文摘

胞质磷脂酶A2 (cPLA₂)是病原反应酶启动生产各种炎症介质。之前的研究表明,抑制cPLA₂实验性自身免疫性脑脊髓炎发挥神经保护作用(运算单元)改善疾病的严重程度和影响Th1和Th17响应。然而,目前尚不清楚是否cPLA治疗₂抑制剂的调节性T细胞亚群)会影响发挥重要作用在维护免疫内稳态和防止自身免疫性疾病。在这项研究中,cPLA₂抑制剂AX059减少老鼠在刘易斯的发病和进展实验性自身免疫性脑脊髓炎。此外,这种效果是伴随着激活亚群,在各种细胞因子的表达变化。因此研究表明,亚由cPLA参与介导的免疫调节效应₂抑制。这些发现可能在治疗多发性硬化的临床应用。

1。介绍

多发性硬化(MS)是一种炎症,脱髓鞘疾病的中枢神经系统(CNS)影响着全世界超过250万名年轻人。我们的女士的发病机制的理解是基于使用动物模型研究,实验性自身免疫性脑脊髓炎(运算单元)1]。现在已有许多不同的实验性自身免疫性脑脊髓炎;例如,刘易斯老鼠可以开发后单相或慢性实验性自身免疫性脑脊髓炎注入髓磷脂碱性蛋白(MBP),这是一个稳定中枢神经系统自身免疫性疾病动物模型探讨机制(2,3]。

发病的机制女士以前认为是介导或实验性自身免疫性脑脊髓炎主要由Th1细胞和Th1-related细胞因子,启动一个致病反应针对中枢神经系统髓鞘的组件,导致炎症,髓鞘脱失,轴突损伤,功能,最终,赤字(4]。然而,许多最近的报告表明,异常的调节性T细胞亚群)和参与自身免疫性脱髓鞘的病理机制实验性自身免疫性脑脊髓炎(女士5,6]。亚是一个族群的CD4 + T细胞免疫自我耐受性的获取和维护的核心,以及宽容的组织移植和预防自身免疫性疾病(7]。CD25已被确定为一个亚群表型标记,和forkhead /翼螺旋转录因子forkhead盒P3 (Foxp3)是其特定的转录因子。女士,患者亚群的功能缺陷被发现(8]。在运算单元,亚群管理严重老鼠也可以显著降低实验性自身免疫性脑脊髓炎(9,10),并已被证明能够积累在复苏期间中枢神经系统(11]。

除了autoreactive T细胞和炎症细胞因子,其他各种炎症介质,招募和调节免疫细胞扮演主要角色在这些疾病的发病机制。磷脂酶A2 (PLA₂)是一个异质群体的专门的酶水解脂肪酸sn-2细胞膜磷脂的位置,产生类花生酸,导致炎症的各个方面通过环氧合酶(COX)和脂氧合酶途径12,13]。在各种解放军₂酶,胞质PLA2 (cPLA₂与酶活性)是主要的同种型,cPLA₂在花生四烯酸级联(中扮演重要角色14]。先前的研究已经表明cPLA₂发展和参与实验性自身免疫性脑脊髓炎cPLA的抑制₂可能是有价值的,预防实验性自身免疫性脑脊髓炎这表明cPLA吗₂抑制剂可能是潜在有用的免疫调制剂治疗[女士15,16]。此外,模型小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的一项研究表明cPLA的参与₂与发病机理的实验性自身免疫性脑脊髓炎Th17-type反应(17]。然而,没有描述cPLA的相关报道₂介导的神经炎症和神经退行性变的亚群。

在目前的研究中,我们首次研究了cPLA的效果₂通过使用一个在大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎选择性cPLA₂抑制剂。我们的发现表明阻塞cPLA₂可以减少发病和进展情况。此外,我们发现当cPLA亚群及其监管细胞因子改变₂被阻塞。在大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎

2。材料和方法

2.1。动物

女性刘易斯老鼠(8周)体重约160 - 170克河从北京获得至关重要的实验动物有限公司(中国,北京)。所有的老鼠都养在特定无菌和温度条件。所有这些动物体内实验依法进行动物实验伦理委员会,哈尔滨医科大学。

