文摘

越来越多的证据表明,活性氧(ROS)诱发氧化应激和起着至关重要的作用在急性胰腺炎(AP)的发病机理。氢盐水(小时),一个著名的活性氧清除剂,已被证明具有疗效美联社在许多动物实验。最近的研究结果表明,nod样受体家族,pyrin domain-containing 3 (NLRP3) inflammasome,成熟的细胞内所需multiprotein复杂白介素- 1 (IL)β小时的,有可能成为一个潜在的目标AP的治疗。因此,在这项研究中,我们评估了激活NLRP3 inflammasome同时评估氧化应激和炎症级联的程度,以及组织学改变老鼠遭受cerulein-induced AP的治疗后小时。结果表明,激活NLRP3 inflammasome在美联社小鼠显著抑制小时的管理后,这是与减少NF -平行κB活性和细胞因子生产、减少氧化应激和胰腺组织损伤的改善。总之,我们的研究首次表明,激活的抑制NLRP3 inflammasome可能导致小时在AP的治疗潜力。

1。介绍

急性胰腺炎(AP)衰弱胰腺的炎症,通常是由不恰当的intra-acinar胰蛋白酶原的激活。虽然大多数情况下的AP轻度或自限性,有时不受控制的后续事件包括激活免疫细胞,进一步系统性炎症反应的进展能够转换AP严重形式(1,2]。活力释放炎症介质如细胞因子、趋化因子、和活性氧(ROS)在全身炎症反应和多器官功能障碍,导致危及生命的条件携带大量的发病率和死亡率。

目前,许多研究注意力一直集中在ROS的参与和合成氧化应激炎症过程在胰腺炎的发展(3- - - - - -5]。在美联社的早期阶段,一些致病的机制,如蛋白水解破坏,组织缺血,和多形核白细胞激活,刺激生产的ROS作为分子引发各种炎症过程(6]。一般而言,可以将有害活性氧解毒通过内源性抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)或在需要的时候通过外生膳食抗氧化剂,如类胡萝卜素,类黄酮,和维生素e .然而,一旦过度,颠覆了ROS的产生内源性抗氧化剂,氧化应激可能出现与增加细胞损伤。因此,氧化应激的理论攻击负责不仅胰腺损伤的放大,而且随着疾病的发展,从本地系统性损害器官衰竭通常是公认的事实(3]。因此,补充外源性抗氧化剂治疗策略被认为是有益的,至少,一个有用的辅助选项在AP的治疗,可以在一些动物模型(7- - - - - -9]。

在大量的抗氧化剂,氢分子(H₂)正成为一个有前途的候选人在氧化stress-implicated炎性疾病的治疗方法,因为这个简单的分子是一个选择性的有害活性氧的清除剂,如氢氧自由基和过氧亚硝基10,11]。在一些动物实验中,氢气可以更方便地由由吸入或注射溶解于生理盐水的时候达到饱和度(称为氢生理盐水,小时)。最近的研究,包括我们之前的工作,提供了证据表明,治疗小时缓解胰腺炎的严重程度在老鼠,描述潜在的小时在美联社的管理由不同的致病的机制(12,13]。虽然保护作用的分子机制对美联社小时尚未完全阐明,我们认为直接ROS消除小时活动主要是负责其疗效由于特定的细胞毒性ROS清除活动。有趣的是,新兴的证据提出了小时的潜在抑制促炎的级联也有助于减少疾病的严重程度。最近,发现激活的细胞内multiprotein复杂,nod样受体家族,pyrin domain-containing 3 (NLRP3) inflammasome参与胰腺的促炎的进程提供了有价值的见解胰腺炎的发病机制(14]。最良好的inflammasome, NLRP3 inflammasome已被证明具有调节的功能的成熟和释放促炎细胞因子白介素- 1 (IL)β。在以往的研究中,我们发现,增强il - 1的分泌β在老鼠遭受伤害引起胰腺炎大大压抑了小时的治疗,这意味着有可能小时能够抑制激活NLRP3 inflammasome,从而有助于抑制il - 1β生产(13]。因此,本研究将先前的研究扩展到评估潜在的小时抑制NLRP3 inflammasome激活,这可能对实验美联社介导小时的保护活动。

2。材料和方法

2.1。材料

Cerulein购买从σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。抗体p65亚基的核因子-κB (NF -κB p65),我-κBαphosphorylated-I -κBα(》-κBα),thioredoxin-interacting蛋白(TXNIP)、NLRP3 p20的亚基caspase-1 (casp-1-p20),β肌动蛋白,辣根过氧化物酶共轭山羊anti-rabbit抗体是来自圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯、钙、美国)。酶联免疫吸附试验(ELISA)对il - 1包β和肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α从系统研发)得到(明尼阿波利斯,美国)。

