文摘

Glucagon-like peptide-1 (GLP-1),肠道激素导致葡萄糖稳态,是由proglucagon合成和分泌肠神经内分泌细胞在营养。glp - 1在2型糖尿病患者分泌受损。在这里,我们旨在调查糖尿病是否有毒产品(糖化血清(GS)或高水平的血糖(HG))可能影响生存能力,功能和胰岛素敏感性的GLP-1 GLUTag分泌细胞线。细胞培养5天的存在与否不同稀释的GS HG。GS和HG(单独或联合)增加活性氧(ROS)生产和调节proglucagon mRNA表达与控制媒体。只有HG GLP-1总产量增加,释放活跃,而独自GS废除GLP-1分泌活跃。HG-mediated效果与增加细胞相关的内容激素原转化酶1/3 (PC) 1/3,而GS单独表达下调这种酶。HG调节葡糖激酶(门将)和表达下调SYNTHAXIN-1。GS废除SYNTHAXIN-1 SNAP-25。最后,高剂量的GS单独或结合HG减少insulin-mediated IRS-1磷酸化。总之,我们表明,GS和HG可能调节不同通路的glp - 1在糖尿病、生产直接改变神经内分泌细胞分泌的激素的功能。

1。介绍

Glucagon-like peptide-1 (GLP-1)是一种肠道激素调节glycaemia通过增加胰岛素和胰高血糖素的减少分泌,打捞β细胞的凋亡,胃排空的规定,和食物摄入量1- - - - - -3]。GLP-1被转译后的处理proglucagon合成和分泌特殊肠神经内分泌细胞,L-cells,为了应对饮食营养(特别是碳水化合物和脂肪)(4,5]。演示后glp - 1在治疗2型糖尿病是一种很有前途的分子,有一个激烈的辩论GLP-1在糖尿病的病理生理意义6- - - - - -10]。拉斯克和同事在一群无症状的主题与GLP-1分泌胰岛素抵抗负相关(11,12]。符合这些发现,林和他的同事证明了glp - 1在应对胰岛素分泌,表明胰岛素抵抗可能与变更有关GLP-1胞外分泌[13]。几项研究显示,一种长期的高血糖持续的有害影响血糖控制得以实现,这种现象定义为“代谢记忆”(14- - - - - -16]。众所周知,高血糖增强内生非酶的糖基化的蛋白质、脂质、核酸,这一过程可能导致的累积异构分子被称为先进的糖化终端产品(年龄)中增加糖化血清(GS) [17,18]。几项研究显示,一个严格的相关性的加速形成年龄和糖尿病的并发症19- - - - - -22),提出“代谢记忆”可以解释为持续生产过剩的活性氧(ROS)直接引起的年龄(23- - - - - -25]。鉴于GLP-1-mediated有益的活动的重要性,恢复正常的血糖在糖尿病患者体内平衡,我们旨在调查GS和高葡萄糖(HG)水平是否会影响在体外可行性、功能和胰岛素抵抗在GLP-1分泌GLUTag细胞系(26]。

2。材料和方法

2.1。GS的准备

GS准备通过增加50更易/ L核糖heat-inactivated(一小时56°C)的边后卫,像前面描述的那样27]。整除的边后卫的相同的方法处理但是没有核糖(nonglycated血清、门店)和用于标准中准备。Pentosidine内容评估来衡量蛋白质糖化,如前所述[28]。pentosidine在媒体实验的浓度范围在400 (GS)和800 nmol / L (2 g),对应的水平在病理生理范围内检测在糖尿病患者的血浆29日]。

2.2。细胞培养和激励

(请提供调频博士GLUTag细胞。蛀木水虱、剑桥医学研究所、临床生物化学、英国剑桥博士d·德鲁克许可,多伦多大学,加拿大)分泌GLP-1针对一些神经递质和营养(26]。扩散维护、细胞生长在DMEM (5.6 L更易与葡萄糖)补充10%胎牛血清的边后卫,2更易/ L谷酰胺,青霉素100单位/毫升和100µ克/毫升链霉素。每次实验前的细胞被分为6-well盘子和培养5天在不同文化条件:DMEM低葡萄糖(5.6更易/ L) (CTR)或DMEM高葡萄糖(25更易/ L)与不同浓度的GS (HG)补充。

