文摘
大疱的类天疱疮(BP)和疱疹样皮炎(DH)皮肤病与炎症有关。然而,很少有研究关于肥大细胞的作用存在于自身免疫性疾病起泡。皮肤活检来自27个基点和14个DH的病人,以及20个健康的人。免疫组织化学是用来识别本地化和肥大细胞肿瘤坏死因子的表达α和MMP9在皮肤损伤和perilesional皮肤。血清肿瘤坏死因子的浓度αMMP9 chymase,类胰蛋白酶、拥堵和il - 4测量免疫测定。肿瘤坏死因子α和MMP9表达在表皮和真皮炎症涌入细胞中检测出的皮肤活检的病人。虽然这些介质被发现被表达在perilesional所有病人的皮肤,水平远远低于lesional皮肤。增加拥堵的血清水平BP患者的观察。肥大细胞在激活炎症可能起着关键作用,最终导致了英国石油公司和DH中观察到的组织损伤。我们的研究表明,细胞因子的表达方式的差异直接导致细胞渗透DH和BP的变化。
1。介绍
疱疹样皮炎(DH)是皮下自身免疫性大疱的疾病之一,它的特点是皮肤和肠道病变。皮肤损伤包括多态爆发伴随着严重的瘙痒。肠道病变的特点是小肠绒毛萎缩造成免疫过程(1]。诊断的基础上,建立了DH的直接免疫荧光试验(DIF)揭示颗粒沉积IgA的乳头状突起和循环IgA抗体针对肌内膜和/或组织和表皮转谷氨酰胺酶(tTG (eTG) [2,3]。皮肤损伤在DH组织学上表现为中性粒细胞浸润导致破坏基底膜带(BMZ)蛋白质和锚定纤维和水疱形成(4- - - - - -6]。
大疱的类天疱疮(BP)是一种猛烈的疾病表现为炎性浸润在真皮和免疫球蛋白和C3存款沿着BMZ和循环免疫球蛋白自身抗体。自身抗体与自身抗原,糖蛋白BPAG1 (230 kD)和BPAG2 (180 kD),局部表皮的基底膜激活一系列的免疫和酶现象导致的破坏基底膜组件和水泡的形成,观察到在DH [7,8]。
真皮,炎性浸润由嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和绑定在活的有机体内存款,可以观察到沿基底膜或乳头状突起的顶端。超微结构的研究也证实了密集的存在炎症浸润dermoepidermal结,以及半桥粒和组件的破坏的细胞外基质9]。
渗透形成之前是白细胞的早期积累,这取决于粘附分子的活动。结合自身抗体导致角质细胞的激活,释放细胞因子,以及金属蛋白酶的激活和C5组件的补充10,11]。许多介质是中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的重要化学引诱物(12,13]。
肥大细胞是许多介质的来源,细胞因子和酶,这可能会影响皮肤炎症的过程中以不同的方式。一个中介的发展起着非常重要的作用在自身免疫性皮肤病皮肤损伤是肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子α)。其他细胞因子由肥大细胞似乎也参与皮肤的炎症过程。BP和DH,过程中一个重要的角色是由柱状细胞介质如组胺、类胰蛋白酶和chymase。证据表明,金属蛋白酶(特别是MMP9),白细胞三烯(LT)、血小板激活因子(PAF)参谋长,来自肥大细胞和肝素发挥作用在气泡形成的炎症过程14]。近期数据对细胞因子的作用和介质中肥大细胞泡形成的规划应该考虑治疗这些疾病的新方法。这项研究的目的是评估这些标记物的表达的肥大细胞在皮肤损伤和perilesional区域,以及患者的血清DH和英国石油公司。
2。材料和方法
2.1。病人
