文摘

从肠粘膜细胞可溶性因素导致肠道免疫内稳态。我们已经建立了一个在体外模型探讨可溶性的监管作用因素发炎的肠道粘膜的胶原性结肠炎(CC)患者T细胞的分化。外周血CD4⁺从健康的捐赠者是多克隆激活T细胞条件培养液的存在(CM)产生剥蚀活检(DNB)或孤立的固有层单核细胞(LPMCs)从CC粘膜活检患者noninflamed控制相比,确定参与T细胞分化增殖和细胞因子的分泌。控制相比,我们观察到显著增加促炎细胞因子的生产干扰素-γIL-17A, il - 6和il - 1β和抗炎细胞因子il - 4和il - 10在CC-DNB-CM的存在。CC-LPMC-CM对外围CD4的影响最明显⁺T细胞是一个趋势增加产量IL-17A和il - 10。减少抑制t细胞增殖的趋势是在CC-DNB-CM的存在。总之,我们的在体外模型揭示了影响可溶性因子从CC结肠粘膜周边T细胞,提高其生产支持和抗炎细胞因子。

1。介绍

人类胃肠道粘膜构成人体最大的粘膜表面连接的外部环境。互补的网络监管不同类型的免疫之间的相互作用和多发地细胞保持肠道粘膜内稳态。这些监管的相互作用发生在一个复杂的蛋白质混合物,被称为细胞外基质(ECM)或基质1,2],与细胞因子和生长因子等可溶性介质间充质细胞,免疫细胞,上皮细胞调节细胞的激活和分化2]。间充质细胞积极参与肠道炎症过程并可使慢性肠道炎症性疾病如炎症性肠病(IBD) (3- - - - - -5]。转化生长因子- (TGF -)β是一个潜在的可溶性介质在肠道内稳态机制会使效应t细胞反应粘膜通过减少核扩散和干扰素-γ(IFN -γ)生产4,6]。然而,TGF -β与il - 6和il - 1β粘膜发炎引起的促炎Th17细胞,这表明一个天生的肠道粘膜微环境的监管功能(4,7,8]。

研究正在进行阐明溶性因素的作用和ECM在IBD免疫病理机制4),但没有这样的研究到目前为止进行微观结肠炎(MC)炎症是微妙的地方。MC由两个实体、胶原性结肠炎(CC)和淋巴细胞性结肠炎(LC)。两种情况下的特点是慢性nonbloody水样腹泻,常伴有腹痛和减肥9- - - - - -11]。结肠粘膜正常或宏观上几乎正常和粘膜活检的诊断依赖于微观评估。CC提出增加淋巴细胞的密度和增厚牙龈胶原乐队(≥10μ米)毗邻基底膜。CC的病理生理数据仍然有限,但它是假定至少部分干扰免疫反应造成的各种腔的抗原,如药物、谷蛋白,或传染性病原体,倾向的个体9]。非甾体类抗炎药(非甾体抗炎药),质子泵抑制剂,阿司匹林,和选择性5 -羟色胺再摄取抑制剂与CC (12]。然而在大多数病人,没有找到诱发因素。myofibroblast特异表达功能也被牵连的胶原蛋白沉积CC患者(10,13]。最近,我们报道了当地增加CD4的激活⁺和CD8⁺T细胞在固有层和上皮的CC病人,证明是CD45RO和增殖标记Ki67的表达增加,使用流仪分析刚从结肠活检分离出淋巴细胞(14]。此外,粘膜转录水平的干扰素-γ、il - 12、il - 1β、il - 6、IL-17A IL-21、il - 22生成和IL-23增强粘膜发炎的CC患者与正常粘膜相比,与il - 6蛋白水平升高,IL-21,肿瘤坏死因子(15]。

尽管上述研究结果表明,粘膜微环境参与CC免疫病理反应,这些因素之间的相互作用和局部粘膜的炎性活动CC患者T细胞尚未阐明。因此我们研究溶性因素的作用肠道粘膜的CC患者T细胞的规定使用小说在体外模型系统,目的是模仿在活的有机体内接触新招募的外周血T细胞的可溶性因子结肠发炎CC和正常粘膜的环境。