2.3。活性氧的检测

细胞内活性氧(ROS)水平测定使用cell-permeable荧光探针,2′,7′二氯荧光素二乙酸(DCFH-DA) (Sigma-Aldrich、米兰、意大利)。总之,细胞被播种到6-well文化板块2×105细胞/ 5天治疗,如前所述,然后洗两次与汉克的缓冲盐溶液(hbs),并与新鲜DCFH-DA(25孵化μ米)在哈佛商学院30分钟37°C公司5%2。在哈佛商学院之后,细胞被洗两次,和富国满心1毫升哈佛商学院在荧光采集板阅读器(TECAN InfinitePro200)(例:λ485 / Em:λ535海里)。荧光发射规范化总蛋白质含量。结果表示为荧光相比的百分比来控制(CTR) (100%)。

2.4。细胞生存能力分析

细胞被播种到96 -文化板块2×104细胞/好,治疗5天。细胞增殖率决定使用细胞效价96水一个解细胞增殖测定(意大利PROMEGA,意大利米兰)根据制造商的指示。简单地说,这是一个比色法确定可行的细胞的数量通过MTS四唑降低测量通过甲瓒生产。MTS四唑化合物bioreduced细胞到彩色甲瓒产品直接与活细胞的数量成正比的文化。值表示为吸光度CTR相比的百分比(100%)。

2.5。逆转录酶聚合酶链反应

细胞总RNA提取GLUTag RNeasy工具包(试剂盒开发。意大利米兰)根据制造商的指示。RNA浓度测定spectrophotometrically和相同数量的总RNA从不同的样本。一微克的RNA是reverse-transcripted cDNA使用GoScript逆转录系统(意大利PROMEGA,意大利米兰)。然后使用以下特定的引物进行PCR扩增:proglucagon TGAAGACCATTTACTTTGTGGCT,反义TGGTGGCAAGATTATCCAGAAT;GAPDH TCCACCCTGTTGCTGTAG,反义GACCACAGTCCATGCCATCACT。所有的样品在一个线性放大放大范围建立使用串行cDNA稀释和不同数量的周期(proglucagon 28 GAPDH周期,30)。预测区间的大小(bp)的片段如下:proglucagon, 493;GAPDH, 453年。PCR产物琼脂糖凝胶电泳到1.5%包含EuroSafe核酸染色(EUROCLONE焦燕雄。一、意大利米兰)和可视化紫外线照射下。的相对强度乐队被光密度分析量化。 Results were shown as percentage change from CTR level (100%).

2.6。测量GLP-1生产和分泌

细胞细胞溶解使用缓冲区里帕(Sigma-Aldrich、米兰、意大利)和溶解产物GLP-1内容的分析。glp - 1在上层清液,溶解产物使用化验是一个活跃的GLP-1酶联免疫试剂盒(美国密理博公司,Billerica的)。的ELISA试剂盒的测定变异intra-assay CV 8%, interassay CV 9%。文化GLP-1总产量的总和计算GLP-1的媒体和细胞内容。

研究GLP-1分泌,细胞被洗和汉克斯平衡盐溶液和2小时孵化中含有0.5%的边后卫。2 h后治疗、媒体收集和DPP-4抑制剂添加(10µL /毫升)(美国密理博公司,Billerica的)。然后媒体离心去除污染细胞和储存在−80°C到ELISA测定。分泌正常化是蛋白质含量相应的细胞溶解产物。分泌量之间的比率计算的GLP-1介质和总GLP-1的文化内容。总和GLP-1公布结果显示为百分比变化从CTR水平(100%)。

