文摘

目的。调查IL-27对人类的影响滋养层和底层的监管信号机制在子痫前期。方法。IL-27和IL-27受体的表达(WSX-1)研究了在子痫前期患者胎盘或血清。在体外,我们调查的影响IL-27单独或结合炎性细胞因子肿瘤坏死因子(TNF -α)人滋养层细胞的促炎激活(HTR-8 / SVneo)和底层细胞内信号分子。结果。IL-27和IL-27受体的表达α(WSX-1)显著升高在子痫前期患者胎盘的滋养层细胞与控制样本。在体外,IL-27可能诱发炎症因子的表达干扰素-γ诱导蛋白10 (CXCL10 / IP-10)和il - 6在滋养层,观察和协同效应的综合治疗IL-27和TNF -α在释放IP-10和il - 6。此外,生产IP-10和il - 6 IL-27刺激的差异受细胞内激活磷脂酰肌醇3-OH kinase-AKT, p38MAPK, JAK / STAT通路。结论。这些结果提供了一个新的见解IL-27-activated免疫病理的影响由不同的细胞内信号转导分子在子痫前期。

1。介绍

子痫前期是一个复杂的怀孕特有高血压综合征,这是一个全球孕产妇和新生儿死亡的主要原因。所有怀孕(作为一个系统性炎症是很常见的1),建议过度的炎症反应是怀孕可能会导致子痫前期(2]。此外,血管生成失衡也扮演着重要的角色在子痫前期的发病机制与血压有关,肾和内皮功能障碍,和滋养层驱逐出境,以及更短的怀孕期间,胎儿生长受限,和疾病的严重程度和早产发生子痫前期(3]。

最近,更多的研究集中在滋养层细胞的作用可以调节炎症通过广泛和复杂的机制在子痫前期的发展。细胞因子和趋化因子是最重要的炎症介质导致炎症。在体育,滋养层细胞表达炎性细胞因子包括白细胞介素1 (ILs)β、2、4、6、8、10、12、18、转化生长因子(TGF) beta1干扰素-γ诱导蛋白10 / IP-10,肿瘤坏死因子(TNF)α干扰素(IFN)γ,单核细胞趋化蛋白1 (MCP),细胞间粘附分子1 (ICAM)和血管细胞黏附分子(VCAM) 1 (4,5]。其中,il - 6是一个典型的多功能促炎细胞因子激活血管内皮细胞和胎盘产生的6]。增加产妇血清il - 6水平与子痫前期的发病严重程度和7]。IP-10科学家趋化因子家族的细胞因子,结合受体CXCR3诱导趋化作用,细胞凋亡,细胞生长,angiostasis [8]。子痫前期被发现与产妇血清浓度的IP-10中值高于正常妊娠(9]。IP-10促炎和抗血管新生属性,这趋化因子提出了一个潜在的炎症和抗血管之间的联系在子痫前期10]。因素的识别和理解的机制调节细胞因子的生产被认为是基本的理解体育的起源在炎症过程。

IL-27 heterodimeric细胞因子由p28, IL-12p35-related亚基,和EBI3(巴尔病毒诱导基因3),一个IL-12p40-related单元,属于il - 6 /白介素家族。IL-27受体由IL-27Ra (WSX-1 / TCCR)亚基,独特的IL-27为绑定,gp130亚基与IL-6R[共享11,12]。IL-27R已经发现表达单核细胞,树突状细胞,T和B淋巴细胞自然杀伤(NK)细胞,肥大细胞,内皮细胞,而IL-27主要是由抗原递呈细胞(APC) (13,14]。它可以激活多种细胞的目标,导致生产的各种炎症介质,包括TNF -α,il - 1β、il - 6、地震MIP-1α,MIP-1β,β-defensin-2,从而增强炎性反应发生在一些人类疾病(15]。然而,IL-27的角色在PE的发病机制尚未阐明。因此推测,可能有一个异常的患者IL-27 PE的生产。本研究的目的是探讨如何IL-27激活人滋养层细胞在体育及其潜在的信号通路。

