文摘
人类间充质基质细胞(MSC)具有免疫抑制和杀菌作用,在一定程度上由tryptophan-catabolizing酶indoleamine-2, 3-dioxygenase (IDO)。因此MSC代表一个有前途的新型细胞免疫抑制剂有可能控制steroid-refractory急性移植物抗宿主病(GvHD)。此外,MSC可以减少感染的风险在患者造血干细胞移植(HST)。最近的数据表明,从微环境信号包括微生物可能调节MSC效应函数。作为巨细胞病毒(CMV)代表一个杰出的病原体在宿主免疫功能不全的,尤其是在病人HST之后,我们调查的影响MSC-mediated巨细胞病毒感染对免疫系统的影响。我们证明CMV-infected MSC失去细胞因子诱导的免疫抑制能力和不再能够限制微生物的增长。IDO的表达明显受损的巨细胞病毒感染后的MSC和这种交互关键取决于完整病毒和MSC的数量以及病毒载量。从公开的巨细胞病毒感染可能会破坏MSC治疗移植物抗宿主病的临床疗效在移植患者,我们建议病人定于MSC治疗应该进行彻底的评估一个活跃的巨细胞病毒感染和接收CMV-directed抗病毒治疗前MSC。
1。介绍
人类多能间充质基质细胞(MSC),闻名multilineage分化潜力,具有多效性的部分介导的免疫抑制功能的表达tryptophan-catabolizing酶indoleamine-2, 3-dioxygenase (IDO) [1- - - - - -4]。在与炎性细胞因子的刺激,MSC具有广谱抗菌效应函数针对各种临床相关病原体,这些影响是依赖语言和/或抗菌肽LL-37 [5,6]。这些双重免疫抑制和抗菌性呈现MSC密集的下一个有前途的新型细胞免疫抑制剂目前临床研究为各种汽车,同种免疫的疾病,如steroid-refractory移植物抗宿主病(GvHD)后同种异体造血干细胞移植(HSCT)、克罗恩病、多发性硬化(7- - - - - -10]。新兴的数据表明,缺氧引起的信号从微环境包括(11,12]或来源于微生物可能严重影响我因此MSC效应函数(13- - - - - -15]。随着巨细胞病毒(CMV)代表一个重要病原体尤其是在宿主免疫功能不全的患者患有GvHD HSCT后,我们开始研究调查MSC-mediated巨细胞病毒感染效果的影响。在与其特定的宿主共同进化,人类巨细胞病毒已经开发了一些免疫逃避策略(16- - - - - -18]。例如,巨细胞病毒已经报告给抑制upregulation MHC II级抗原。此外,发现巨细胞病毒通常通过干扰素-抑制信号γ受体,这是通过减少介导的磷酸化STAT1 Jak1和一个增强的退化[19- - - - - -21]。
间充质基质细胞和胚胎干细胞能够抑制t细胞反应和几种机制包括生产前列腺素、免疫抑制细胞因子(3),精氨酸酶的我22),或腺苷酸(23,24]似乎参与了这一效应。此外,我们和其他报道,间充质基质细胞的免疫调节作用,至少部分由色氨酸降解酶的诱导吲哚胺2,3-dioxygenase [4]。
我们报告,巨细胞病毒是一个主要的消极语言活动的监管机构在人类MSC,大大减少免疫抑制和抗菌性,从而暗示,活性巨细胞病毒感染可能破坏MSC治疗的临床疗效。
2。材料和方法
2.1。主细胞
人类骨骨髓来源MSC准备、传播和特征如前所述[5]。代的骨髓送气MSC得到从健康志愿者捐助方提供书面知情同意;研究根据赫尔辛基宣言的原则和伦理委员会批准的医学院Heinrich-Heine-University,德国的杜塞尔多夫。
2.2。细胞系和试剂
OKT3生产从美国获得杂种瘤细胞类型文化集合(美国罗克维尔市)。重组人干扰素-γ购买从研发系统(德国威斯巴登)。—l -色氨酸L-kynurenine 1-L-methyl-tryptophan (1-MT)和埃利希试剂被命令从Sigma-Aldrich (Deisenhofen,德国)。
2.3。人类巨细胞病毒
巨细胞病毒株AD169和TB40E请提供的c . Sinzger(医学病毒学研究所,乌尔姆,德国)和a·齐默尔曼(病毒学研究所,杜塞尔多夫,德国)。感染MSC之前,解决方案是“(分泌物)解冻和稀释tryptophan-free RPMI 1640介质达到感染复数(MOI) 0.1 -10。在一些实验中UV-inactivated巨细胞病毒制剂。分析了病毒复制使用实时PCR(描述5]。
2.4。犬尿氨酸测定
