文摘

二甲双胍是广泛用于抑制某些功能的细胞中发现的疾病,包括糖尿病和肥胖。在这项研究中,二甲双胍的影响表达下调IL-17-producing T Th17细胞,激活和移植调节性T (Treg)细胞,抑制osteoclastogenesis,临床评分胶原诱导的关节炎(CIA)进行调查。评价二甲双胍在中情局的影响,小鼠口服美联储与二甲双胍或生理盐水作为九周控制每周3次。组织学分析关节进行了使用免疫组织化学和Th17细胞和脾脏Treg细胞组织被共焦显微镜染色检查。二甲双胍减轻中央情报局的严重程度,血清免疫球蛋白浓度降低,相反地监管Th17 / Treg轴。正常细胞培养的同时,二甲双胍治疗Th17条件Th17细胞的数量减少和增加Treg细胞的数量。二甲双胍降低基因表达和中情局osteoclastogenic活动和正常小鼠。这些结果表明,二甲双胍对中情局通过免疫调节行为影响抗炎作用抑制Th17细胞分化和upregulation Treg细胞分化的抑制破骨细胞分化。我们的研究结果表明,二甲双胍可能是一个潜在的治疗类风湿性关节炎。

1。介绍

类风湿性关节炎(RA)是一种病因不明的多系统自身免疫性疾病。影响关节的病理学特征是增生性滑膜的炎症会导致破坏附近的软骨和骨1]。尽管RA的确切分子发病机制仍然阐明,证据表明,白介素(IL) 17-producing T细胞,Th17,是中央的球员。IL-17已知协同作用与肿瘤坏死因子(TNF)和il - 1丰富的促炎细胞因子在关节炎的关节提高成纤维细胞的活化,软骨细胞和破骨细胞2]。相比之下,调节性T细胞(Treg)已被证明具有抗炎作用,其监管功能被认为是疯狂的在RA患者。Th17和Treg已报告有可塑性,可以根据细胞因子互相转换的环境当细胞遇到[3]。因此,一种治疗方法,可以同时增加Treg细胞,同时减少Th17细胞可能在RA治疗非常有前途。

二甲双胍最初引入作为一种抗糖尿病的药物。早些时候的研究表明,大多数药物二甲双胍的影响取决于它能够激活活化蛋白激酶(AMPK),脂质和糖代谢的主要细胞监管机构(4]。二甲双胍抑制线粒体呼吸链导致能源不足指出AMP的增加,激活AMPK和蛋白激酶A (PKA)。

激活AMPK和PKA抑制脂质合成和糖质新生,分别为(5]。AMPK活化也促进葡萄糖吸收和肌肉脂肪酸氧化,提高葡萄糖的降低效果(6]。除了血糖降低的效果,二甲双胍报道发挥抗炎作用,也是由metformin-activated AMPK。Metformin-activated AMPK抑制哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR),调节T细胞的效应差异在体外和在活的有机体内。AMPK已被证明是与Th17细胞抑制通过抑制mTOR和信号传感器和转录激活3 (STAT3),建议的治疗潜力AMPK受体激动剂(7]。

而Th17细胞负责保持慢性炎症在RA,破骨细胞骨再吸收导致随后的联合破坏[8]。osteoclastogenesis mTOR的角色已经被报道在mTOR通路的下游分子(S6K)表达细胞生存信号在破骨细胞(9]。最近,印度尼西亚等人报道,AMPK-mediated抑制mTOR和低氧诱导因子(HIF) 1消极监管osteoclastogenesis [10]。

这些监管AMPK对Th17细胞和破骨细胞的影响促使AMPK受体激动剂的影响的调查,二甲双胍,自身免疫性关节炎。在目前的研究中,二甲双胍的抑制胶原诱导的关节炎(CIA)小鼠模型演示了通过关注Th17细胞分化的抑制和增强Treg分化。的磷酸化STAT3被二甲双胍降低而磷酸化STAT5增加,这似乎对Th17 / Treg人口的改变做出贡献。此外,通过抑制mTOR osteoclastogenesis被抑制,AMPK活化二甲双胍。