2.2。运算单元感应

运算单元是诱导如前所述18]。简单地说,老鼠免疫25μ克髓磷脂碱性蛋白MBP(σ)乳化完全弗氏佐剂(CFA)含5毫克/毫升分枝杆菌butyricum(σ)。这个解决方案(100μL)皮下注入动物的后肢的拦路贼。老鼠注射车辆被用作控制的解决方案。老鼠评估每天减肥和得分为神经损伤如下:0 =没有迹象;1 =失去尾巴末梢的强壮;2 =全损尾巴强壮;3 =后肢无力(部分瘫痪);4 =完成后肢瘫痪和尿失禁;5 =死。

2.3。药物治疗

老鼠被随机分配到治疗或对照组和治疗2-oxoamide cPLA₂抑制剂AX059(腹腔内注射200μL 4更易/ L的解决方案)或车辆(PBS包含1%二甲亚砜)管理每日2周后,开始免疫诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎的日子。AX059的合成是依照斯蒂芬斯的方法等。19)和Barbayianni et al。20.]。监控进行盲法的基础上,这样的人做的得分不知道动物被分配到实验组。

2.4。组织学分析

老鼠深深吸入麻醉5%二氧化碳在14天。安乐死和血液撤军后,大脑和脊髓样本切割和固定在4%多聚甲醛在石蜡包埋。选择面板串行部分(4 - 5μ米)处理常规苏木精和伊红染色()),Luxol快蓝染色、免疫组织化学标记与anti-Foxp3用尼康显微镜分析。包含至少20炎性病灶细胞的数量在每个H&E-stained部分数盲评,相同的病理学家。

2.5。流式细胞术分析

亚群的患病率,分析细胞表面标记进行评估通过流式细胞术使用以下抗体:异硫氰酸荧光素(FITC)共轭CD4和藻红蛋白(PE)共轭CD25(所有从BD生物科学Pharmingen购买,圣地亚哥,CA)。淋巴细胞被洗冷磷酸盐(PBS)和resuspended PBS的进一步100毫升。细胞被染色了20分钟在4°C和FITC-CD4 PE-CD25抗体。染色是可视化的流式细胞仪石中剑流式细胞分析仪(BD,富兰克林湖,新泽西,美国)与细胞的追求(版本3.2.1f1, BD)。

2.6。评价细胞因子的生产

评估细胞因子的生产,脾脏被隔绝在每个治疗组大鼠。单核细胞悬浮液制备和2×10⁶在完整的RPMI培养基培养细胞和起始MBP。然后细胞治疗AX059 (30μmol / L)或车辆60小时。上层清液经体外培养进行了分析白细胞介素- 6 (il - 6)、白细胞介素- 10”(il - 10)和转化生长因子-(TGF -)根据制造商的协议(BD生物科学)。流式细胞仪实验,淋巴细胞。

2.7。统计分析

数据表示为±标准差,和统计神经障碍的严重程度的差异,炎症病灶,Foxp3表达,流式细胞仪数据,各个组之间和细胞因子的生产是由方差分析(方差分析)和Mann-Whitney rank-sum测试。使用SPSS统计分析为Windows(美国芝加哥11.0版本,SPSS Inc .)。一个被认为具有统计显著性值小于0.05。

3所示。结果

3.1。cPLA效果₂在严重的抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎刘易斯老鼠

调查cPLA的效果₂抑制剂AX059运算单元的发展,刘易斯老鼠与AX059单独治疗和车辆。老鼠接受AX059诱导抗实验性自身免疫性脑脊髓炎;4的12大鼠相比,都在这群发达实验性自身免疫性脑脊髓炎12老鼠处理车辆。此外,平均最大的神经功能缺损评分显著降低与车辆治疗组相比,峰值的神经损伤发生两天后,剩下的神经损伤时间短,表明cPLA抑制₂延迟和加速其恢复的实验性自身免疫性脑脊髓炎(图1)。