被罩的酶活性与犬尿氨酸的浓度直接相关的组织培养细胞的上清液,因此测量犬尿氨酸可用于确定被罩活动(25]。MSC (2×104每口井)镀在96 -平底微量滴定板在IMDM含有5% FCS色氨酸和0.6毫米。与干扰素刺激——文化γ在各自的实验浓度表示。板块在孵化后37°C和72 h 160μL从每个好,被转移到96 - v形底板。之后的10μL 30%三氯乙酸,嗯,板块在50°C 30分钟孵化水解N-formyl-kynurenine犬尿氨酸。在600 g离心10分钟后,100年μL上层清液被转移到96 -平底的盘子和100μL 1.2% (w / v) 4 -(二甲胺基)苯甲醛在冰醋酸(埃尔利希试剂)补充道。10分钟后在室温下,灭绝决心在492 nm标(Tecan, Crailsheim,德国)。数据给出的意思是犬尿氨酸一式三份的文化内容。在一些实验中我被coculturing诱导MSC与OKT3-stimulated外周血淋巴细胞三天。作为一个控制1-L-MT(1.5毫米)或中和anti-IFN -γ抗体(10 ng / mL)当时添加MSC刺激点。此外,被罩蛋白质中检测出MSC刺激使用[描述免疫印迹分析5]。
2.5。淋巴细胞增殖试验
1×105外周血淋巴细胞(PBL),获得健康的捐赠者heparinised血液聚蔗糖净化后,刺激了单克隆anti-CD3抗体(OKT3,美式文化收藏,罗克维尔市,美国)存在不同数量的MSC描述(26]。在一些实验中MSC (0.5 2×104每口井)感染了巨细胞病毒和/或刺激干扰素-γ在文化的开始。三天后的文化与0.2脉冲μCi (3H]胸苷为24小时。t细胞增殖是衡量3H]胸腺嘧啶核苷掺入使用液体闪烁谱(1205 Betaplate, PerkinElmer Jugesheim,德国)。
2.6。金黄色葡萄球菌
MSC被感染10 - 100 cfu /。细菌生长监测进一步孵化16 h后通过测量光密度在620纳米27]。
2.7。统计分析
所有数据给出均值±SEM的至少三个独立的实验,每个实验进行了一式三份。数据代表的实验中,也表现在一式三份,有平均数±标准差。比较不同的数据的学生的以及未配对组和使用值的计算使用GraphPad棱镜软件。
3所示。结果与讨论
人类深刻的t细胞抑制能力的多功能间充质基质细胞引起了很多利益promting研究调查MSC小说细胞免疫抑制剂,特别是steroid-refractory HSCT后移植物抗宿主病。探讨巨细胞病毒感染的潜在影响治疗效果的MSC在这种背景下,我们建立了一个三方细胞培养系统,OKT3-induced t细胞增殖的存在与否的评估人类MSC,感染了巨细胞病毒感染复数5 (MOI 5)或不及时治疗。如图1我们找到了一个深刻的MSC的t细胞的抑制作用,这部分但显著逆转巨细胞病毒的存在。这种效果,然而,不依靠CMV-infected MSC CMV-directed t细胞反应没有诱导t细胞增殖没有OKT3刺激(图1)。此外,从我们的捐助者的T细胞不扩散的巨细胞病毒和巨细胞病毒不会大幅改变T细胞的反应与anti-CD3抗体刺激后如图2(一个)。之前我们已经表明我的感应,至少部分负责降低t细胞增殖诱导MSC (4]。为了证明这个发现我们用IDO抑制剂1-L-methyl-tryptophan(1吨)。如图2 (b)人类msc抑制t细胞的反应,这种抑制作用可以废除的巨细胞病毒或1-MT。
(一)
(b)
实验来证实这些发现,我们进行了一系列15后续实验使用不同数量的CMV-infected MSC。我们发现2×104MSC提供大量抑制t细胞增殖和巨细胞病毒的持续对抗这种t细胞的抑制作用。在所有15个实验进行巨细胞病毒的抑制作用MSC-mediated观察t细胞抑制;然而,这种效应的大小变化(图3(一个))。相比之下,5×103MSC无法限制t细胞增殖,在这些条件下,相同数量的巨细胞病毒采用的实验如图3 (b)没有任何影响T细胞,从而排除了一个未指明的巨细胞病毒的效果。综上所述,这些数据表明,巨细胞病毒感染人类的MSC大大阻碍了他们的抑制效应t细胞功能。
(一)
(b)
在先前的研究中,我们和其他人的干扰素-发现了一个重要的角色γ诱导tryptophan-catabolizing酶indoleamine-2, 3-dioxygenase (IDO) MSC-mediated t细胞抑制(4,28]。在其他的研究中,我的角色在宽容感应了在活的有机体内研究使用被罩缺乏动物(29日]。基于这些发现的影响我们继续评估人类MCS的巨细胞病毒感染细胞因子诱导的语言活动。如图4(一)时,我们观察到大量IDO-mediated犬尿氨酸生产MSC在OKT3-activated T细胞的培养。正如预期的那样,伊多活动在MSC诱导激活T细胞可以被中和抗体针对干扰素-γ以及由IDO-specific抑制剂1-L-methyl-tryptophan。然而,特别感兴趣的是,CMV-infected MSC无法表达我活动的激活T细胞,而UV-inactivated巨细胞病毒准备被罩活动没有影响。因此,与replication-competent巨细胞病毒感染显著削弱干扰素-γ全身的语言表达在人类MSC。