2。材料和方法

2.1。病人

CC诊断证实了临床症状:≥3拉肚子/日和/或腹痛和宏观上正常结肠黏膜组织病理学特征发现:增加数量的淋巴细胞的上皮和固有层沉积≥10μ米厚的牙龈胶原蛋白层(9]。入选标准是病人先前与CC与临床和组织病理学诊断活动性结核病。肠道感染,患者缺血性结肠炎、结肠癌症,或以前的克罗恩病和溃疡性结肠炎的历史被排除在外。没有一个病人服用免疫抑制药物或抗生素。

我们从7 CC调查结肠活检患者(女;)和20 noninflamed控制(女性;没有腹泻症状,接受结肠镜检查的患者招募消化道出血或异常的放射性的发现。所有控件正常结肠镜检查和组织学。

十二个活检肝曲从每个个体获得使用标准的活检钳,放置在磷酸缓冲盐(PBS),并在1小时内处理。结肠镜检查是执行部门的胃肠病学,据英国大学医院,瑞典,2012年11月至2013年11月。

从健康献血者外周血(对CD4)在肝素管收集⁺淋巴细胞隔离如下所述。

这项研究是区域Orebro-Uppsala伦理委员会批准的县,瑞典(ID。2008/278;081015)。所有的病人在这个研究提供了书面知情同意。

2.2。从结肠黏膜条件培养基的制备

我们研究了两种不同制剂的粘膜的影响:一个上皮和上皮内细胞酶学,裸露的活检(DNB),和一个使用胶原酶消化后的固有层上皮细胞的清除。DNB分离单核细胞培养过夜,而后者被称为固有层单核细胞(LPMCs)。DNB分数包含胶原蛋白和间充质细胞,成纤维细胞和白细胞。DNB细胞群完好无损的分数,而固有层单核细胞(LPMCs)分数是由自由的白细胞数量以及组织、胶原蛋白、细胞碎片。

十二个活检与PBS彻底清洗和孵化prewarmed汉克的平衡盐溶液(hbs)(西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州,美国)包含1毫米EDTA、20毫米玫瑰,和5%热灭活胎牛血清(的边后卫)37°C,不断搅拌4次(15分钟),去除上皮细胞层。六剥蚀活检是保存在无血清rpmi - 1640包含20毫米玫瑰,100μ10 g / mL链霉素,μg / mL庆大霉素和100 U /毫升青霉素(以下称为培养基)在冰上直到进一步使用,剩下的六个活检进一步消化与胶原酶类型八世我DNAse IV型(西格玛奥德里奇)1 - 1.5小时消化的胶原蛋白。孤立的固有层单核细胞在PBS和resuspended培养基洗两次。dnb和LPMCs培养在培养基在一夜之间在37°C下5%的股份有限公司₂-95%的空气,产生条件培养液(CM)。CM DNB和LPMC分数CC病人和noninflamed控制,分别汇集。内毒素水平量化使用皮尔斯LAL生色内毒素定量工具(美国皮尔斯,罗克福德,IL)根据制造商的协议。最大的内毒素水平DNB-CM和LPMC-CM 4欧盟/欧盟/毫升和4.2毫升,分别。总蛋白浓度测定使用Bio-Rad直流蛋白质分析工具包(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。DNB-CM曾在250和62.5的总蛋白浓度μ使用g / mL,而LPMC-CM 125总蛋白浓度和62.5μg / mL,各自的最高浓度的媒体。厘米肠粘膜的noninflamed控制被称为Ctrl-DNB-CM Ctrl-LPMC-CM,而厘米源自CC病人被称为CC-DNB-CM和CC-LPMC-CM。

2.3。t细胞增殖和细胞因子释放化验

CD4⁺外周血淋巴细胞与健康使用人类CD4捐助者⁺t细胞浓缩鸡尾酒工具包(干细胞技术,法国格勒诺布尔)根据制造商的协议。细胞生存能力~ 95%,由台盼蓝排斥。CD4细胞的纯度⁺T细胞是90 - 95%取决于流仪分析(贝克曼库尔特,史诗是富勒顿、钙、美国)。