2。材料和方法

2.1。主题

子痫前期( )和正常孕妇( )参与了这个研究,我们把它们分成两组。匹配的条件包括年龄(±3年),平价(0、1 - 3和4 +)和胎龄(±14天)。所有病例和控件与任何已知的单例妊娠胎儿异常。案例特征详细表1。

表1
第三阶段研究的临床特征之间的正常孕妇和子痫前期女性。

子痫前期的诊断是基于妇产科学院的指导方针。实验临床研究伦理委员会批准重庆医科大学第一附属医院和知情同意从所有参与者根据《赫尔辛基宣言》。

2.2。生物样本

胎盘从正常和preeclamptic剖腹产孕妇得到来自重庆医科大学第一附属医院。

新鲜胎盘提前冻立即进行处理,获得与10%福尔马林固定的免疫组织化学研究。血液样本取自一个肘前的静脉EDTA抗凝管然后离心机在4°C的相对离心力3000 g 10分钟。血清是储存在−80°C到分析。

2.3。试剂

重组人白介素,IL-23 IL-27, TNF -α和干扰素-γ美国从研发系统购买(MN)。GAPDH抗体来自细胞信号技术(马、美国)。鼠标anti-TCCR / WXS-1和anti-gp130马伯购买从研发系统(锰、美国)。兔子anti-IL-27马伯购买从Abcam (HKSP香港)。鼠标anti-phospho-p38增殖蛋白激酶(MAPK) anti-phospho-inhibitor(我)κB -α,anti-p38MAPK anti-phospho-Akt anti-IκB -α,anti-Akt马伯从BD购买生物科学(美国CA)。Janus激酶(激酶)抑制剂AG490,我κB -α磷酸化抑制剂BAY1167082,磷脂酰肌醇3-OH激酶(PI3K)抑制剂LY294002 p38MAPK抑制剂SB203580, c-Jun n端激酶抑制剂SP600125(物)和细胞外signal-regulated激酶(ERK)抑制剂U0126从Calbiochem购买公司(美国圣地亚哥,CA)。在这个程序中,DMSO溶液的浓度是0.1%(卷/卷)为所有数据子集。

2.4。免疫组织化学

Formalin-fixed人类胎盘部分石蜡包埋在二甲苯deparaffinized然后在一系列分级患者酒精。的部分与PBS 10分钟,然后冲洗两次阻止了5% (wt /卷)脱脂牛奶/ PBS淬火后一小时,以减少非特异性绑定内源性过氧化物酶的活性为3%(卷/期)H2O2在PBS 30分钟。部分是孵化anti-IL-27马伯(Abcam115671,香港)和anti-WSX-1马伯(RD AF1479),稀释5% (wt /卷)脱脂牛奶16 h在4°C。消极的控制进行相同的进展。超级敏感的链接标签包含IHC检测系统(BioGenex,圣拉蒙,CA)使用后冲洗两次与PBS和特定的免疫染色显示为3,3-diaminobenzidine液体基质系统(σ,圣路易斯,密苏里州)。所有的部分都与苏木精counter-stained 40秒和安装UltraKit (j·t·贝克,代芬特尔、荷兰)。五个字段为每个胎盘组随机从每组和三个胎盘。

2.5。细胞培养

HTR-8 / SVneo细胞系是请提供医生CH女王大学的格雷厄姆·金斯顿,加拿大。细胞生长在RPMI 1640中补充10%胎牛血清和100 U /毫升青霉素(表达载体佩斯利、苏格兰、英国)37°C公司5%2的气氛。细胞被胰蛋白酶处理,从培养瓶,然后播种密度1×106细胞/毫升。后24 - 48 h文化,semiconfluent层受到治疗。