2.7。免疫印迹

最后的实验GLUTag细胞细胞溶解在里帕缓冲区(50毫米三羟甲基氨基甲烷HCl液pH值7.5,150毫米氯化钠,NP40 1%, 0.1% SDS、补充与蛋白酶和磷酸酶抑制剂),和蛋白质浓度测定采用BCA蛋白质化验设备。30微克的细胞溶解产物在sds - page分离和转移到硝基。过滤器被封锁在5% BSA和孵化一夜之间在4°C主要特定抗体(anti-SNAP-25, anti-Syntaxin-1、anti-Glucokinase和反β肌动蛋白从圣克鲁斯生物技术有限公司圣克鲁斯,CA,美国;美国从微孔anti-PC 1/3, Billerica的;anti-Insulin受体底物(IRS-1) Phospho-IRS-1 Tyr895,和胰岛素受体β从细胞信号技术(红外),贝弗利,妈,美国)。二次特定的辣根过氧化物酶与抗体被添加在室温下1小时。结合抗体检测使用一个增强化学发光照明系统(Luminata干白、微孔Billerica,妈,美国),根据制造商的指示。验证等于加载的蛋白质,膜被剥夺,reblocked, reprobed检测β肌动蛋白。值感兴趣的蛋白质的总数量的规范化β肌动蛋白。评估特定的磷酸化的IRS-1 Tyr895 GLUTag细胞培养5天与年龄或高葡萄糖浓度、洗涤、采用无血清培养2小时,最后暴露5分钟100 nmol / L胰岛素。细胞细胞溶解,溶解产物分离与特定的抗体通过sds - page和免疫印迹anti-phospho IRS-1 (Tyr895)。被膜和reprobed anti-IRS-1抗体正常化的屁股总蛋白质含量。乐队感兴趣的被测密度术使用美国国立卫生研究院项目ImageJ量化。结果表示为百分数的CTR(定义为100%)。

2.8。统计分析

结果代表至少3实验。所有与GraphPad Prism 4.0软件进行分析(GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)。数据被表示为均值±SE。比较控制和单一的治疗方法是使用Dunnett测试完成的。 值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。GS和HG增加细胞内的活性氧产量而不影响细胞的生存能力

ROS已被证明可能调解lipoapoptosis GLP-1-secreting细胞(30.和增加AGE-mediated损害其他细胞系统31日,32]。孵化与不同浓度的GS(在病理生理范围内糖尿病患者的血浆)(29日]或高葡萄糖(HG)相比显著增加细胞内活性氧的生产与控制细胞培养中(图1(一))。然而,伴随的刺激与GS和HG并不改变ROS生产比HG。没有细胞生存能力差所示GLUTag细胞培养在同等条件下(图1 (b))。

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图1
GS和HG增加细胞内ROS在不影响GLUTag细胞生存能力。5天治疗后的标准介质(CTR)或高葡萄糖浓度(25更易/ L) (HG)存在不同浓度的糖化血清(400 (GS)和800 nmol / L (2 g)), ROS细胞内生产(a) (b)和细胞生存能力进行评估。值显示表明吸光度CTR相比的百分比。数据表示为均值±SE (ROS)或 (细胞生存能力)独立实验。 , , 和点击率。
3.2。GS和HG不同调节GLUTag细胞的功能

为了调查是否与GS和HG影响孵化在体外GLUTag细胞功能,细胞表达proglucagon GLP-1的生产和发布。Proglucagon mRNA表达显著调节在不同剂量的GS和HG(或两者的结合)相比,细胞孵化控制介质(数字2(一个)和2 (b))。在相同的细胞,只有HG(单独或在GS)调节GLP-1总产量比控制(图3(一个))。没有影响对孵化与GS(图所示3(一个))。因此,孵化与汞水平(单独或在GS)显著增加glp - 1在细胞释放上层清液(图3 (b))。尽管是统计学意义,略微减少GLP-1 GLUTag细胞内浓度浮层显示在GS相比控制介质(图3 (b))。

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图2
GS和HG增加proglucagon mRNA的表达。半定量rt - pcr GLUTag proglucagon mRNA表达的细胞刺激标准介质(CTR)或高葡萄糖浓度(25更易/ L) (HG)存在不同浓度的糖化血清(400 (GS)和800 nmol / L (2 g))。(一)代表琼脂糖凝胶。(b)量化微的琼脂糖凝胶。数据被表示为均值±SE ( )。 和点击率。
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图3
HG增加GLP-1总产量和释放。GLP-1总产量水平(a)(计算的总和的上层清液和细胞内容GLP-1)和glp - 1在上层清液被释放(b)所示。数据表示为均值±SE ( )。 , , 和点击率。