小时准备如前所述[15]。总之,H₂气体(0.4 MPa)溶解于生理盐水(NS) 6小时达到0.6更易/ L,浓度和H的浓度₂在NS检测使用溶解氢分析仪(DH-35A;DKKTOA,日本东京)。小时是刚做好的每一周,然后存储在4°C在一个大气压下铝袋没有死体积,在使用前由γ辐射消毒。

2.2。实验老鼠AP模型和治疗

雄性Balb / c小鼠(20 - 25克)是来自四川大学的实验动物中心(成都,四川,中国)。每小时的腹腔内注射引起的实验性AP模型cerulein (50μ克/公斤)为6小时老鼠。一个小时最后注射后,动物收到一个小时的腹腔内注射不同剂量(2、4、8毫升/公斤,每20分钟3次)或控制盐水(空气溶解在NS 0.4 MPa的压力6 h),分别。老鼠在虚假的只有NS治疗组。尾静脉血样采集2 h后最终cerulein管理,和24 h后AP的开始,所有的动物都被二氧化碳窒息牺牲之后,胰腺组织样本的收集。所有程序的老鼠进行了按照指南的四川大学动物保健和使用委员会制度。

2.3。分析NLRP3 Inflammasome激活胰腺

胰腺组织收集和均质在20毫米磷酸盐缓冲剂(pH值7.4)包含0.5毫米丁羟甲苯在4°C,后跟一个离心1500 g×15分钟。然后细胞质蛋白质在组织匀浆提取使用胞质提取试剂按照制造商的指示(美国皮尔斯生物技术,罗克福德,IL)。BCA蛋白质分析工具来确定蛋白质浓度。随后,提取的蛋白质分离SDS-polyacrylamide凝胶,然后转移到一个聚乙二烯二氟化物膜(美国微孔,Billerica的)。膜是孵化与屏蔽解决方案包含5%脱脂牛奶在室温下超过1 h和探测1:1000稀释的兔多克隆抗体TXNIP, NLRP3和casp-1-p20分别。洗后,膜与二次孵化山羊anti-rabbit抗体结合辣根过氧化物酶在室温下1 h。免疫反应性的蛋白质被化学发光可视化使用免疫印迹检测系统(美国新泽西州Amersham生物科学,皮斯卡塔韦)。

2.4。分析NF -κB激活胰腺

核和胞质蛋白在胰腺癌组织匀浆提取使用蛋白质提取工具包(美国皮尔斯生物技术,罗克福德,IL)。NF - dna结合活性κB p65核提取检测酶联免疫试剂盒(TransAM NF -使用一个三明治κB p65,活动主题,卡尔斯巴德、钙、美国)。简单地说,包含NF -寡核苷酸κB consensus-binding网站(5′-GGGACTTTCC-3′) preimmobilized到96孔板上。核提取(1μg)稀释完全裂解缓冲被添加到每个包含30μL在室温下完成绑定缓冲和孵化的1 h和温和的风潮。洗涤三次,洗缓冲区后,抗体NF -κB p65单元添加(1:1000),其次是1 h在室温下孵化。洗后,井孵化与二级抗体结合辣根过氧化物酶(1:1000)在室温下1 h。然后NF - dna结合活性κB p65量化是通过测量吸光度与参考波长450 nm 655海里,井孵化后在室温下与发展中解决方案5分钟。

此外,I -的退化κNF - B引起κ我激活被磷酸化的确定评估-κBα在胰腺提取使用免疫印迹分析如上所述。

2.5。在胰腺SOD的分析活动

比色测定工具包从开曼群岛购买化学公司(美国安阿伯市MI)是用来测量胰腺中超氧化物歧化酶(SOD)的活性,它使用一个四唑盐的检测超氧化物自由基生成黄嘌呤氧化酶和次黄嘌呤。短暂,胰腺组织均质在4°C 20毫米消息灵通的缓冲区(包含1毫米EGTA、210毫米甘露醇、蔗糖和70毫米,pH值7.2),然后在1500×g离心5分钟在4°C。然后激进的检测器(四唑盐)和黄嘌呤氧化酶补充道。在室温下混合后,样品被孵化20分钟和吸光度是读450海里。一个单位(U)的草皮被定义为所需的酶生产50%超氧化物自由基的歧化作用。组织总蛋白浓度是由一个商业工具(建成Corp .),南京,中国),和SOD的活性被表示为U /毫克的蛋白质。