2.6。聚合酶链反应

从细胞RNA提取试剂盒试剂(表达载体,卡尔斯巴德,CA),当时跟着DNAse我消化和反转录TaqMan逆转录试剂(应用生物系统公司Inc .,福斯特城、钙、美国)。表中描述的PCR引物的序列2。简单,反应定量实时PCR进行uL 25卷2 uL cDNA、400 nm每个有意义的和反义引物,和12.5 uL辉煌SYBR绿色QPCR大师混合(豆类生物公司,东京,日本)在7000年ABI棱镜(应用生物系统公司,培育城市,CA)。反应进行了40周期,在95°C与变性为30秒,退火在53°C 30秒和扩展在72°C,持续10秒。GAPDH基因的放大作为内生参考。比较阈值周期(CT)方法申请相对量化数据分析。

表2
寡核苷酸用于PCR和实时PCR。
2.7。ELISA

人类IL-27 IL-27测定血清中使用酶联免疫试剂盒用预镀钢板(美国圣地亚哥BioLegend)。根据制造商的指示,IP-10和il - 6水平与平等文化上层的细胞数量是由酶联免疫试剂盒化验用预镀钢板(研发系统、MN、美国)。为每个分析标准和测试样本一式三份。

2.8。免疫印迹

细胞和组织是清洗和细胞溶解和等量的蛋白质,以确保平等的蛋白质加载受到sds - page,然后涂抹到PVDF膜(通用电气医疗集团,皮斯卡塔韦,新泽西,美国)。膜被5%的牛血清白蛋白和探测特定的主要抗体在一夜之间在4°C。洗后,膜与二次孵化抗体与辣根过氧化物酶(通用电气医疗集团)45分钟37°C。Antibody-antigen复合物被发现使用ECL化学发光检测系统(通用电气医疗集团)。

2.9。统计分析

所有数据都表示为均值±SD从三个独立的实验。组之间的差异被克鲁斯卡尔-沃利斯检验分析,Mann-WhitneyU测试中,学生的t以及,或者单向方差分析分析。为了测试这两个参数之间的相关性,采用非参数斯皮尔曼等级相关系数。 被认为是明显不同的。

3所示。结果

3.1。分析IL-27 IL-27受体从PE患者胎盘组织中的表达

女性IL-27血清测定与子痫前期和正常孕妇(图1),两组之间没有显著差异。IL-27受体的表达在胎盘组织中PE和对照组也被评估。免疫印迹分析证实,WSX-1的表达在胎盘组织中PE组显著高于对照组(图2(一个))。免疫染色的formalin-fixed石蜡包埋串行部分,IL-27(图2 (b))和WSX-1(图2 (c))也被调节在子痫前期胎盘的滋养层细胞与控制样本。


图1
之间没有显著变化循环IL-27正常和preeclamptic怀孕。IL-27被ELISA检测血清中女性的子痫前期的诊断( )和匹配控制正常怀孕( )。血液样本被怀孕的第三个三个月。酒吧代表中间值。
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图2
分析IL-27和IL-27受体表达在胎盘组织。(a)代表免疫印迹分析IL-27受体亚基WSX-1在胎盘组织。正常怀孕的前三个代表样本(N)组和最后一个是体育组。(b) (i)免疫组织化学染色的IL-27和WSX-1胎盘组织。(b)和(d)显示了IL-27组织化学染色,在正常控制(N)组;(c)和(e)显示了IL-27组织化学染色,在子痫前期(PE)组。(f)和(h)的免疫染色WSX-1在正常控制(N)组;(g)和(我)显示WSX-1组织化学染色,在子痫前期(PE)组。β肌动蛋白被用作蛋白质控制以确保等量的蛋白质。原来放大:100 x c、f, g, h;400 x为d、e、h和i。所有的实验都是在三个独立的复制。
3.2。IL-27可能上调IP-10和il - 6表达HTR-8 / SVneo细胞

因为有一个表达升高IL-27 WSX-1 PE患者的胎盘组织,然后我们决定IL-27对人类的影响滋养层细胞(HTR-8 / SVneo)。首先,它是证明IL-27受体复杂包括WSX-1和gp130既定的表达在人类的滋养层细胞信使rna和proteinlevels(数字3(一个)和3 (b))。然后定量实时PCR应用于屏幕滋养层细胞表达的炎症介质激活IL-27 (50 ng / mL;0 - 4 h)(图3 (c))。IP-10和il - 6的表达增加,而il - 1α,il - 1β、il - 10和MMP-9没有引起IL-27(数字3 (d)和3 (e))。此外,蛋白质IP-10和上层清液中il - 6水平明显增加(数据3 (f)和3 (g))。