为了识别不同刺激引发的分子机制GLUTag细胞功能的规定,我们专注于激素原转化酶1/3 (PC1/3)被证实是一个关键酶proglucagon GLP-1在L-cells[的转译后的处理33,34]。孵化与GS与PC 1/3蛋白表达水平明显降低在细胞培养在低葡萄糖浓度(数字4(一)和4 (b))。另一方面,电脑1/3显著调节HG孵化(单独或在GS)(数据4(一)和4 (b))。由于胞外分泌GLP-1颗粒可能相关的对接和融合活动SNAP-25和syntaxin-1 GLUTag细胞(35),我们研究这些蛋白质在细胞培养的水平。SNAP-25显著降低了两个GS在细胞培养在低浓度葡萄糖浓度,但不受HG孵化(数字5(一个)和5 (b))。相反,SYNTHAXIN-1蛋白质水平只减少了GS在细胞培养的最高浓度较低的葡萄糖浓度和HG(单独或在GS)(数据6(一)和6 (b))。为了评估是否GLP-1蛋白分泌是耦合的葡萄糖代谢,蛋白质含量的葡萄糖传感器葡糖激酶(门将)评估在相同的细胞培养。HG增加了GK水平相比控制介质(数字7(一)和7 (b))。另一方面,GK在细胞培养在HG的表达并不是受到GS(数字7(一)和7 (b))。

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图4
HG PC 1/3蛋白质含量增加,而GS减少它们。(一)代表免疫印迹分析。(b)量化微的免疫印迹。数据表示为±SE褶皱感应相对β肌动蛋白( )。 和 和点击率。
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图5
GS SNAP-25蛋白质含量降低。(一)代表免疫印迹分析。(b)量化微的免疫印迹。数据表示为±SE褶皱感应相对β肌动蛋白( )。 和点击率。
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图6
更高浓度的GS和HG SYNTHAXIN-1蛋白质含量降低。(一)代表免疫印迹分析。(b)量化微的免疫印迹。数据表示为±SE褶皱感应相对β肌动蛋白( )。 和 和点击率。
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图7
HG葡糖激酶的蛋白质含量增加。(一)代表免疫印迹分析。(b)量化微的免疫印迹。数据表示为 褶皱感应相对β肌动蛋白( )。 和 和点击率。
3.3。GS和HG不同调节GLUTag细胞对胰岛素的反应

因为年龄显示诱导胰岛素抵抗在几个细胞类型和胰岛素敏感性与GLP-1分泌(9,11,36- - - - - -39),我们调查是否高葡萄糖糖化血清在GLUTag细胞可能与胰岛素抵抗有关。作为insulin-mediated函数,我们调查了激素的能力使磷酸化IRS-1(胰岛素受体底物)的一个主要基质的胰岛素受体(IR)在胰岛素信号级联。IRS-1 Insulin-induced磷酸化(Tyr895) GLUTag细胞保存细胞孵化时控制介质(如预期的积极控制),糖化血清低剂量、高葡萄糖(数字8(一个)和8 (b))。相反,insulin-induced磷酸化IRS-1 (Tyr895)没有维护的最高剂量的GS在低葡萄糖浓度和细胞培养的两种剂量的GS (HG条件下数据8(一个)和8 (b))。类似的控制中,细胞培养与HG单独显示显著增加IRS-1磷酸化胰岛素的反应。来验证这些结果是否由于IRS-1表达的改变,它的蛋白质含量是评价GLUTag细胞。IRS-1水平无显著变化显示在不同的文化条件下相比,控制媒体。

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图8
GS废除insulin-induced IRS-1的磷酸化(酪氨酸- 895)在低和高的葡萄糖浓度。5天治疗后的标准介质(CTR)或高葡萄糖浓度(25更易/ L) (HG)存在不同浓度的糖化血清(400 (GS)和800 nmol / L (2 g)), GLUTag细胞在无血清培养基培养2小时,然后,暴露在黑暗(酒吧)与否(白色酒吧)100 nmol / L胰岛素5分钟。(一)代表免疫印迹分析。(b)量化微的免疫印迹。数据表示为±SE褶皱感应相对β肌动蛋白( )。 和 而缺乏胰岛素;n。:不重要的。

4所示。讨论

本文的主要发现是,GS的不利影响主要是明显的细胞培养时以低葡萄糖浓度。相反,当刺激与GS在HG条件下,GS并不改变HG-mediated细胞的反应除了insulin-induced IRS-1磷酸化。

本文的另一个重要的发现是由细胞内ROS增加生产的示范GLUTag细胞暴露于GS或HG没有任何修改细胞生存能力。最近,凯普和同事证明孵化与棕榈酸酯能够增加lipotoxicity GLUTag细胞通过增加活性氧的生产(30.]。令人惊讶的是,我们在这里显示,这些事件可能不相关。然而,我们的数据显示两个糖尿病有毒产品的不利影响。特别是,GS-induced ROS生产也伴随着潜在的功能损害(glp - 1在GLUTag分泌的减少)。考虑HG, ROS生成葡萄糖可能是由于过载(40]。