研究包括61人:27未经治疗的患者BP(范围:58 - 84年,平均:68.5)和14个DH(范围:18 - 70岁,平均:49.8)在一个活跃的阶段。对照组由20名健康个体。的平均年龄对照组1号(10例),对于BP患者,为71.6岁(范围50 - 80年),而对照组的平均年龄2号(10例),DH患者,42岁(范围19岁到49岁)。对照组由志愿者匹配对性别与年龄无关。
在所有DH情况下,组织学检查发现血管周的中性粒细胞浸润,存在Pierrard脓肿,皮下的小疱。在大多数样品,大单室的水泡显示多个中性发现乳头状微脓肿。组织病理学结果根据阿克曼都充分发展(15]。直接免疫荧光测试结果显示颗粒的存在的IgA沉淀皮肤乳头状突起和间接免疫荧光法检测都是阳性IgAEmA(食管猴子IgAEmA Medizinische Labordiagnostica)。免疫测定(Pharmacia & Upjohn Celikey)显示在8/14的情况下anti-tissue转谷氨酰胺酶抗体的存在。DH的诊断建立基于临床表现和组织学和免疫检查的结果。
27例(16名女性,11人;平均年龄68.5岁;范围:58 - 84)与英国石油(BP)都包括在这项研究。类天疱疮的诊断是基于临床和组织学和免疫学研究。疾病的患者在一个活跃的阶段;22的27患者伴有皮肤水泡,泡,和瘙痒丘疹,而剩下的只有小泡和荨麻疹的丘疹。在所有情况下,组织病理学研究结果充分发展根据Ackerman et al。15]。在所有患者中,直接免疫荧光分析显示免疫球蛋白/ C3沿着BMZ线性存款。在盐分割测试,存款中观察到表皮水泡的一部分。间接免疫荧光法检测显示循环免疫球蛋白抗体出现在所有的病人。根据ELISA, anti-Nc16自身抗体(MBL,名古屋,日本)出现在21的27名患者的血清。支持的临床诊断是典型的英国石油(BP)的组织学特征,包括中性粒细胞浸润,嗜酸性粒细胞、淋巴细胞(以及皮下水泡在22例)。
所有的患者进入研究之前给他们通知书面同意。研究方案(RNN / 132/07 / KB)是当地伦理委员会批准罗兹的医科大学。
组织标本。活检被从臀部的皮肤或树干前政府的任何(局部或系统性)治疗。皮肤损伤持续2周和4个月之间。活检标本取自臀部的皮肤健康的志愿者。
2.2。免疫组织化学
石蜡包埋部分,3 - 4μ米厚,被用于常规)染色和immunoperoxidase免疫组织化学检查DAKO设想检测系统。以下主要使用单克隆抗体:anti-TNFα英国(R&D)和基质金属蛋白酶9 (MMP9) (Novocastra)。
免疫组织化学,石蜡包埋部分被放置在胶板和干56°C 24小时和后来deparaffinated在一系列的二甲苯和醇降低浓度。内源性过氧化物酶的活性抑制了3%过氧化氢溶液中甲醇5分钟。
为了检索组织的抗原性和允许他们与抗体反应,具体程序被用于每个测试抗体,根据制造商的指示。孵化后稀释抗体在室温下为60分钟,他们与三羟甲基氨基甲烷缓冲液洗两次。DAKO设想可视化系统被应用以可视化的双抗原抗体反应。积极的免疫组织化学反应,细胞细胞核是沾Meyer苏木精为2分钟。脱水和处理后通过一系列的丙酮、二甲苯的部分是固定在加拿大的软膏。
2.3。半定量的分析
在每一个标本,MMP9的染色强度和肿瘤坏死因子α在炎性浸润是由两个独立的观察员记录在7 - 10相邻大功率领域。他们等级从0(不染色检测),1(最小的疣状细胞),2(在所有细胞免疫染色强度薄弱),和3(在所有细胞染色强)。平均品位计算平均成绩由两位作者和近似算术平均分配到最近的统一。
2.4。形态测量学