(一)
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图3
IL-27 IL-27受体表达在HTR-8 / SVneo细胞和调节CXCL10和il - 6。(一)对WSX-1 RNA和蛋白表达。(b) gp130的RNA和蛋白质表达。分别从左到右车道,是Hct116(人类结肠癌细胞),Skov3(卵巢细胞癌)和HTR-8 / SVneo。Hct116和Skov3被用作控制。GAPDH被用作蛋白质控制以确保等量的蛋白质。(c)的影响IL-27 (50 ng / mL)的mRNA表达炎性介质。动能基因表达CXCL10 (d)和il - 6 (e)与IL-27 HTR-8 / SVneo细胞受到刺激。* ,* * 和* * * 相比团体之间用水平线( )。刺激后的蛋白质含量(f) CXCL10 IL-27 (0-50 ng / mL)在细胞上清液HTR-8 / SVneo (0 30 h)。(g) il - 6蛋白表达后刺激IL-27 (0-50 ng / mL)在细胞上清液HTR-8 / SVneo (0-48 h)。* ,* * 和* * * 当比较在起始时间点水平。所有的实验都是在三个独立的复制。
3.3。IL-27和肿瘤坏死因子-α强协同生产IP-10 HTR-8 / SVneo il - 6

尽可能多的促炎细胞因子发挥至关重要的炎症作用在体育4,16),我们调查是否IL-27 IP-10调节生产和il - 6在HTR-8 / SVneo刺激与促炎细胞因子(TNF -α)、il - 6 /白介素家族细胞因子(il - 12和IL-23), Th1细胞因子(IFN -γ)或IL-17C。IL-27和TNF -的综合治疗α导致协同upregulation IP-10 (176.8±13.38 pg / mL IL-27孤独;肿瘤坏死因子- 64.75±0.6059 pg / mLα独自一人;和1721±65.02 pg / mL IL-27 + TNF -α)(图4(一))和il - 6蛋白表达(274.4±17.76 pg / mL IL-27孤独;肿瘤坏死因子- 2180±195.3 pg / mLα独自一人;和3645±252.9 pg / mL IL-27 + TNF -α)(图4 (b))。此外,IL-27结合干扰素-γ只能分析诱导IP-10生产(176.8±13.38 pg / mL IL-27孤独;干扰素- 1466±35.59 pg / mLγ独自一人;1513±42.53 pg / mL IL-27 +干扰素-γ)和il - 6的差异不显著(图4(一))。然而,IL-27和il - 12, IL-23或IL-17C没有这样的协同或相加作用。

(一)
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图4
IL-27和肿瘤坏死因子-α强协同生产CXCL10 HTR-8 / SVneo il - 6。CXCL10和il - 6蛋白水平检测ELISA与细胞因子刺激后。肿瘤坏死因子-剂量α和干扰素-γ20岁ng / mL和其他细胞因子是50 ng / mL。结果表示为三个独立实验的算术平均值+ SD。* * 和* * * 相比治疗组和控制之间的关系。# # # 联合治疗组之间相比,IL-27刺激组( )。
3.4。影响不同的信号分子抑制剂在HTR-8 IP-10和il - 6 / SVneo IL-27激活

研究信号通路的调节HTR-8 / SVneo IL-27的激活效应,不同的信号分子抑制剂应用。不同信号分子抑制剂的毒性阈值HTR-8 / SVneo MTT比色第一次试验(见补充1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2014/926875)。激酶抑制剂的最佳浓度被用于AG490 VM (9), NF -κ0.9 B抑制剂BAY1167082 (VM), PI3K抑制剂LY294002 (8.4 VM), p38MAPK抑制剂SB203580 VM(36),物抑制剂SP600125 VM(7)和ERK抑制剂U0126 (VM) 20日有显著的抑制作用没有细胞毒性。最后,发现p38MAPK抑制剂SB203580, PI3K抑制剂LY294002,和木菠萝抑制剂AG490可以显著抑制IL-27-induced IP-10 HTR-8 / SVneo和il - 6生产,而BAY1167082 SP600125, U0126并未表现出显著的抑制作用(数字5(一个)和5 (b))。

