文摘

目的。调查lipoxin A4 (LXA4)的保护作用后大鼠睾丸损伤睾丸扭转/反扭转。方法。一只老鼠睾丸扭转模型建立了描述。大鼠随机分为6组:虚假的集团,扭转,扭转/反扭转(T / D)集团和T / D + LXA4-pretreated组(3组)。老鼠在LXA4-pretreated组收到LXA4注入(0.1、1.0和10μLXA4-pretreated子组1 - 3克/公斤体重,resp)。反扭转前一剂1 h。生化分析、细胞凋亡的评估和形态学评价睾丸切除术后进行。结果。GPx和SOD水平显著增加,MDA含量显著降低LXA4-pretreated组相比,T / D组。LXA4也恢复和TNF - - 2α基础水平和改善LXA4-pretreated组il - 4和il - 10的表达。此外,NF -的表达κB在LXA4-pretreated组表达下调。LXA4治疗还展示了一种改进的睾丸形态和睾丸细胞凋亡的减少。结论。Lipoxin A4保护老鼠对睾丸损伤后扭力/反扭转通过调节细胞因子,氧化应激,NF -κB的活动。

1。介绍

睾丸扭转4000年发生在频率为1比25岁年轻男性(1]。这是一种常见的泌尿道的紧急导致睾丸坏死,导致生育能力下降2]。主要的病理生理的事件在睾丸扭转是缺血再灌注;因此,睾丸扭转/反扭转被认为是一个睾丸缺血/再灌注损伤(IRI) (3]。许多药物已经用于防止IRI睾丸后睾丸扭转在动物模型(4- - - - - -7]。这些先前的研究表明,治疗后IRI睾丸扭转/反扭转可能导致减少氧化应激,炎症,减少和改善睾丸形态学睾丸。

Lipoxins脂氧合酶是衍生脂质介质与抗炎和proresolution属性已被证明在体内和体外8]。Lipoxin A4 (LXA4)是哺乳动物的主要生理期间Lipoxin炎症系统(9]。lipoxins的保护作用与IRI已在很多器官,包括大脑,心脏,肾脏,胃(10- - - - - -13]。然而,据我们所知,LXA4对睾丸扭转后IRI /反扭转的影响尚未报道。在目前的研究中,一只老鼠模型被用来研究LXA4的角色在睾丸扭转/反扭转。

2。材料和方法

2.1。动物和试剂

所有实验按照指南的动物使用和武汉大学保健委员会。60 ~ 90天的特定无菌(SPF)雄性SD (SD)中得到了老鼠重180 ~ 200克从动物实验中心/动物III级生物安全实验室(ABSL-III实验室)武汉大学在中国。老鼠分别住在笼子里黑暗12 h: 12 h光周期23±2°C标准环境条件下,可以免费获得颗粒饮食和自来水。

2.2。动物模型和研究设计

大鼠随机分为6组:(1)虚假的集团():老鼠收到虚假的操作,无需额外的干预;(2)扭转组();(3)扭力/反扭转(T / D)组()和(4)T / D + LXA4-pretreated组(在每个子组,3组总)。扭力和反扭转协议持续了6个小时。双侧睾丸切除术进行最后的协议。详细,双边睾丸切除术进行虚假手术后6 h虚假的组;老鼠在扭转组双边睾丸切除术后6 h扭力没有反扭转;老鼠在T / D组和T / D + LXA4组收到了2 h扭转4 h反扭转紧随其后。反扭转,扭转和虚假的操作进行左侧睾丸通过midscrotal垂直切口如前所述14]。LXA4 ([5 s - 6 r - 15 s-trihydroxy-7e, 9 e, 11 z, 13 e-eicosatetraenoic酸);开曼化学,安阿伯市,美国)腹腔注射1 h反扭转前T / D + LXA4组作为一个单一剂量(0.1、1.0和10μ子群1 - 3克/公斤体重,职责)。老鼠与戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(50毫克/公斤体重;美国克利夫兰Amresco)。组织样本收集用于生化分析和形态学评估的研究协议。一半的每个新鲜的睾丸被冰冷的磷酸盐(PBS) (pH = 7.4),然后保持在−70°C的测量细胞因子水平,MDA水平,组织SOD、GPx活性。重新获得勇气一半的睾丸被分为两个部分,福尔马林固定在10%或2.5%戊二醛对光学显微镜和电子显微镜,分别。

2.3。在睾丸细胞因子的表达

细胞因子IL4、il - 10 - 2, TNF -α被发现使用商业ELISA包根据制造商的协议(Beyotime生物技术研究所、江苏、中国)。每个板涂上100年μL的捕获抗体和孵化一夜之间在4°C。盘子被封锁与测定稀释剂洗后1 h。睾丸组织匀浆(100μ与蛋白酶抑制剂L) PBS补充添加到每个孵化前板。工作检测器(100μL)加载到每一个,并且之前的板是孵化1 h添加底物的解决方案。通过添加50反应停止μL停止解决方案。执行计算浓度对数线性回归。