MMP9的组织学形态测量学和肿瘤坏死因子αimmunoexpression由上皮细胞和炎症细胞是由使用一个图像分析系统。硬件由PC机与Indeo快卡(抓帧器,真正的颜色,真正的时间)(Indeo、台湾)和彩色摄像机(松下、日本)与Jenaval显微镜(德国卡尔蔡司)。使用的软件是8.08断层(电脑扫描系统、波兰)。以下值计算:对象的数量(半自动功能)和结构的表面积stereological网格的基础上,规定数量的点。
immunopositive炎症细胞的比例估计通过计算100 - 120 7 - 10相邻大功率领域的炎症细胞在每个幻灯片使用半自动功能。上皮细胞的染色测定使用点估算的方法,基于韦贝尔[16]。16点间距μm。网格中的点的总数是169,总面积36864平方。μm。使用这个网格,7 - 10随机选择相邻的上皮细胞的字段。阳性染色的百分比计算点覆盖的人数的百分比积极地区关于点的总数统计。
2.5。统计方法
中等水平的患者肿瘤坏死因子和MMP9在病变(左)和英国石油(BP)和DH周围使用非参数Mann-Whitney (S)进行了比较U测试。被认为具有统计显著性结果。
2.6。血清趋化因子水平
为了确定检查血清中蛋白的浓度,酶联免疫测定法:chymase:酶联免疫试剂盒对人类chymase 1肥大细胞(Uscn生命科学),类胰蛋白酶:人类类胰蛋白酶酶联免疫试剂盒(Uscn生命科学)、肿瘤坏死因子α:人类肿瘤坏死因子α酶联免疫试剂盒(Gen-Probe Diaclone), il - 4:人类il - 4酶联免疫试剂盒(Gen-Probe Diaclone),拥堵:酶联免疫试剂盒对人类血小板激活因子(PAF)参谋长(Uscn生命科学)和MMP9 (Quantikine、研发系统)。
类胰蛋白酶,Chymase TNFα拥堵,MMP9,血清中il - 4水平测定所有患者和健康对照组进行皮肤活检。5毫升静脉血样本来自尺脉,离心后,血清是储存在−20°C免疫测定。
2.7。统计方法
所有数据,提出了中值和范围。非参数克鲁斯卡尔-沃利斯分析了中值测试。意义在作为具有统计学意义。统计分析进行了使用Statistica 10软件(Statsoft波兰)。
3所示。结果
3.1。血清趋化因子水平
拥堵的水平在统计学上高于BP患者比健康受试者(218.19 + /−29.874)29.87 + /−2.973 ()。DH之间没有差异被发现患者和对照组(),图1。
MMP9水平明显高于BP患者(364.79 + /−41.383)和疱疹样皮炎患者(243.10 + /−77.110)相比,健康受试者(52.61 + /−0.779):和分别图1。
chymase(34.05 + /−0.209和24.30 + /−3.438和32.10 + /−0.823),类胰蛋白酶(19.79 + /−1.983和20.74 + /−6.083和19.33 + /−3.231),il - 4(68.66 + /−6.653和71.50 + /−20.219和66.98 + /−10.850),和肿瘤坏死因子α(57.26 + /−1.263和63.57 + /−3.318和62.11 + /−2.558)水平相似的BP和DH的病人,以及健康对照组(图1)。
3.2。肿瘤坏死因子的表达α在皮肤
温和的TNF的表达α被发现在炎症细胞、基底角质细胞和水疱液(图2)。肿瘤坏死因子α表达式也观察到在英国石油公司(17/27)和DH (9/14) perilesional皮肤(图2)。免疫组织化学显示肿瘤坏死因子α表达式中没有控制病人的皮肤活检(图2)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