(一)
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(b)
(b)
图5
信号分子抑制剂影响生产CXCL10和il - 6在HTR-8 / SVneo。AG)的影响,分析湾LY,某人,SP或U IL-27诱导CXCL10和il - 6释放取决于酶联免疫吸附试验。与AG490 HTR-8 / SVneo细胞进行预处理(9 VM;AG)、BAY1167082(0.9虚拟机;湾)、LY294002(8.4虚拟机;LY)、SB203580 (36 VM;某人)、SP600125(7虚拟机;SP)或U0126 (20 VM;U) 1 h后跟孵化进一步24小时或48小时有或没有IL-27 (50 ng / mL)。DMSO溶液(0.1%)被用来控制车辆。 Results are expressed as the arithmetic mean ± SD from three independent experiments. * 和* * * 相比团体之间用水平线。
3.5。影响IL-27 STAT3的激活,p38MAPK, PI3K-Akt HTR-8 / SVneo信号通路

上面的抑制试验之后,这是进一步研究IL-27能否激活JAK / STAT,通过免疫印迹,PI3K-Akt p38MAPK信号通路。p38MAPK, IL-27可能引起重大的磷酸化STAT3和PI3K-Akt HTR-8 / SVneo(数据的时间依赖方式6(一),6 (b),6 (c))。

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图6
影响IL-27 STAT3的激活,p38MAPK, PI3K-Akt HTR-8 / SVneo信号通路。(一)免疫印迹分析STAT3磷酸化的代表。免疫印迹分析(b)代表一种蛋白激酶的磷酸化。(c)免疫印迹分析磷酸化p38MAPK的代表。

4所示。讨论

在正常怀孕,炎症是必要的在胎儿发育的几个阶段,但它应该严格监管,防止组织损伤fetomaternal接口。在这项研究中,这是首先展示了一个特异表达的表达IL-27和IL-27R (WSX-1)在女性体育IL-27促炎激活人类滋养层,它提供了一种可能的妊娠高血压疾病和炎症之间的联系。

的血清水平IL-27 PE患者和正常对照组的确定。然而,两组之间没有显著差异。有趣的是,WSX-1的表达在胎盘组织中发现了免疫印迹了PE患者和正常对照组之间的显著差异。进一步的免疫组织化学染色法测定表明,IL-27和IL-27R的表达α从胎盘滋养层细胞组织与正常对照组相比显著增强,表明有一个特异表达的表达IL-27 IL-27Rα,PE的发病机制中发挥重要作用。

滋养层细胞中央参与体育的发病机制。因此我们把HTR-8 / SVneo细胞作为细胞模型研究的潜在作用IL-27炎症介质诱导的滋养层细胞在体外。发现IL-27可能诱发显著高于HTR-8 / SVneo IP-10和il - 6。在以前的研究中,已经证实,子痫前期患者血清IP-10和il - 6的浓度明显高于正常孕妇(7,9]。il - 6参与滋养层入侵、扩散和氧化应激的发病机制中扮演重要角色PE (17,18]。IP-10强有力的反血管增生和促进粘附、迁移和入侵的滋养层细胞属性与PE的发病机理有关9,19- - - - - -24]。此外,il - 6和IP-10已被证明是高度表达在子痫前期孕妇血清与控制样本。在这里,我们发现IL-27小说诱导物IP-10和il - 6的滋养层细胞,这表明IL-27 - IP-10 / il - 6轴可能在体育的发展尤为重要。