2。材料和方法

2.1。老鼠

12个月大的雄性C57BL / 6小鼠(东方生物、韩国)保持在特定的无菌条件下,标准实验室老鼠食物(Ralston Purina、圣路易斯、钼)和水随意。所有实验程序是由动物研究伦理委员会审查批准的天主教大学的韩国,这符合所有的美国国立卫生研究院的指导方针。所有手术在异氟烷麻醉的情况下进行,所有的努力都是尽量减少痛苦。

2.2。诱导的关节炎和二甲双胍治疗

中央情报局C57BL / 6小鼠诱导()。小鼠免疫的基础与100尾μ克鸡CII (Chondrex Inc .,雷蒙德,佤邦,美国)完全弗氏佐剂(Chondrex Inc .)。100年μ工业联合会克鸡不完全弗氏佐剂(Chondrex Inc .)注射的尾巴和一只脚在14天。CIA小鼠口服美联储每周3次9周5毫克/鼠标二甲双胍(Sigma-Aldrich)或生理盐水作为控制开始第一次免疫后7天(许可证号码:cumc - 2013 - 0128 - 01)。在这些小鼠关节炎是检查外观的视觉每周两次周围关节的关节炎。

2.3。关节炎的临床评分

关节炎记录使用的意思是关节炎的严重程度指数在0 - 4的规模,如前所报道(11),如下所示:(0),没有证据表明红斑和水肿;(1)、红斑和轻度肿胀局限于足(跗骨)或踝关节;(2)、红斑和轻度肿胀扩展从脚踝到足;(3)、红斑和适度扩展从脚踝到跖骨的关节肿胀;(4)、红斑和严重肿胀的脚踝,脚,和数字。关节炎的严重程度分析了分数的总和所有腿,评估由两个独立观察员没有实验的知识群体。

2.4。Immunohistopathological关节炎的分析

每个鼠标在10%福尔马林固定的关节,在10% EDTA脱钙,嵌在石蜡中。部分是沾hematoxylin-eosin()),红色染料O,甲苯胺蓝检测蛋白聚糖。免疫组织化学的部分进行使用Vectastain ABC工具包(美国向量实验室,伯林盖姆,CA) (12]。炎症是根据标准之前报道得分。(13]。组织是彩色anti-receptor活化剂的NF -B(排名),anti-receptor活化剂的NF -B配体(RANKL) anti-TNF -,anti-TNF receptor-associated因子6 (TRAF6) anti-IL-17,和anti-IL-6(所有从圣克鲁斯生物技术有限公司)和anti-phosphorylated (p) STAT3 (Y705) anti-pSTAT3 (S727)和anti-pAMPK anti-pmTOR(所有从细胞信号,丹弗斯,MA)。

2.5。共焦显微镜的疣状

脾组织了第一次免疫后35天。组织染色使用PE-conjugated anti-CD4, FITC-conjugated anti-forkhead盒P3(具体),APC-conjugated anti-CD25, FITC-conjugated anti-IL-17, FITC-conjugated anti-pSTAT3 (Y705)和FITC-conjugated anti-pSTAT3 (S727)(美国圣地亚哥从eBiosciences CA)。分析了彩色部分使用蔡司显微镜(LSM 510元;卡尔蔡司、从、德国)。

2.6。免疫球蛋白(Ig)浓度的测量

Anti-IgG、IgG1 IgG2a测定小鼠免疫球蛋白,IgG1, IgG2a ELISA定量工具(Bethyl实验室、蒙哥马利、TX) [12]。

2.7。流式细胞仪细胞内细胞因子

分析细胞内细胞因子,脾细胞沾PerCP-conjugated anti-CD4, APC-conjugated anti-CD25, FITC-conjugated anti-IL-17,和PE-conjugated anti-Foxp3 (eBiosciences),其次是固定和透化作用Foxp3染色缓冲设备(BD生物科学)根据制造商的指示。四个小时在染色之前,这些细胞被刺激十四烷酸与佛波醇酯(25 ng / mL)和ionomycin (250 ng / mL)(从Sigma-Aldrich)和GolgiStop (BD生物科学)。所有的数据进行了分析使用FlowJo软件(美国或树明星,亚什兰)。