的形态学分析显示,肿瘤坏死因子α病变的表达明显高于周围的皮肤:在英国石油公司与()和DH与()(表1)(图3)。表达明显高于BP和DH皮肤损伤与对照组(与和与分别地,和0.007028)和英国石油(BP) perilesional皮肤与对照组(和0。,)(图4)。
3.3。MMP9的表达在皮肤上
温和MMP9的表达被发现在BP患者炎症细胞,以及表皮基底细胞DH病人(图2)。MMP9表达也观察到在英国石油公司和DH病人perilesional皮肤。免疫组织化学发现MMP9的表达是没有在控制病人的皮肤活检(图2)。
的形态学分析显示,MMP9的表达明显高于比周围皮肤病变患者的英国石油公司(与,)(表1在那些DH), (与)。表达在皮肤损伤明显高于BP组相对于对照组(与)。MMP9的表达之间没有差异被发现在DH皮肤损伤和perilesional皮肤()(数据3和4)。
4所示。讨论
D 'Auria et al。17髓过氧化物酶之间的相关性研究,粒细胞的特定于产品的,类胰蛋白酶,肥大细胞的蛋白水解酶合成和释放,与泡流体中的各种细胞因子的水平。他们指出类胰蛋白酶的水平之间的正相关,引发,咆哮,显示高细胞因子的活性与大量嗜酸性粒细胞。一些研究证实,嗜酸性粒细胞是非常重要的细胞渗透BP患者的形成。嗜酸性粒细胞、中性粒细胞的标志有一个重要的影响细胞因子网络,以及其他因素,如粘附分子,组织因素,趋化因子。肥大细胞介质的高表达在皮肤损伤和血清表明激活这些细胞在大疱的疾病也很重要。
似乎重要决定介质分泌的肥大细胞参与皮肤损伤的发展迅猛的疾病。肥大细胞标记包括类胰蛋白酶,chymase, il - 4,拥堵,TNFα,MMP9酶。
证明Heimbach et al。18),补充和肥大细胞脱颗粒的激活小鼠模型的BP C5a受体介导的。最近的研究证实这些细胞不仅参与应对病原体和过敏的机制,而且还负责开发中性粒细胞浸润[19]。
使用一个动物BP模型,陈et al。20.,21)也证实,肥大细胞负责大量中性粒细胞和巨噬细胞组织,使真皮的毁灭。肥大细胞的标记物研究了在目前的研究中,水平明显高于被发现的拥堵和MMP9 BP患者。
的机制导致肥大细胞激活和释放蛋白酶在这些疾病知之甚少,但C3a ca5过敏毒素,神经肽,细胞因子可能参与以及许多其他蛋白质或多肽。肥大细胞参与炎症和水疱形成皮下大疱的疾病已经建议,由于早期皮肤损伤有荨麻疹的外表,hypogranulated肥大细胞,和他们的颗粒分布细胞外泡流体包含组胺和类胰蛋白酶水平增加。此外,注入的肥大细胞degranulator,化合物48/80,患者的皮肤疱疹样皮炎引起DH-like大疱的病变在某些情况下(22]。研究结果表明,肥大细胞蛋白酶参与炎症反应;然而,他们直接参与泡的形成还不清楚。有可能是空军和肿瘤坏死因子α诱导和维持的水泡不断激活溶胶原的金属蛋白酶和降解纤连蛋白。
肿瘤坏死因子的表达α在两种疾病也显著升高大疱的病变与健康受试者相比。细胞因子的表达显著降低观察在正常皮肤也很重要,建议肿瘤坏死因子的参与α在炎症涌入和水泡的形成。
我们的研究结果证实肿瘤坏死因子的作用α和肥大细胞在皮肤损伤的形成发展的中性粒细胞浸润和随后的活化的免疫机制。介质由这些细胞分泌可能会影响早期的改变已被描述,如荨麻疹的鞭痕伴随着强烈的瘙痒,在英国石油公司。
组织的破坏与基质金属蛋白酶活性增加有关的疾病往往是不平衡的结果这些酶及其抑制剂的活性。最近,基质金属蛋白酶已报告发挥重要作用在皮肤疾病的发病机理,包括起泡疾病(23]。酶被认为扮演了一个重要的角色在这些疾病中,除了一系列的免疫现象导致水泡的发展。
