文摘
氧化应激被认为扮演一个关键的角色在肠道损伤的肠道炎性疾病的发展。几个分子参与了肠道炎症,pro -或抗炎因子;然而,其对肠道氧化应激的影响似乎是有争议的。这项工作分析的贡献,和抗炎分子的平衡在肠道上皮细胞氧化损伤,以及它们对细胞抗氧化酶活性的影响。这个目的、脂质和蛋白质氧化与过氧化氢酶的活性、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶,测定Caco-2细胞治疗5 -羟色胺,腺苷,褪黑素、肿瘤坏死因子α促炎因子,il - 10,作为抗炎细胞因子。结果表明,所有的促炎因子化验增加氧化损伤。此外,这些因素也抑制抗氧化酶的活性细胞,除了褪黑激素。相比之下,il - 10没有改变这些参数但能够减少prooxidant效应产生5 -羟色胺、腺苷、褪黑素、肿瘤坏死因子α,部分通过恢复抗氧化酶的活动。总之,促炎的因素可能引起肠道上皮细胞的氧化损伤,而il - 10似乎能够恢复改变Caco-2细胞氧化还原平衡。
1。介绍
肠道炎症是一种适应性反应,引起组织损伤和感染等不利条件下。此外,肠道炎症改变了效率和整个肠道的生理。上皮屏障的完整性是至关重要的防止肠道炎症的发展状况;事实上,众所周知,肠道屏障的结构和功能损害和炎症性肠病(ibd)。具体途径导致慢性肠道炎症细胞损伤并不完全理解;然而,氧化应激是一个潜在的触发因素,炎症性肠病(1]。在这种背景下,一些促炎介质可能产生进一步氧化产品,导致自我维持和autoamplifying恶性循环,最终损害肠道屏障从而加重炎症损伤(2]。这样的过程也被描述在心血管系统(3]。
几个胃肠道(GI)分子调节胃肠道活动(4- - - - - -6)也被指出是参与肠道炎症。因此,这些分子在高浓度可能作为促炎因子。这是对5 -羟色胺(5 -)[7,8],腺苷[9,10)、肿瘤坏死因子α(11),而另一些,如褪黑素,可以行动作为促炎因子在高浓度或抗炎分子根据细胞条件(12]。此外,白细胞介素- 10”(il - 10),一个著名的抗炎细胞因子(13- - - - - -15),也已被证明能够调节肠道生理(16]。
在过去的十年中,肠道炎性疾病的发病率不断上升,而且有越来越有兴趣了解生理GI分子机制,存在于肠道粘膜,可能导致肠道炎症通过影响肠道上皮细胞。因此,现在的工作的目的是分析5 -的影响,腺苷,褪黑素、肿瘤坏死因子α,作为促炎因子,il - 10,作为抗炎细胞因子,在肠道上皮细胞的氧化还原平衡。
2。材料和方法
2.1。试剂
使用以下药物和物质(缩写和供应商在圆括号中):5 -羟色胺(5 -),褪黑素、腺苷、谷胱甘肽还原酶,L-glutathione减少,β烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、叔丁基氢过氧化物,1-methyl-2-phenylindole,乙腈,甲烷磺酸、1,1,3,3-tetramethoxypropane, 2, 4-dinitrophenylhydrazine (DNPH),三氯乙酸,胍,黄嘌呤,黄嘌呤氧化酶(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),肿瘤坏死因子α和il - 10 (Peprotech,落基山,新泽西,美国)。所有通用试剂购自Sigma-Aldrich和罗氏应用科学(桑特Cugat▽水手,巴塞罗那,西班牙)。
2.2。细胞培养和细胞匀浆准备