2.4。表达式的丙二醛和超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活动睾丸

新鲜的睾丸组织置于一个1.5毫升离心管。增加250μ与蛋白酶抑制剂L•瑞帕缓冲区。匀浆当时离心机在11000 g×10分钟在4°C。的上层清液用于测定丙二醛(MDA)使用商业套装(开曼群岛,安阿伯市,MI)和睾丸的检测超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活动。睾丸SOD活性测定与SOD - 525 tm试剂盒(OXIS国际,福斯特,CA);最终结果是表示为U /毫克蛋白;组织GPx活性测定[描述15]。GPx催化氧化的谷胱甘肽(GSH)的H₂O₂转换的反应加上烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH) (NADPH简化型)+(氧化型),和吸光度的变化在340 nm用于检测GPx活性。

2.5。免疫印迹分析NF -κB p65

收集新鲜的睾丸组织,然后在冰冷的组织蛋白质提取试剂均质,含有1%蛋白酶和磷酸酶抑制剂的1%。在10000 g离心5分钟后在4°C,上层清液的收集。上层清液中蛋白质浓度测定bicinchoninic酸蛋白质分析工具包(武汉博士德,中国)。免疫印迹分析在重复进行描述(16]。Anti-NF-kappa B p65抗体购自Abcam(马、美国)。蛋白质乐队与GAPDH规范化和屁股都是量化与软件数量(生物Rad)之一。

2.6。评估在睾丸细胞凋亡

凋亡活动石蜡的睾丸被TUNEL方法分析与商业工具(武汉博士德,中国)。TUNEL-positive核每小管的数量统计。凋亡细胞被发现了一个棕色的细胞核染色。大约200细胞计数字段;五个字段检查每张幻灯片。凋亡指数(AI)计算如下:AI =(凋亡细胞的数量/计算细胞的总数)×100%。Caspase-3激活凋亡细胞的内在和外在(死亡配体)通过线粒体途径。我们也测量了caspase-3蛋白酶活动使用caspase-3比色测定设备根据制造商的指示(武汉博士德,中国)。简单地说,睾丸组织匀浆的离心机在10000 g, 1分钟和100年μ克蛋白质孵化反应缓冲和Asp-Glu-Val-Asp-p-nitroanilide 90分钟37°C。吸光度测量在405 nm caspase-3活动。

2.7。形态学评价

睾丸组织形态学评价收集。内的标本在10%福尔马林固定,石蜡,切成段4微米厚,苏木精和伊红染色())。病理学家盲目地评估了睾丸组织光显微镜下以随机的顺序。睾丸损伤和精子发生和约翰森分级评分(17]。所有的管状部分在每个观察睾丸组织的评估系统并给出每一个分数从1到10。完整的精子发生与许多精子评估分数10。此外,电子显微镜也进行了。简单地说,睾丸组织固定在2.5%戊二醛在4°C 24小时然后洗在磷酸盐,嵌入在环氧树脂,沉浸在Epon812。部分收集与LKB-V切片机(BROMMA、瑞典)沾醋酸铀和叶酸铅和捕获用透射电子显微镜(h - 600、日立、日本)。

2.8。统计分析

数据表示为平均数±标准差。处理的数据统计分析软件SPSS 16.0版(SPSS Inc .,芝加哥,IL)。比较几种方法进行使用单向和重复测量双向方差分析其次是Tukey-Kramer测试识别组之间的显著差异。所有双尾和一个值值小于0.05被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。细胞因子的变化,MDA, SOD、GPx睾丸

细胞因子的变化,总结了MDA, SOD、GPx数据1和2。虚假的组相比,水平的促炎细胞因子(TNF - - 2α)和MDA显著增加在睾丸扭转后睾丸,而SOD、GPx的水平降低(分别地。)。治疗与LXA4恢复这些参数到基底的水平。扭力和扭力/反扭转组相比,MDA和和TNF - - 2αLXA4-pretreated组水平明显下降(分别地。)。此外,抗炎细胞因子(il - 4和il - 10)、SOD、GPx水平显著增加LXA4-pretreated组比扭转和扭力/反扭转组(分别地。)。

3.2。NF -κ在睾丸B p65表达式

免疫印迹分析表明NF -κB p65表达水平提高后睾丸扭转。然而,NF -κB p65表达式被LXA4抑制治疗。见图3NF -κB p65表达式LXA4-treated组显著低于扭转和扭力/反扭转组(分别地。)。