2.6。分析,丙二醛(MDA)、谷胱甘肽水平在胰腺

组织MDA水平,脂质过氧化反应的标记,检测使用一个商业MDA - 586试验设备(OxisResearch,波特兰,或美国)。总之,胰腺组织在20毫米均质磷酸盐缓冲剂(pH值7.4)包含0.5毫米丁羟甲苯在4°C,后跟一个离心1500×g 15分钟。蛋白质浓度测量后,等量的蛋白质被用于一式三份与显色剂反应N-methyl-2-phenylindole形成一个稳定的carbocyanine染料最大吸收586海里。然后MDA水平样本与标准曲线计算得到的装备根据制造商的指示,表示为μ总蛋白的摩尔/ g。

在胰腺组织中谷胱甘肽的水平测量根据研究院和蒂策(资助的报告的方法16]。总之,胰腺匀浆离心机在1500 g×20分钟和1毫升的上层清液混合1毫升5%三氯乙酸30分钟。随后,0.5毫升Ellman试剂(5 5-dithiobis-2-nitrobenzoic酸)和3毫升的磷酸盐缓冲剂(pH值8.0)补充道。彻底混合后,吸光度被记录在412海里。谷胱甘肽水平组织规范化对总蛋白(μ摩尔/ g)。

2.7。胰酶活性和细胞因子在等离子体浓度

血浆样品被离心获得收获的血液标本(1800 g×15分钟在4°C)和淀粉酶和脂肪酶的活动进行了分析通过比色法使用淀粉酶和脂肪酶的商品化试剂盒(南京建成有限公司,中国),分别。淀粉酶和脂肪酶的活动表示为单位每升(U / L)。测定血浆中促炎细胞因子的浓度,对il - 1定量ELISA试剂盒β和肿瘤坏死因子-α根据制造商的指示使用。

2.8。组织学检查

胰腺组织固定在甲醛和嵌入石蜡。然后样本切片,苏木精和伊红染色,使用一个标准的染色过程。组织病理学评价进行了光学显微镜下有经验的实验室病理学家样本组的身份是不可见的。水肿、炎症浸润、出血和坏死依法进行评估报告的评分尺度Rongione所说et al。17]。

2.9。统计比较和演示的数据

所有实验值表示为±SE。统计各组之间比较被评估单向方差分析(方差分析)使用SPSS 13.0软件。价值观的差异被认为是重要的如果值< 0.05。

3所示。结果

3.1。小时抑制NLRP3 Inflammasome激活胰腺在美联社

的NLRP3 inflammasome是一个细胞内multiprotein复杂引发炎症反应。NLRP3的蛋白表达,这inflammasome的重要组成部分,在美联社的进展显著增加。此外,cerulein-induced胰腺炎的发展明显刺激TXNIP的表达,NLRP3活动的关键调节器。类似的海拔还发现激活caspase-1 p20亚基的蛋白表达,作为一个标记的NLRP3 inflammasome激活。然而,小时的治疗剂量依赖性降低NLRP3表达水平,TXNIP, casp-1-p20,表现出显著的抑制活性的NLRP3 inflammasome激活(图1)。

3.2。小时抑制NF -κB在胰腺激活AP

众所周知,NF -κB是无处不在的控制促炎基因表达的转录因子在炎症相关的疾病包括美联社的发展。在目前的研究中,NF - dna结合活性κB p65胰腺的ELISA显著增加胰腺炎的感应,表明NF -的激活κB,而这是政府大幅沮丧的小时剂量反应的方式(图2(一个))。与ELISA数据一致,胞质》——的蛋白表达κBα从美联社小鼠胰腺匀浆上升明显,证明我——的退化κb .同样,小时显示剂量依赖性抑制降解的I -κB,同意NLRP3活动抑制作用(图2 (b))。

3.3。小时改善胰腺损伤美联社老鼠

如数据所示3和4,实验美联社cerulein政府引起的小鼠显著升高血浆胰酶活动和胰腺的病理损伤。没有明显变化,血浆淀粉酶和脂肪酶的活动在AP治疗后小鼠小时在不同剂量(图3)。此外,只有在高剂量(4和8毫升/公斤×3),小时授予胰腺组织良好的组织病理学变化,主要表现为降低细胞质液泡一代,缓解炎症浸润,与实质坏死组织病理学评分较低的平行(数字4(一)和4 (b))。

3.4。小时降低血浆细胞因子浓度美联社老鼠

促炎细胞因子TNF -α和il - 1β众所周知,调解在胰腺炎放大炎症过程。这是表明TNF -等离子体浓度α和il - 1β显著增加小鼠遭受cerulein-induced美联社,这实质上废除了小时的治疗(图5)。此外,一个明显的剂量依赖性的影响血浆il - 1小时下降β水平观察;然而,中等剂量的小时(4毫升/公斤×3)没能证明其优越性在降低TNF -α在美联社发布老鼠相比,低剂量(2毫升/公斤×3)。