Caco-2 / TC7细胞已经被使用在目前的研究,因为他们是一个优秀的人类enterocyte-like模型来研究肠道上皮细胞生理学(17,18]。段落之间的细胞总是使用19 - 35和培养在37°C的氛围中5%的股份有限公司2和维护在high-glucose DMEM补充谷氨酰胺和2毫米,100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素,heat-inactivated不必要的氨基酸,1%和20%胎牛血清(的边后卫)(生活技术,卡尔斯巴德,CA)。细胞是通过酶(0.25% EDTA trypsin-1毫米),25厘米的亚文化2塑料培养瓶(Sarstedt、Nuembrecht、德国),和播种密度104细胞/厘米2。媒介改变了48 h后播种和日常。细胞的实验进行了14天播种(融合后9天)后,细胞培养基是FBS-free前24小时使用的细胞。细胞活性通过不同的通道后,已被证明是正常(postconfluence条件18]。实验,细胞被播种在6-well板的密度细胞/。2井/条件(治疗)被用于每个独立的实验中,对应于不同的通过Caco-2 / TC7细胞。不同参数的测量进行了一式三份为每个细胞培养条件。5 -羟色胺100μ100 M,腺苷μ米,褪黑激素5毫米,TNFα5 ng / mL,和/或在两个浓度il - 10(0.01和25 ng / mL)被添加到细胞中氧化参数的测量之前一天。细胞状态下治疗评估通过显微镜和细胞计数,和所有的治疗似乎影响细胞培养形态、细胞增殖、细胞生存能力(数据未显示)。
细胞匀浆制备、细胞resuspended和均质冷Tris-manitol缓冲区(三2毫米,甘露醇50 mM, pH值7.1,蛋白酶抑制剂,叠氮化钠和0.02%)。然后,匀浆中断了声波降解法(15 1 s破裂,60 W)。抗氧化酶的活性测定细胞匀浆。对脂质过氧化反应和蛋白质羰基分析、匀浆是另外离心10分钟3000克,和上层清液被研究。蛋白质含量是衡量后,布拉德福德(美国Bio-Rad大力神,CA)方法。
2.3。测量的过氧化脂质和蛋白质
脂质过氧化的程度是由测量的浓度丙二醛(MDA)和4-hydroxyalkenals (4-HDA),如前所述[19]。短暂,MDA + 4-HDA N-methyl-2-phenylindole和反应产生一个稳定的发色团在586 nm分光光度计测量,使用1,1,3,3-tetramethoxypropane作为标准。结果计算nmol MDA + 4-HDA /毫克蛋白和被表示为控制价值的百分比(100%)。
分析了蛋白质氧化羰基标高测量如前所述[19]。细胞匀浆和古典羰基试剂DNPH孵化,和蛋白质羰基化测量spectrophotometrically 375海里。结果计算nmol羰基化合物/毫克蛋白和百分数表示的控制价值(100%)。
2.4。分析抗氧化酶的活性
抗氧化酶的活动过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)测量通过添加特定的底物和测量基板的消失率,以下协议之前描述(19]。猫活动的减少计算H2O2在nmol /毫克的蛋白质分钟,测量spectrophotometrically 240海里。
与SOD,胞质超氧化物歧化酶CuZnSOD形式进行了分析。SOD活性测定超氧化物自由基的生产,确定黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系统,导致细胞色素C还原。减少为550 nm和SOD活性计算U /毫克港分钟。
GPx分析在我们的研究中是GPx2形式(GPx-GI) cytoplasmatic、胃肠道和肝脏中最大量表达。GPx活性测定细胞匀浆与磷酸钾混合,pH值7.0,包含10毫米谷胱甘肽,谷胱甘肽还原酶0.25个单位,1.5毫米βnadph。NADPH的氧化过程中降低NADPH辅酶ii是表明GPx活动,这是衡量spectrophotometrically在340 nm和NADPH nmol /毫克prot计算分钟。猫的结果表示为百分数,SOD、GPx控制价值活动(100%)。