2.8。实时定量聚合酶链反应(PCR)

信使rna表达水平估计使用LightCycler 2.0仪器(罗氏诊断,曼海姆,德国)4.0版本的软件。所有与LightCycler反应进行DNA主人SYBR绿色我由于“快速上手”项目(豆类、志贺、日本),遵循制造商的指示。规范化的mRNA的表达肌动蛋白。引物序列见表1。

2.9。在体外分化成Th17细胞

净化脾脏CD4 + T细胞、脾细胞与CD4-coated孵化磁珠和孤立使用磁激活细胞分选(mac)分离列(Miltenyi研究)。孤立的CD4 + T细胞刺激了Th17 cell-polarizing条件3天:plate-bound anti-CD3 (0.5μanti-CD28 (1 g / mL)μg / mL)(美国BD PharMingen, CA);anti-interferon(干扰素)(2μanti-IL-4 (2 g / mL)μg / mL),将生长因子(TGF)(2 ng / mL)和il - 6 (20 ng / mL)(从研发系统,明尼阿波利斯,美国)。

2.10。在体外Osteoclastogenesis

破骨细胞被刺激的巨噬细胞集落刺激因子(csf) (10 ng / mL)(研发系统)和核因子kappa-B配体受体激活剂(RANKL) (50 ng / mL) (PeproTech、伦敦、英国)和二甲双胍的缺失或存在1毫米。每两天中被改变。破骨细胞生成(8 - 10天之后14]。

2.11。免疫印迹分析

蛋白质是由sds - page分离和转移硝化纤维素膜(Amersham法玛西亚生物技术,皮斯卡塔韦,新泽西,美国)。蛋白质免疫印迹是由临时身份证检测系统(微孔)。增强化学发光杂化带进行检测(ECL)检测设备(热科学的热费希尔科学的品牌,Inc .)。抗体是如下:anti-AMPK,反pAMPK, anti-mTOR反pmTOR,反pSTAT3 Y705,反pSTAT3 S727, anti-STAT3(所有从细胞信号);TRAF6 (Santa Cruz);和肌动蛋白(σ)。

2.12。统计分析

所有数据都表示为均值±SD。使用SPSS 10.0统计分析了Windows (、IBM公司,纽约Armonk)。组间比较数值数据进行双向方差分析和非参数Mann-Whitney测试。不同群体的平均值的差异进行了分析通过使用方差分析与事后测试。P值< 0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。二甲双胍改善胶原诱导关节炎

探讨二甲双胍的抗关节炎的效果,与CIA小鼠口服美联储与二甲双胍或盐水每周三次在第一次免疫后第七天。Metformin-treated CIA小鼠表现出显著降低严重程度(图1(一),临床关节炎(图左)和发病率1(一),对吧)。组织学和软骨分数衡量基于炎性细胞浸润和软骨的损伤也显著降低metformin-treated老鼠(图1 (b))。IL-17、il - 6和TNF阳性细胞减少metformin-treated CIA小鼠(图1 (c))。总免疫球蛋白、IgG1 IgG2a抗体明显减少metformin-treated CIA小鼠相比saline-treated控制(图1 (d))。总的来说,这些结果表明,二甲双胍减毒中情局。

3.2。分析Th17, Treg CIA小鼠细胞群

我们调查的影响对Th17二甲双胍,Treg人口CIA小鼠。首先,我们分析了对Th17并使用组织共焦Treg细胞染色。CD4 + IL-17 + T细胞的数量和CD4 +pSTAT3 + (S727和Y705) T细胞减少metformin-treated CIA小鼠比控制。相比之下,CD4 + CD25 + Foxp3 + Treg细胞和CD4 +pSTAT5 + T细胞被更高的metformin-treated组(图2)。接下来,从每组分离脾细胞进行了分析使用流式细胞仪IL-17和Foxp3的表达。结果表明,CD4 + IL-17 + metformin-treated中情局Th17细胞降低,而CD4 + CD25 + Foxp3 + Treg细胞增加二甲双胍组(图3(一个))。,Th17-related mRNA表达的细胞因子和转录因子显著降低metformin-treated CIA小鼠的脾细胞和有更大的Foxp3的表达(图3 (b))。的pAMPK在metformin-treated情报局(图表达增加3 (c))。