炎症细胞基质金属蛋白酶的主要来源。中性粒细胞在皮肤形成大量释放矩阵和immunoglobulin-degrading酶(24,25]。Cytokine-secreting淋巴细胞引起的多核细胞涌入和肽链内切酶的激活(24,26]。
最近的文献数据显示,IgA-Ag复合物在组织的不同IgA-mediated疾病,DH,负责组织损伤是由于迁移感应以及粒细胞激活。这就是为什么粒细胞无法摧毁的复合物导致吸引新的多核细胞,维持炎症,和,因此,引起组织损伤(27]。
我们的研究结果证实肿瘤坏死因子的存在α患者和MMP9在组织从DH确认上述IgA-Ag复合物的作用。中性粒细胞是这些物质的主要来源之一,作为重要的炎症细胞。最重要的是,他们拥有Fcα国际扶轮表面受体,它允许链接到IgA,激活组织损伤过程。
自分泌和旁分泌作用的细胞因子在炎症细胞和角化细胞出现导致基质金属蛋白酶及其抑制剂之间的不平衡。这种现象会导致细胞外基质的结构的变化(26,28,29日]。一些作者(29日- - - - - -31日)已经证实胶原酶和弹性蛋白酶释放主要来自炎症细胞,无论本构这些酶的分泌的角化细胞(32- - - - - -34]。
先前的报道证实stromelysin 1活动的增加在DH患者皮肤损伤。它是一种酶的蛋白质降解基底膜和激活procolagenasis。没有增加等基质金属蛋白酶的表达matrilysin已经观察到,尽管他们可能会引起基底膜蛋白的蛋白水解作用如entactin和IV型胶原蛋白(35]。在我们的研究中,发现MMP9表达不仅在基底角质细胞,而且在所有其他层的表皮BP患者。金属蛋白酶9可能有助于形成水泡的锚定的降解纤维(34]。
我们的经验证实这些报道。高MMP9的表达是基底角质细胞中观察到,在强烈的中性粒细胞浸润,疱液。然而,结果显示可能刺激生产的金属蛋白酶的其他层的表皮。MMP9可能是主要的元素负责病变的形成在英国石油公司(32]。液体提取新形成的水泡可能是一个好的材料的金属蛋白酶的活性评估皮肤病变。
最近的报告表明,胶原蛋白第七十七和胶原蛋白,这是锚定纤维的基础上,进行蛋白质水解的影响下一个特定群体的金属蛋白酶。在小鼠模型的大疱类天疱疮,我们et al。34)评估的参与中性粒细胞弹性蛋白酶和MMP9水泡的形成到180年英国石油(BP)抗原的蛋白水解降解。这两种酶被发现在标本病变和水疱液(34]。这些研究尚未证实的结果在活的有机体内实验,主要渗透细胞,嗜酸性粒细胞,没有能力分泌这种类型的金属蛋白酶。
根据获得的结果,可以得出结论,基质金属蛋白酶9活动的增加和随之而来的不平衡组织的酶是负责组织破坏的英国石油公司。考虑到越来越多的有关研究基质金属蛋白酶参与皮肤疾病的病理学,研究MMP抑制剂的治疗用途可以预期在不久的将来。
本研究的结果表明TNF的表达增加α在皮肤损伤,在大疱类天疱疮和疱疹样皮炎。这可以激活其他炎症介质的生产。拥堵和病人的血清MMP9水平升高可能表明激活肥大细胞在泡的过程中形成的这些疾病。在目前的研究中,我们调查了介质的相对贡献的肥大细胞的免疫发病机理BP和DH皮肤损伤。我们得出这样的结论:肥大细胞是活跃的参与者在自身免疫性疾病事件调解组织损伤。疾病有关的肥大细胞数量的增加伴随着肥大细胞脱粒和精化众多肥大细胞炎症介质的网站通常观察到许多人类自身免疫性疾病,如多发性硬化和类风湿性关节炎。在动物模型中,肥大细胞稳定药物或肥大细胞消融治疗可能导致减少疾病(35]。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
这项研究是由罗兹医科大学的研究项目。503/1 - 152 - 01/503 - 01和波兰科学委员会批准号4746 / B / PO1/2009/37。