧条件下(48,49]。
我们可以表明,缺氧以及LPS-PG诱导活性氧的形成通过检测H2O2使用商用Amplex红试验。高水平的H2O2在缺氧条件下1和2小时后公布在PDL细胞可能是由于不同的机制。首先,我们发现了一个重大upregulation信使rna和蛋白质的H2O2模型酶NOX4。第二,缺乏分子氧作为最终电子受体在呼吸链中可能负责提前释放活性氧。LPS-PG感应敏锐地一个小但显著增加H2O2释放,提高了低氧诱导的一代。在人类牙龈成纤维细胞相似的结果,显示增加活性氧和抗氧化剂p . gingivalis或LPS刺激26,42,43]。有趣的是,尽管NOX4 mRNA和蛋白表达增加与LPS-PG 4小时的刺激后在缺氧条件下,H2O2代独自相比显著降低缺氧。呼吸链的一个额外的抑制所述LPS-PG心脏线粒体[50因此可以想象。
对抗氧化应激、细胞发达一些抗氧化的酶系统。因此,我们测量了SOD和CAT表达式在PDL细胞和牙周组织免疫荧光和免疫组织化学。杆近年负责过氧化氢过氧化物自由基的歧化作用[51]。水和氧气的减少过氧化氢是随后被猫催化广泛表达。这两种酶维持细胞氧化还原体内平衡至关重要。目前的数据暗示PDL细胞和牙周组织有基本国防机械对细菌由NOX4-dependent诱导活性氧生成以及保护性的氧化还原系统。这是非常重要的关于高口腔菌群的数量和多样性。不同的研究表明氧化还原系统发展的关键球员的牙周疾病和标记牙周健康状况(52- - - - - -56]。我们发现一个显著增加PDL细胞中过氧化氢酶反应有限合伙人以及1和2小时后缺氧。似乎在我们的设置中,自由人民党成纤维细胞中和有限合伙人和低氧诱导活性氧的形成与猫的高度表达。但长期在低氧条件下孵化未能提高过氧化氢酶。ROS生成以来仍在这些以后点升高,推迟ROS退化可能的解释。综上所述,戏剧性的海拔ROS的组合形成缺氧和LPS-PG一方面减少过氧化氢酶在相同条件下另一方面增加氧化应激在牙周组织有利于炎症的恶化和骨吸收,最后可能导致牙齿脱落。
ROS生成之间的平衡的基本作用和抗氧化机制在牙周炎症过程是由我们的免疫组织化学研究。患者患有牙周炎症如牙龈炎和牙周炎,我们证明了NOX4调节,从而有可能负责H2O2的一代。然而,我们发现增加过氧化氢酶丰富发炎的牙龈和牙周组织中符合数据从Krifka猫和同事发现高水平monomer-exposed巨噬细胞作为氧化应激反应(57]。在我们的在体外设置,PDL成纤维细胞似乎抵消有限合伙人和低氧诱导活性氧的形成主要与海拔猫的表情因为我们不能发现任何SOD免疫反应性。的作用和影响抗氧化系统SOD和CAT争议进行了讨论。最近的研究测量了猫和牙周炎患者的牙龈组织中SOD活动(58,59]。博尔赫斯jr .)等人没有发现猫的差异活动比较健康和患病的病人58]。相反,Tonguc等人发现减少地方在牙周炎患者SOD和CAT活动似乎增加了吸烟(59]。相比之下,在炎症组织中我们观察到大量的SOD本地化主要在上皮细胞。雅各比牙周软组织中超氧化物歧化酶(SOD)和戴维斯。他们发现两倍的SOD活性在牙周韧带在人类皮肤(皮肤)60]。此外,免疫组织化学分析显示,SOD是本地化的外围矩阵组织成纤维细胞的胶原原纤维和glycocalyx。这是Skaleri证实了et al。42这或许可以解释这样的事实,我们没有检测SOD水平的显著差异在PDL缺氧和LPS-PG刺激细胞后成纤维细胞。这些结果的另一个原因可能是由于年龄的PDL细胞用于这项研究。我们从年轻外植PDL细胞和口腔健康的病人但大多数组织的免疫组织化学染色进行老年患者明确诊断牙龈炎或牙周炎。因此很可能在PDL细胞抗氧化酶系统的老年病人不同的表达模式能找到进一步恶化牙周韧带的氧化还原状态。此外,其他作者发现抗氧化剂减少牙周炎患者的体液表明失调将有利于疾病进展(23,24,61年]。各种各样的在体外和动物的影响研究分析抗氧化补充剂中炎症或细胞毒性事件(57,62年,63年]。他们表明,抗氧化剂抑制这些流程指示病态像牙周炎的治疗方法。第一个临床调查证实抗氧化剂微量营养素的效率和牙周疾病的兼职教授22,54,56,64年,65年]。目前的这些研究数据间接支持。
关于牙周病原体侵袭性和毒性,有令人信服的证据p . gingivalis拥有自己的保护性的抗氧化剂,例如,rubrerythrin捍卫他们对主人的氧化破裂66年]。我们已经表明,它的毒性因子通过NOX4 LPS-PG诱导大量的活性氧可能导致骨吸收有利于病原体的侵袭性的同时保护自己的防御机制。这将进一步解释这种细菌菌株的致病性和耐药性牙周炎患者。
5。结论
在这项研究中,我们已经表明,有限合伙人Porphyromonas gingivalis(LPS-PG)以及缺氧诱发NOX4-dependent增加H2O2释放在PDL成纤维细胞可能导致牙周疾病的发展和发展不平衡时伴随的增加抗氧化系统。急剧升高活性氧形成引起的缺氧和LPS-PG和减少过氧化氢酶在相同条件下牙周组织的氧化应激增加有利于炎症的恶化,骨吸收,甚至牙齿脱落。
综上所述,提出数据进一步解释的破坏机理,缺氧和炎症牙周组织的条件和可能改善牙周疾病的诊断和治疗策略。
利益冲突
作者没有利益冲突披露。
确认
作者要感谢蒂娜Schaffrath女士为她的技术支持。本研究由德国研究基金会的资助(208 / TP7临床研究单位)和波恩大学的医学院。