2.5。统计分析
所有的结果都表示为意味着±标准平均误差(SE)五个独立的实验。进行了统计比较用单向方差分析其次是Bonferroni测试后95%的置信区间。正态分布与D 'Agostino-Pearson以前确认测试。统计分析进行了使用计算机辅助棱镜GraphPad程序(Prism 4.0版本,GraphPad软件,圣地亚哥,CA)。
3所示。结果
3.1。5、腺苷、褪黑素、肿瘤坏死因子α,il - 10在Caco-2细胞脂质和蛋白质氧化
结果表明,Caco-2细胞接受5,腺苷,褪黑素、肿瘤坏死因子α显著增加脂质过氧化(图1(一))和蛋白质羰基(图1 (b))的水平。相反,il - 10似乎没有修改细胞氧化状态。然而,il - 10,两个浓度化验,可以减少由5 -脂质和蛋白质氧化诱导,褪黑激素和肿瘤坏死因子α。在脂质和蛋白质氧化损伤产生由il - 10在高浓度腺苷只是恢复(25 ng / mL)(图1)。
(一)
(b)
3.2。分析抗氧化酶的活性的猫,SOD、GPx Caco-2细胞接受5,腺苷,褪黑素、肿瘤坏死因子α和il - 10
结果表明,5、腺苷和肿瘤坏死因子α显著降低猫活动,似乎并没有影响褪黑素或il - 10两个浓度化验。在联合治疗,il - 10在低浓度(0.01 ng / mL)似乎扭转猫抑制TNF产生α,相反,它显示增加抑制猫活动由5 -腺苷,或者褪黑激素。然而,il - 10在高浓度(25 ng / mL)能够扭转猫引起的抑制5 -和腺苷,显著增加猫活动存在褪黑激素(图2(一个))。
(一)
(b)
(c)
在与SOD, 5 -显示减少活动,不仅扭转了这种影响,il - 10在高浓度甚至超过了它(图2 (b))。腺苷、褪黑素、肿瘤坏死因子α,il - 10在两个浓度化验似乎并没有影响SOD活性。令人惊讶的是,il - 10在高浓度+褪黑激素治疗取得了显著增加SOD活性(图2 (b))。
GPx的分析显示,只有腺苷显著降低GPx活性,这种效应也逆转了il - 10在高浓度(图2 (c))。奇怪的是,褪黑激素治疗,这本身并不影响GPx活性,与il - 10在高浓度显示增加抗氧化剂GPx活性高于控制(图2 (c))。
4所示。讨论和结论
这项工作的结果表明,肠道炎症治疗analyzed-5-HT、腺苷、TNFα,褪黑激素在高concentrations-induced氧化影响肠道上皮细胞的脂质和蛋白质。这种氧化损伤似乎并没有显著影响细胞的生存;然而,它可以添加到prooxidant定居在肠道细胞在炎症条件下的地位。这些分子的prooxidant效应也被指出在不同组织(11,20.,21]。相比之下,抗炎细胞因子il - 10,这似乎并没有影响脂类和蛋白质氧化在任何浓度化验,展示了逆转脂质和蛋白质的氧化损伤诱导的促炎的分子检测,除了il - 10浓度很低,没有显著降低脂质过氧化作用和蛋白质羰基含量产生腺苷。这些结果表明,il - 10可能明显影响组织受到炎症条件下,作为一个先前的研究表明(22]。
抗氧化酶活性的主要方法是恢复细胞内氧化还原平衡,和肠道炎症的特征显著但不同的各种酶的改变参与氧化/抗氧化肠道上皮细胞内稳态。肠道炎性疾病、SOD (23,24和猫的活动25,26]已经观察到被改变肠道粘膜的炎症性肠病;然而,GPx活性的结果已被证明是更有争议的27,28]。在这种背景下,猫,SOD、GPx活性测定,以分析他们是否参与氧化效果产生了促炎的分子和细胞氧化平衡恢复由il - 10。