进一步评估在中枢神经系统炎症,病变)染色法显示的动物的脑部和脊髓与神经损伤分数一致。软脑膜血管周围炎症细胞渗透,白质和生成几个焦点的炎症病变严重程度之间的相关关系运算单元。在脊髓病变比大脑中更为明显。

髓鞘脱失也评估Luxol快速脊髓的蓝色部分。虽然明显脱髓鞘白质内观察到在vehicle-treated老鼠,只有最小的变化被观察到AX059-treated老鼠(图2)。显微镜检查发现有和局部病变AX059-treated老鼠的脑部和脊髓,分别,而和与车辆分别在小白鼠身上。焦在AX059-treated病变大鼠的数量显著低于vehicle-treated老鼠(图3)。

3.2。cPLA效果₂抑制在亚

分析cPLA的效果₂抑制剂治疗亚群,单核细胞分离大鼠的脾脏2治疗组在14天,和CD4和CD25表达水平细胞的表面通过流式细胞仪测定。与vehicle-treated组大鼠相比,AX059-treated鼠明显增加亚群,和亚群的百分比的差异(%与%)2组之间(图4)达到统计学意义()。

进一步研究功能性病变亚群的变化,包括脑和脊髓,我们使用了一个采用的方法来评估Foxp3的表达,这是至关重要的监管功能亚群,也是一个独特的识别标记。如图2,亚群坐落在白色和灰色的大脑和脊髓,并出现在大量的老鼠比vehicle-treated AX059对待老鼠(数字2 (d)和2 (h))。几乎没有浸润T细胞和髓鞘和轴突损伤最小的亚群归航的位置。

3.3。cPLA效果₂抑制细胞因子表达的亚群

探索机制cPLA的效果₂抑制亚群,我们分析了3细胞因子,包括TGF -、il - 10、il - 6,与亚群的功能密切相关。免疫抑制细胞因子TGF -作为和il - 10在AX059-treated增加大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎与vehicle-treated老鼠。相反,一个引人注目的减少在典型的炎症细胞因子il - 6(图5)。这些发现表明AX059诱导激活和亚群扩散干扰病理性免疫反应。数据显示,这三个细胞因子的变化发挥关键作用的感应AX059随后亚群的减少炎症细胞的浸润和AX059提供的神经保护。

4所示。讨论

作为键酯酶参与的合成许多炎症介质,cPLA₂在自身免疫发挥着广泛的作用,氧化应激在神经系统疾病(21]。最近的研究表明,cPLA₂作为一个中央中介和发展,女士的实验性自身免疫性脑脊髓炎的潜在机制不仅包括启动炎症效应物和趋化因子的分泌,也促进免疫细胞浸润,脱髓鞘和轴突的损失(22,23]。cPLA₂有缺陷的老鼠,已知抗实验性自身免疫性脑脊髓炎和cPLA的抑制₂发挥抗炎作用,小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎推迟或减少疾病的发病和进展(24]。因此,cPLA₂女士被认为是重要的发病机制,并封锁的酶可能在减少其进展有疗效。

老鼠菌株不同于小鼠对疾病的敏感性,这给了我们另一个洞察人类女士在目前的研究中,我们表明,cPLA₂抑制剂AX059起到了保护作用在刘易斯模型大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎,降低发病率,延缓神经损伤的峰值,减少情况的严重性。此外,治疗AX059诱导激活亚群和增强他们的数量。因此我们的研究结果表明,亚群参与cPLA的抗炎效果₂抑制模型鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎。

先前的研究已经表明,cPLA₂有一个重要的角色在T细胞分化的调节运算单元开发和阻塞cPLA吗₂抑制剂或通过基因敲除防止炎症细胞生产(17,25,26]。cPLA Marusic等人报道_2α^−−/老鼠发展受损Th1-type反应(24),而另一项研究表明cPLA的封锁₂导致减少Th1-type Th17-type细胞因子,以及显著的减少在干扰素(IFN)肿瘤坏死因子(TNF)和IL-17浓度(17]。Taketomi等人还显示,cPLA₂导致过敏反应(肥大细胞的成熟27]。基于这些发现和cPLA的事实₂抑制密切相关的多种发病机制方面的实验性自身免疫性脑脊髓炎和各种类型的T细胞反应在目前的研究中,值得cPLA决定治疗₂抑制剂会改变的丰度和功能亚群,是淋巴细胞增殖和分化的主要监管机构。