尽管GLP-1维持血糖稳态的基本作用,长期的监管GLP-1由神经内分泌细胞分泌相对被忽视在糖尿病基础研究和临床研究。特别是,它仍然探讨高血糖症或“代谢记忆”是否会直接影响到生存能力,功能和胰岛素敏感性的GLP-1分泌细胞。在这项研究中,我们提供了证据表明糖尿病有毒产品(如GS和HG)不同GLP-1分泌细胞功能的影响,导致对GLP-1分泌明显相反的影响。

事实上,尽管两种刺激增加proglucagon mRNA表达,只有HG GLP-1导致增加生产。这种差异可能是由于proglucagon mRNA的主要退化或有缺陷的处理proglucagon GLP-1。GS和HG的相反效应细胞内蛋白质含量的PC 1/3(酶负责特定的转译后的处理proglucagon进入肠道GLP-1 L细胞)(33,34可能表明GLUTag细胞可能无法保持一个持续的暴露在GS proglucagon转换。

考虑到生产GLP-1细胞暴露于GS相媲美,在控制培养基培养细胞中观察到,我们的结果表明,降低glp - 1在其分泌可能是由于一个缺陷。类似于其他内分泌细胞,肠道L-cells GLP-1储存在细胞内颗粒,通过胞外分泌释放41- - - - - -43]。2009年,Ohara-Imaizumi和同事报告说胞外分泌GLP-1密切与胰岛素类似颗粒从胰岛细胞融合,与葡萄糖刺激,会引起两相的颗粒胞外分泌的融合两种类型的颗粒(44]。这种调节胞外分泌通路的神经和内分泌细胞可能取决于针对颗粒特定膜隔间和涉及颗粒的相互认可与质膜蛋白质的蛋白质。特别是SYNTHAXIN-1和SNAP-25质膜(居民)最近与synaptobrevin锚定复杂颗粒。这些蛋白质组装成稳定的对接和融合复合物在GLUTag细胞(35]。改变表达式和本地化SYNTHAXIN-1和SNAP-25已报告在内分泌和神经细胞暴露于高血糖症(45,46]。此外我们发现较低的表达Syntaxin-1和SNAP-25胰岛细胞培养与GS (47]。一直与这些结果,我们发现有缺陷的glp - 1在GLUTag分泌细胞暴露于GS可能是由于这些蛋白的表达改变。自细胞内蛋白质含量SYNTHAXIN-1表达下调了GS和HG SNAP-25下降只有与g细胞培养,我们的研究结果表明,主要SNAP-25 GLP-1胞吐是至关重要的。

本研究的另一个主要结果是由GS和HG监管者的身份在GLUTag细胞葡萄糖代谢和胰岛素抵抗。的不同调节酶活性(只增加了HG)可能表明一个微分调节细胞的葡萄糖代谢。根据观察Reimann和蛀木水虱[42)的增加表达GK GLUTag细胞暴露于汞可能改善糖酵解通量,因此,ATP生成导致upregulation GLP-1分泌。另一方面,我们发现高水平的GS GLUTag细胞显著减少胰岛素反应,这种效应是独立于IRS-1表达式。有趣的是,这些结果表明,g细胞可能诱导胰岛素抵抗也不是认为古典insulin-mediated活动的目标。此外,由于胰岛素已经显示调节GLP-1释放L细胞(13,48),我们的研究结果表明,胰岛素抵抗和GLP-1分泌物之间的负相关9,11)还可能涉及胰岛素抵抗细胞分泌GLP-1。

5。结论

总之,本研究表明,GLP-1分泌细胞的功能可能会受到“糖尿病环境的影响。“虽然高度投机性由于这些实验是有限的这一事实在体外细胞培养、刺激与GS与ROS增加有关生产、upregulation proglucagon mRNA水平,减少proglucagon处理。另一方面,HG与ROS增加生产,proglucagon mRNA表达,GLP-1生产和分泌,和表达的PC 1/3和星期。此外,我们的研究结果表明,“代谢记忆”可能比高血糖症本身有害,这表明即使在面前euglycaemic条件前血糖控制远足需要仔细考虑在糖尿病并发症有不利影响。

利益冲突

作者没有利益冲突披露。

承认

这项工作是由瑞士国家科学基金会支持格兰特(没有。32003 f . Montecucco博士b-134963/1)。