3.3。分析在睾丸细胞凋亡

细胞凋亡是由TUNEL方法的分析和caspase-3活动。TUNEL染色部分被显示在图4。TUNEL阳性凋亡细胞的比例和AI表示。LXA4-pretreated组的AI值显著低于扭转和扭力/反扭转组(分别地。、表1)。此外,扭转和扭力/反扭转组相比,在睾丸caspase-3活动显著减少LXA4-pretreated组(分别地。、表1)。

3.4。睾丸的形态学评价

光学显微镜的结果为每个组在图所示5。正常睾丸结构和均匀细精管的存在形态的虚假的组。扭力和T / D组,有显著减少细精管直径和小管严重失真。政府LXA4保存完好的细精管状形态在睾丸扭转/反扭转。此外,组织学分数明显高于LXA4-treated组相比,扭转和扭力/反扭转组(分别地。、表1)。与退化嵴线粒体肿胀,细胞间隙扩大电子显微镜下观察扭转和T / D组。然而,LXA4预处理是有效预防线粒体变性和细胞内空间的扩张(图6)。

4所示。讨论

在这项研究中,我们使用了一个鼠睾丸扭转模型调查lipoxin A4的保护作用于睾丸缺血/再灌注损伤。各种参数如MDA、SOD、GPx促炎细胞因子,抗炎细胞因子和NF -κ已发现。睾丸切除术后形态学评价也一直在进行。我们的研究结果表明,lipoxin A4显著降低炎症反应、氧化应激、组织学损伤睾丸后睾丸扭转。

睾丸紧随其后的缺血再灌注在睾丸扭转是主要的病理生理活动(TT) [18]。因此,TT通常可以被认为是一个睾丸缺血/再灌注损伤(IRI)。大量研究集中在治疗后IRI睾丸扭转和反扭转带来有益的影响在动物模型14,19,20.]。lipoxins的保护作用与IRI已在很多器官,包括大脑,心脏,肾脏,胃(10- - - - - -13]。在这项研究中,LXA4还显示其在睾丸IRI的保护作用由于其调制的氧化应激和炎症的能力。

IRI的overgeneration睾丸与活性氧(ROS)和哺乳动物睾丸非常容易受到氧化应激(19,20.]。MDA作为氧化应激的指标得到了广泛的应用在许多physiopathological事件包括IRI (21]。许多研究证明,睾丸组织MDA水平提高后睾丸扭转(22]。此外,抗氧化剂的能力包括SOD、GPx防止IRI睾丸后睾丸扭转(已被调查23,24]。在这项研究中,治疗LXA4减毒的氧化应激损伤睾丸通过减少MDA的表达,提高SOD、GPx的表达。这些结果表明,在睾丸反扭转LXA4可能产生抗氧化效果。

炎症已经建立贡献大幅IRI的发病机理。肿瘤坏死因子等促炎细胞因子-α(肿瘤坏死因子-α)和interleukin-1β(il - 1βIRI)增加睾丸扭转后(16]。LXA4被认为是炎症的“信号”,和为LXA4抗炎作用分子是定义良好的25]。在这项研究中,老鼠LXA4-treated显示低促炎细胞因子水平相比扭力/反扭转组。我们的结果也表明NF -的表达κB在受损的睾丸已经下调LXA4预处理。核转录因子κB (NF -κB)是一个主要的监管机构大量的细胞因子的基因表达和激活IRI的睾丸26提出了],LXA4直接刺激内源性抗炎因子的基因表达调节NF -κB激活(11]。建议的保护作用LXA4在随后睾丸扭转IRI是部分由于其抗炎作用。

实验研究表明,双边睾丸损伤和生育能力下降可能导致从单方面的扭力27]。建议的机制的损伤可能是由于睾丸扭转后的免疫反应。此外,动物实验表明,体液和细胞免疫介导睾丸细胞损伤的重要病理交替睾丸扭转(28]。一些最近的研究表明,lipoxins抑制抗原呈递细胞功能和调节cytokine-driven向Th2反应(免疫反应29日- - - - - -31日]。主要分泌2 Th1子集,干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α。相比之下,Th2细胞主要产生il - 4和il - 10。在这项研究中,我们观察到抗炎细胞因子il - 4和il - 10在LXA4-pretreated组显著增加,而和TNF - - 2α被降低了。这些发现表明LXA4变弱后的IRI睾丸扭转,也与调节Th1 / Th2平衡的能力。

5。结论

我们的研究结果表明,LXA4可能发挥抗炎效果,减少组织损伤大鼠睾丸扭转/反扭转由于其调节细胞因子的生产能力和NF -κB活动和导致MDA, SOD、GPx回到控制水平。因此,LXA4可能有保护作用与IRI受伤后睾丸扭转/反扭转通过调节细胞因子,氧化应激,NF -κB的活动。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者要感谢动物实验中心(武汉大学中南医院,武汉,中国援助的动物实验。作者也要感谢杨Gui-Fang博士的援助病理学分析。本研究支持的部分科技项目湖北省(没有的基础。2011 chb026)。