3.5。小时抑制氧化应激在胰腺美联社

为了验证小时的潜力减少氧化应激在美联社,我们测量胰腺MDA的变化水平,在氧化应激过程中脂质过氧化反应的指标,以及内源性抗氧化剂谷胱甘肽和草皮。正如所料,增强氧化应激在胰腺中观察到老鼠后AP的起始,以增加数量的MDA和SOD活性下降,谷胱甘肽水平。相比之下,政府的小时剂量依赖性降低MDA生产,伴随着SOD水平升高,谷胱甘肽(图6)。此外,小时的能力帮助招募观察内源性抗氧化剂只在中间(4毫升/公斤×3)或高剂量(8毫升/公斤×3)在我们的实验。

4所示。讨论

在过去的几年中,一直有持续争论的好处与外源性补充抗氧化剂氧化应激相关的炎性疾病管理很大程度上是因为一旦认为这些抗氧化剂只担任ROS拾荒者,从而帮助纠正,或抗氧化失衡18]。然而,最近发现消除活性氧的抗氧化剂抑制激活NLRP3 inflammasome和il - 1的合成成熟β做了新的阐述理解角色的抗氧化剂在炎症相关疾病的发病机理19]。在这里,我们发现,尽管小时未能抑制血浆胰酶的活动,它显著减少小鼠的胰腺损伤对胰腺炎的感应,连同受损NLRP3 inflammasome活动,表明潜在的小时阻止NLRP3 inflammasome激活可能参与胰腺损伤的改善。此外,本研究的数据已经证明了小时的可能机制抑制激活NLRP3 inflammasome。首先,因为NF -κB激活显示以前传统的启动信号诱导NLRP3表达式,NF -的封锁κB小时活动,表达的差别用以下对这些NLRP3,可能授予压制NLRP3 inflammasome激活。此外,治疗小时促进消除活性氧,从而减少TXNIP的表达,NLRP3 ROS-sensing蛋白质需要激活,也导致封锁NLRP3 inflammasome激活。

先天免疫系统的重要组成部分,NLRP3 inflammasome最初发现是由病原体激活(20.- - - - - -23]。近年来,一些内源性分子被称为有关分子模式(抑制),如细胞外葡萄糖、尿酸、淀粉样蛋白-β透明质酸,已经被证明是激活NLRP3 inflammasome,扮演重要的角色在代谢紊乱和无菌炎症反应包括II型糖尿病、痛风、阿尔茨海默氏症和创伤后组织损伤24- - - - - -27]。至于美联社,一些已知的细胞外NLRP3活化剂像DNA一样,三磷酸腺苷(ATP)、高机动组框1 (HMGB1)和核苷酸结合寡聚化域2 (NOD2)都与炎症相关的在胰腺炎的发展。此外,一些研究,包括我们之前的工作,显示,硫酸乙酰肝素(HS),细胞外基质的降解产物抑制的一个重要成员,引发细胞内的炎性反应,导致胰腺炎的恶化28- - - - - -30.]。因此,上述研究结果暗示可能,海关可能会作为一个未知的兴奋剂NLRP3 inflammasome从而促进美联社的进展。在这种背景下,出现了一个有趣的问题需要解决未来的工作,也就是说,小时是否具有抑制能力推测HS-induced激活NLRP3在胰腺炎的发展。很明显,说明这个问题具有相当大的意义,进一步理解氢分子在美联社的有益作用。

此外,尽管机制的治疗潜力小时可能是共享的其他抗氧化剂由于活性氧清除能力,小时仍表现出显著的优势氧化stress-implicated疾病的治疗。首先,是已知的哺乳动物物种缺乏内生氢氧自由基解毒系统,这被认为是最强的氧化剂之一种核酸的有害反应,脂类,蛋白质,进一步造成不可逆的细胞损伤。与其他已知的外源性抗氧化剂相比,氢分子可以有选择地淬火氢氧自由基形成水由于独特的分子结构和化学性质,同时不过分干扰有益的生理角色ROS像超氧化物阴离子10]。此外,小时很容易注射或口服药物,甚至用作其它治疗药物的溶剂。因此,小时以上提到的优点使它成为一个优秀的候选人解毒的氧化应激在临床应用。

总之,我们的工作,第一次显示小时可以作为拮抗剂的NLRP3 inflammasome导致细胞炎症过程的衰减,因此在美联社缓解胰腺损伤。这一发现使得进一步的理解机制的保护作用对美联社小时而且标志着NLRP3 inflammasome作为未来潜在目标这个危险的疾病的治疗方法。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是由四川省卫生部门的医学科学研究基金会(没有。110477)和成都军事综合医院的研究基金会(没有。2011 yg-a18),授予Jian-Dong任。