还有许多其他炎症介质参与体育的发病机制(16,25]。因此,我们进一步调查IL-27能否增加生产IP-10或从滋养层细胞il - 6分别刺激促炎细胞因子(tnf)、il - 6 /白介素家族细胞因子(il - 12和IL-23), Th1细胞因子(IFN -γ),或者IL-17C。证明IL-27可以增强IP-10和il - 6生产滋养层细胞与肿瘤坏死因子-α。肿瘤坏死因子-α生产过剩一直在观察子痫前期患者(26,27和子痫前期的动物模型28),这表明它扮演着一个重要的角色在产妇的生理反应观察子痫前期(29日]。

阐明的分子信号机制调节感应IP-10和il - 6 IL-27滋养层细胞,抑制试验和西方螺栓分析被用来确定在滋养层细胞信号通路。使用特定信号分子选择性抑制剂,我们表明,抑制JAK / STAT p38MAPK, PI3K-Akt能部分抑制IL-27 IP-10和il - 6,表明激活JAK / STAT IL-27, PI3K-Akt p38MAPK信号通路的滋养层细胞可能导致体育的发展。

IL-27促炎因子是参与许多人类炎性疾病的发病机制,如牛皮癣、关节炎、哮喘(30.- - - - - -32]。因此,IL-27代表一个潜在的候选人管理一些疾病的治疗方法。针对应用TNF -抗体的封锁α,il - 1β,il - 6受体作为RA的治疗,这是假设IL-27可能为PE(提供治疗的另一个目标33- - - - - -35]。尽管许多人类的免疫生物学研究信息在描述如何IL-27可能翻译,它应该被认为是个体多态性可能如何影响IL-27的表达模式。本研究为小说的发展提供了新线索IL-27-mediated PE治疗炎症,和进一步的研究应该调查IL-27是否可能是一个体育的直接治疗干预的目标。

综上所述,我们的研究结果提供的证据表明,IL-27可以在体育起着重要的作用。IL-27发现诱导IP-10和滋养层细胞中il - 6的表达通过激活JAK / STAT, PI3K-Akt p38MAPK信号通路。阐明IL-27之间的交互和IP-10 / il - 6将有助于理解和治疗PE。

缩写

体育: 子痫前期
IL: 白介素
IL-27R: IL-27受体
IL-27Rα/ WSX-1: IL-27受体α链
IP-10 / CXCL10: 干扰素-γ诱导蛋白10
ICAM: 细胞间粘附分子
干扰素: 干扰素
基质金属蛋白酶: 基质金属蛋白酶
Th: 辅助T
肿瘤坏死因子: 肿瘤坏死因子
VCAM: 血管细胞粘附分子
TGF: 转化生长因子
ELISA: 酶联免疫吸附试验
木菠萝: Janus激酶
物: c-Jun伴激酶
MAPK: 有丝分裂原激活蛋白激酶
PI3K: 磷脂酰肌醇3-OH激酶
统计: 信号传感器和转录的活化剂
APC: 抗原递呈细胞
AG: AG490
湾: BAY117082
供应: LY294002
某人: SB203580
SP: SP600125
你: U0126
DMSO溶液: 二甲亚砜。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者表达了他们最大的感谢Ju曹。作者还要感谢董姗姗,Eric种植,凯恩,帅,语丝刘魏王主任朱之鑫歌,达恩,Aie周,习Xiuyu徐、精益杨,和唐的技术援助。作者是感激的优秀的技术援助重点实验室和广东省重点实验室的主要产科疾病的诊断医学教育部指定的,重庆医科大学。这项工作已经为中国国家自然科学基金资助(81070502号,81170585,81100444,81370731),在中国国家重点临床部门的资金。

补充材料

最优浓度不同的特定信号分子抑制剂HTR-8 MTT比色/ SVneo化验。(一)激酶抑制剂AG490 (b) NF - ?B抑制剂BAY1167082 (c) PI3K抑制剂LY294002 (d) p38 MAPK抑制剂SB203580 (e)物抑制剂SP600125 ERK抑制剂U0126 (f)。所有的实验都是在三个独立的复制。

  1. 补充材料