促炎因子测试可以显著降低某些抗氧化酶的活性,尽管这种效应似乎并未只负责观察prooxidant行动脂质和蛋白质。因此,我们的研究结果表明,5 -在Caco-2细胞的氧化效果可能部分由于猫和SOD活性的抑制。同意这些结果,一项研究心肌细胞动作电位使表明5 - H水平增加2O2(29日]。的腺苷,它已经被证明可以减少猫和GPx活性,这可能导致其影响脂质和蛋白质的氧化损伤。腺苷对抗氧化酶的影响还没有深入分析;尽管如此,腺苷脱氨酶的活性及其与猫的负相关,SOD、GPx活动已经证明在血浆和血细胞(30.]。与肿瘤坏死因子α,其prooxidant效果可能部分介导的抑制猫的活动,因为它最近被描述在成骨细胞(31日]。最后,相比之下,褪黑激素似乎没有影响酶活性测定,因此,这些抗氧化剂酶似乎不参与强氧化应激产生褪黑激素的蛋白质和脂类。褪黑素是一种抗氧化剂的分子,但它也可以作为prooxidant因素。事实上,褪黑素已被证明产生活性氧(12]。此外,与我们的结果和协议,先前已经表明褪黑激素可能引起一种间接prooxidant效应,导致急性炎症(32]。
细胞因子与il - 10,这本身似乎没有改变抗氧化酶活动在任何两个浓度化验分析,这或许可以解释缺乏对Caco-2细胞脂质和蛋白质氧化的影响。相比之下,与促炎介质在co-treatment il - 10在高浓度显示扭转他们的抑制作用不同抗氧化酶的活动。因此,il - 10在高浓度逆转猫和SOD抑制诱导5,和猫GPx腺苷抑制了。相比之下,il - 10在低浓度似乎并没有扭转对SOD、GPx活性抑制任何影响,但令人惊讶的是它似乎恢复猫活动抑制TNFα治疗。同意这些结果,最近的研究表明il - 10的能力减少H2O2生产诱发干扰素-γ和肿瘤坏死因子α激活巨噬细胞(33]。令人惊讶的是,il - 10在低浓度似乎加重猫活动引起的抑制5、腺苷和褪黑激素。
从我们的研究结果,可以推断,il - 10的影响取决于其浓度,因为它描述的最近Caco-2细胞(16),在心血管事件(34]。il - 10对氧化损伤的保护作用引起prooxidant分子中也得到了证实心肌细胞(35]。最近导致内皮表明,il - 10在促炎的条件下的抗氧化作用可能是由于激活PI3k信号(36]。最近因为这个细胞内途径也被描述的Caco-2细胞(16)所引发的il - 10,它可能推断,PI3k途径也可能调解il - 10在肠道上皮细胞抗氧化效果。
有趣的是,猫、SOD、GPx活动,而未接受治疗与il - 10在高浓度时,褪黑素或被cotreatment显著增强的细胞与分子,从而表明这两个因素的协同抗氧化作用。我们的结果与先前的研究一致,得出的结论是,褪黑素在炎症过程可能产生有益的影响通过刺激il - 10生产(了37,38])。
总之,我们的研究表明胃肠道分子参与肠道炎症也可能作为prooxidant因素肠道上皮细胞。这种效应可能是由于部分抑制抗氧化酶的活性。这种prooxidant效应可能导致炎症的恶化,破坏肠道上皮细胞。此外,il - 10,主要在高浓度时,可能扭转prooxidative引起的促炎因子的影响,因此这表明il - 10可能导致炎症的改善不仅通过抗炎,还通过抗氧化效果。这il - 10在肠道上皮细胞的抗氧化作用加强了细胞因子的作用作为一个成功的疗法治疗肠道炎症,炎症性肠病。
当前研究的结果可能有助于澄清过程在肠道炎症和可能导致的设计具体的疗法治疗肠道炎性疾病通过作用于氧化还原平衡。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
这项工作是由赠款从西班牙科技部创新和欧洲区域发展基金(ERDF /菲德尔)(bfu2010 - 18971),欧洲社会基金(养)和阿拉贡地区政府(B61)和炎性肠道疾病的基础研究在阿拉贡(ARAINF 012/2008)。大肠Latorre和大肠Layunta博士生研究员从阿拉贡地区政府(B105/11 B022/13, resp)。作者要感谢Brot-Laroche博士(INSERM UMR年代872年,中心生物de Cordeliers巴黎)提供Caco-2 / TC7细胞。