(一)
(b)
除了他们的免疫抑制能力,MSC最近被证明具有细胞自动抗菌效果针对各种临床相关病原体(5,6,15]。因此,我们继续分析巨细胞病毒的潜在影响MSC-mediated OKT3-stimulated T细胞释放的细胞因子引起的抗菌效果。如图4 (b),MSC cocultured激活T细胞能够限制细菌生长和巨细胞病毒感染对MSC废除他们的抗菌效果金黄色葡萄球菌。的功能相关性IDO-mediated抗菌效果证实了证明添加过多色氨酸完全废除了抗菌效应MSC(图的函数4 (b))。
在其他实验中我们分析了CMV-mediated抑制干扰素-γ更详细地诱导被罩活动在人类MSC。我们发现巨细胞病毒感染损害人类细胞因子诱导的被罩活动MSC与显著抑制剂量依赖性的方式观察到巨细胞病毒剂量低的莫伊0.6,最大效果的莫伊5(图5(一个))。此外,免疫印迹分析,描绘在图5 (b)MSC结果的显示,巨细胞病毒感染减少IDO的表达蛋白质。
(一)
(b)
首次在我们目前的工作描述,巨细胞病毒感染严重损害人类MSC的免疫抑制和抗菌效应功能可能与干扰素-通过一个交互γ全身的语言通路。我们证明这个巨细胞病毒之间的相互作用和IDO-mediated效应函数的基质细胞极度依赖于完整的病毒和宿主细胞和病毒的数量。
我们最近报道,人类成纤维细胞失去巨细胞病毒感染后免疫抑制的能力,这一发现可能与host-versus-graft反应相关疾病引发的实体器官移植术后巨细胞病毒感染/复活(26]。在这里,我们表明,类似CMV-mediated对MSC的影响可能会影响这些细胞作为免疫抑制剂的临床有效性。
我们知道我们的观察都是从这一事实在体外细胞培养实验。在在活的有机体内情况一个免疫抑制治疗,必要在移植患者,可能导致一个抑制干扰素-γ生产,因此抑制被罩感应(30.]。在高浓度糖皮质激素等免疫抑制物质能增强语言活动(31日,32]。此外广泛机关取向,不同的细胞,细胞取向的差异可能影响CMV-mediated抑制被罩激活(33]。然而,根据巨细胞病毒感染的物种特异性以及语言表达(5,34),鼠在活的有机体内实验包括人性化的异种移植模型将不幸的不是信息的在活的有机体内巨细胞病毒感染对MSC-mediated免疫抑制和杀菌作用。
我们尤其关注MSC在我们的研究中,这些细胞是一种很有前途的新颖的治疗方法对各种临床应用从组织工程和再生医学治疗的汽车——对传统药物免疫抑制和同种免疫的疾病耐火材料35,36]。可以推测,巨细胞病毒的抑制作用与IDO-mediated免疫抑制效应可以解释巨细胞病毒感染的临床观察一致频繁触发造血干细胞移植后移植物抗宿主病(37]。
这里给出的结果可能会影响未来移植医学和临床使用MSC。我们发现MSC和成纤维细胞是宽容的巨细胞病毒感染,并能抑制病毒生长由于IDO-dependent机制(5]。两种细胞类型也敏感CMV-mediated免疫逃避机制(26]。我们建议干扰素-之间的平衡γ被罩感应、巨细胞病毒剂量依赖性油抑制存在剂量依赖的相关性可能会影响器官或干细胞移植的临床结果CMV-infected病人。我们知道病毒负荷的大小和干扰素-γ浓度病毒感染人体组织内斑块是未知的。但是我们建议病人定于MSC治疗应该进行彻底的评估一个活跃的巨细胞病毒感染和接收CMV-directed抗病毒治疗管理MSC之前,如果合适,因为公开的巨细胞病毒感染的MSC接受者可能破坏MSC治疗的临床疗效。
因此,战略,旨在恢复语言表达CMV-infected MSC在某些临床场景可能是有益的。进一步研究描述不同的信号通路中巨细胞病毒的目标和结果调制IDO的表达在MSC是必要的识别分子靶点治疗干预。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
罗兰Meisel和凯瑟琳Heseler分享第一作者。
确认
作者感谢Silke Stuhlsatz,医学微生物学研究所和医院卫生,Heinrich-Heine-University杜塞尔多夫,专家的技术援助。这项研究是由德国联邦教育和研究(BMBF)资助。01 gn0951 (Walter Daubener Rudiger Volker Sorg),没有。01 ki1002e(沃尔特·Daubener),不。01 gn0990 (Roland Meisel),没有。01 gm0873 (Roland Meisel),德国研究委员会(DFG)批准号RU 729 (Walter Daubener)和“Forschungskommission Universitatsklinik杜塞尔多夫”(沃尔特·Daubener)。