3.3。二甲双胍调节Th17 Treg细胞分化在体外

Th17细胞的比例在减少metformin-treated CIA小鼠在活的有机体内,二甲双胍对Th17细胞和Treg细胞分化的影响在体外是检查。CD4 + T细胞与健康的C57BL / 6小鼠培养Th17 cell-polarizing二甲双胍存在与否的条件。Th17细胞的分化与二甲双胍抑制,同时增加Treg分化(图3 (d))。此外,二甲双胍抑制Th17-associated基因的表达水平,IL-17, Ahr, RUNX1、RORT, Foxp3的mRNA水平增加(图3 (e))。用二甲双胍治疗的表达增加pAMPK白介素10 ng / mL刺激CD4 T细胞(图3 (f)))。这些结果表明,二甲双胍抑制Th17细胞分化而提高Treg分化和促炎的AMPK激活条件(图6)。

3.4。二甲双胍在Osteoclastogenesis的效果在活的有机体内

Metformin-treated CIA小鼠显示减少骨质流失和关节炎的关节软骨的破坏(图1 (b))。这些结果促使我们进一步调查直接影响osteoclastogenesis二甲双胍。确定二甲双胍对osteoclastogenesis的影响,我们在免疫化学染色级别和RANKL的联合组织。正如预期的那样,级别和RANKL的表达减少发炎的关节组织的metformin-treated情报局(图4(一))。preosteoclasts来源于控制CIA小鼠和metformin-treated CIA小鼠刺激- csf和RANKL。结果表明,破骨细胞从metformin-treated CIA小鼠低分化为破骨细胞(图的能力4 (b))。各种osteoclastogenic标记的表达水平,如陷阱,MMP-9,整合素3、降钙素受体和组织蛋白酶K,也减少了。减少监测活动之后metformin-treated老鼠(图4 (c))。

3.5。二甲双胍抑制破骨细胞分化抑制STAT3, AMPK途径

验证的观察二甲双胍降低osteoclastogenic标记物的表达体外,我们研究了二甲双胍是否能抑制破骨细胞分化在体外。结果表明,二甲双胍治疗抑制破骨细胞分化由陷阱染色试验(图5(一个))。我们还测量了osteoclastogenic标记控制破骨细胞和metformin-treated mRNA表达水平的。的mRNA表达osteoclast-related标记,陷阱,组织蛋白酶K, MMP-9,降钙素受体,碳酸二世和整合素3β,减少了meformin治疗。我们还发现二甲双胍抑制HIF-1的表达信使rna而诱导AMPK mRNA的表达(图5 (b))。二甲双胍的药理效应在很大程度上是依赖AMPK,激活AMPK, mTOR, STAT3在osteoclastogenesis被解决。免疫印迹分析表明TRAF6的表达,pmTOR,pSTAT3 (Y705和S727)减少与二甲双胍治疗。同时,pAMPK活化增加(图5 (c))。关节炎关节的一致,免疫组织化学染色显示这些分子的表达显著低于metformin-treated CIA小鼠(图5)。总的来说,这些结果表明,二甲双胍抑制osteoclastogenesis通过抑制mTOR和STAT3 metformin-activated AMPK介导的。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们表明,二甲双胍抑制CIA通过互惠的监管Th17细胞和Treg细胞。Metformin-activated AMPK似乎参与本条例通过抑制mTOR及其下游分子,HIF-1和STAT3。

Th17接收焦点在RA的发病机制,许多药物目标Th17已经开发出来。il - 6是至关重要的细胞因子通过JAK-STAT Th17细胞分化信号通路(15]。然而,一个叫白介素受体阻断抗体,目前正在使用,而tofacitinib,木菠萝抑制剂,正在临床试验中。所示的分子抑制STAT3和RORT在动物模型证明了有前景的结果。