在我们的研究中,观察亚群的比例的增加与AX059刘易斯治疗后大鼠与实验性自身免疫性脑脊髓炎与老鼠相比处理车辆使用流式细胞仪。进一步评估是否亚群表现出一种免疫抑制效应,我们评估Foxp3的表达,特定转录因子发挥免疫抑制功能。大脑和脊髓病变被亚群的数量明显高于渗透AX059-treated老鼠与vehicle-treated老鼠相比,并激活treg cPLA诱导的抑制₂。据我们所知,这是第一次研究证明一个亚群和cPLA之间的联系₂抑制。同意我们的发现,治疗改善已发现的实验性自身免疫性脑脊髓炎增强亚群的发展在复苏模型小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(28- - - - - -30.]。此外,一些免疫调节疗法批准女士如糖皮质激素、干扰素-已发现,glatiramer醋酸亚群有显著影响(16,31日- - - - - -33]。因此,我们的研究结果可能有临床应用治疗MS。

的开发和维护亚群的抗炎作用是由一些细胞因子,包括TGF -、il - 6和il - 10 (34]。亚群的发展与增强TGF -表达和降低il - 6水平。除了亚群的诱导分化和发展,TGF -也可以延长半衰期Foxp3 RNA物种和使磷酸化chromatin-bound Foxp3 [35),il - 6起着至关重要的作用在调节Treg细胞之间的平衡和Th17细胞,参与了发病机理和女士的实验性自身免疫性脑脊髓炎36,37]。与此同时,il - 6可以摧毁Treg细胞在炎症条件下的免疫抑制功能(38,39]。井等人报道,il - 10被要求保持Treg-suppressive功能和维护Foxp3的表达转录因子(40]。最近,克洛泽报道,il - 10的生产(NSP传导神经干细胞/祖细胞),改善临床疾病的实验性自身免疫性脑脊髓炎和NSP的治疗机制抑制和干扰素- - 2生产和没有诱导更高比例的自il - 10在NSPC生产而不是淋巴细胞亚群(41]。另一方面,以前的研究已经表明cPLA调节细胞因子的生产,和cPLA封锁₂导致抑制Th1-type和Th17-type细胞因子(15,17]。因此,可想而知,cPLA₂抑制作用可能通过调节细胞因子的表达发挥核心作用的亚群。为了验证这个假设,我们分析了TGF -的表达、il - 6和il - 10。当细胞暴露于AX059, TGF -积极的调节效应和il - 10亚群分化增加。相比之下,il - 6的负调节效应显著降低。先前的研究已经显示,而cPLA₂抑制损害Th1-type和Th17-type诱导细胞因子,没有报告提到,这也使得贡献增加Tregs-related细胞因子的生产。

总之,我们的研究在老鼠模型中证明cPLA₂可能参与运算单元的发病和进展,cPLA吗₂抑制剂治疗在减少疾病严重程度可能提供有益的调节亚群和介质的影响等各种细胞因子和其他T细胞。因此,选择性cPLA的发展₂抑制剂可以提供希望人类中枢神经系统自身免疫性疾病的治疗。

利益冲突

作者没有利益冲突披露。

作者的贡献

金府,Wei-Zhi Wang和丹杨本研究设计的。红飞丹•杨,马于燕,Xiang-nan黄进行了组织学实验,流式细胞术和细胞因子分析。Xue-Mei张,玲玲和回族悦做了动物实验。丹杨进行数据分析和起草。傅Wei-Zhi王、金研究构思和编辑。所有作者阅读和批准了期末论文。所有作者批判了纸和批准提交的最终版本。

确认

这项工作得到了中国自然科学基金(81171120 / H0907, 81171120 / H0907)和黑龙江省自然科学基金(D201108)。