最近,新陈代谢已作为一个重要的检查站在调节Th17 / Treg平衡[16]。因此,AMPK的作用,主代谢传感器,在T细胞的命运了。康等人报道,metformin-activated AMPK抑制mTOR-STAT3途径导致的人口减少Th17细胞(17]。此外,我们的研究结果显示,二甲双胍不仅抑制Th17细胞也同时增强Treg细胞。这可能是解释为代谢检查确定Th17细胞或Treg细胞的分化。Th17细胞和Treg细胞使用不同的能源。例如,Th17细胞高度糖酵解而Treg细胞脂质氧化率很高(18]。高糖酵解活性Th17细胞是依赖mTOR, AMPK抑制的。mTOR增强糖酵解途径促进Th17细胞分化而AMPK抑制mTOR和促进线粒体氧化代谢增强Treg细胞。此外,Th17细胞的高糖酵解活性归因于HIF-1αmTOR通路的下游分子(19]。Th17细胞分化是HIF-1受损α有缺陷的老鼠。此外,HIF-1促进ROR的核易位T和降解Foxp3,导致减少Treg细胞(20.]。因此,AMPK调节Th17和Treg之间的平衡。AMPK也已被证明能够负调节STAT3的激活(21]。众所周知pSTAT3争夺相同的结合位点pSTAT5 IL-17子加强IL-17 [22]。因此,激活AMPK和抑制mTOR是一种有效的方式来调节Th17 Treg并发。我们的研究结果显示,二甲双胍抑制Th17细胞同时增加Treg CIA小鼠细胞。虽然共焦显微镜显示STAT5磷酸化的增加,似乎由于减少了pSTAT3因此增加Treg的数量,而不是直接二甲双胍对STAT5磷酸化的影响。不可否认的是,二甲双胍并不影响- 2诱导STAT5磷酸化水平在体外(数据没有显示)。

据报道,二甲双胍改善实验性自身免疫性脑炎(23)和胶原蛋白抗体诱导关节炎(17),涉及Th17细胞。我们的研究结果证实,metformin-activated AMPK通过互惠的监管会抑制CIA Th17细胞和Treg细胞。因此,未来的调查是否可以使用二甲双胍作为Th17-driven治疗慢性炎症性疾病是光明的。

二甲双胍也抑制osteoclastogenesis在活的有机体内和在体外。陷阱+多核细胞的数量较低的关节metformin-treated老鼠。这可能部分源于降低炎性细胞因子的表达,促进osteoclastogenesis通过upregulation RANKL的关节炎的关节。二甲双胍,减少刺激osteoprotegerin RANKL表达成骨细胞(24[],AMPK抑制等级信号25),这也可能有助于减少osteoclastogenesis。探讨直接影响osteoclastogenesis, preosteoclasts培养与csf和RANKL在二甲双胍的存在与否,减少osteoclastogenesis metformin-treated细胞。我们的结果也表明了,压制与增加AMPK磷酸化和随后的减少mTOR和STAT3磷酸化。HIF-1的表达下降在metformin-treated破骨细胞验证mTOR-HIF-1最近的观察通路在osteoclastogenesis至关重要10]。

到目前为止,没有预防类风湿性关节炎的发展。然而,适当的早期治疗可以防止渐进损伤关节。在这项研究中,二甲双胍在关节破坏的影响和调节免疫细胞在类风湿性关节炎的发生是评估。此外,类风湿性关节炎的预防应该进一步研究二甲双胍。

总的来说,这些结果表明二甲双胍的新角色。二甲双胍可以改善自身免疫性关节炎通过调节Th17 / Treg平衡和抑制通过AMPK osteoclastogenesis。在这种情况下,辅助糖尿病发展由于过度使用皮质类固醇在RA患者中,二甲双胍可以最佳的治疗选择由于血糖降低和消炎作用。

5。结论

目前的研究表明,二甲双胍抗炎效应在中情局的抑制Th17细胞分化和upregulation Treg细胞分化的抑制破骨细胞分化。我们的数据表明,二甲双胍治疗可能是一个潜在的候选人调制与类风湿性关节炎的实验动物模型。

利益冲突

作者没有任何利益冲突声明关于本文所提到的材料或服务。

确认

本研究支持格兰特朝鲜卫生技术研发项目,部健康与福利,大韩民国(HI09C1555)和韩国政府(最高明的)(没有。2012 m3a9c6049783)。