纯化CD4⁺96年培养人外周血,平底试验板(Sarstedt、牛顿、数控、美国)预镀与50μL (5μg / mL anti-CD3 (UCHT1 BD生物科学,圣地亚哥,美国)2小时在37°C,紧随其后的是两个与PBS洗。

1×10⁵CD4⁺T细胞被添加到一起洗井1μg / mL可溶性anti-CD28 (BD生物科学)和在培养基培养的2毫米AB血清谷酰胺和5%,有或没有DNB-CM或LPMC-CM noninflamed控制或在总量为200 CC的病人μl .控件,Ctrl / CC-DNB-CM和Ctrl / CC-LPMC-CM没有CD4细胞被培养⁺T细胞和CD4细胞⁺T细胞单独培养没有anti-CD3 / anti-CD28。此外,控制井只含有培养基包括在内。重复的井的试验进行了细胞因子分析和扩散试验井一式三份。细胞培养在37°C下5%的股份有限公司₂-95%空气三天;此后,上层的收获和储存在−80°C到细胞因子含量测定,并使用CellTiter 96 t细胞增殖测定水一个解细胞增殖试验(3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 5 - (3-carboxymethoxyphenyl) 2 - (4-sulfophenyl) 2 h-tetrazolium Promega,麦迪逊,WI,美国)。40毫升的水一个解试剂添加到每个在37°C和孵化4小时湿润,5%的股份有限公司₂吸光度的孵化器跟着录音490海里。

2.4。细胞因子分析

CC粘膜发炎的合并条件培养基从边缘CD4和控制以及上层清液⁺分析了T细胞对il - 1β、il - 4、il - 6、il - 10 IL-17A,干扰素-γ,并使用xMAP技术由Luminex TNF(美国奥斯汀,得克萨斯州),使用两个Milliplex地图包(猫。HCYTOMAG-60K数量和猫。hcyp2mag - 62 k),根据制造商的说明(微孔、马、美国)。重复进行了化验,不同细胞因子的水平表示为pg / mL,根据标准曲线与已知数量的每个分析物(微孔)。

TGF -βELISA测定水平,根据制造商的说明(BD生物科学、圣地亚哥、钙、美国)。

细胞因子含量计算如下:细胞因子大量释放的外周T细胞孵化与CM -细胞因子数量仅在厘米。对于每个献血者,CD4细胞因子大量释放⁺T细胞孵化与CM CC患者相比,CD4细胞因子大量释放⁺T细胞孵化与CM的控制。

2.5。统计分析

获得的数据不是正态分布,Wilcoxon符号秩nonparametrical测试被用于统计对比组。时被认为是具有统计学意义的差异。

3所示。结果

3.1。一个在体外模型来研究粘膜的影响环境周边T细胞:赞成和抗炎细胞因子的生产增加了CD4多克隆激活⁺T淋巴细胞的可溶性因子CC粘膜

模仿在体外外周T淋巴细胞的接触,新来的结肠粘膜和确定当地的肠道环境影响T细胞激活和分化,我们研究了通过α-CD3 +α-CD28刺激CD4 T细胞细胞因子生产⁺外周血T细胞的可溶性因子的肠道粘膜。有显著增加促炎细胞因子的生产干扰素-γIL-17A, il - 6和il - 1β在厘米由剥蚀活检(DNB-CM)从文化生成胶原性结肠炎患者的结肠,相比从noninflamed DNB-CM控制(图1)。这是明显的检测IL-17A低蛋白质浓度的厘米,il - 6和il - 1β和更高浓度的CM检测干扰素-γ生产。

我们还指出一个显著增加生产的抗炎细胞因子il - 4和il - 10在DNB-CM CC患者noninflamed控制相比,蛋白质含量低的CM(图1)。

相比之下,没有指出TGF -显著差异β生产由外围CD4⁺CC患者T细胞在DNB-CM相比noninflamed控制(数据未显示)。

一般来说,LPMC-CM减少了对外围CD4细胞的影响⁺t细胞激活和分化。增加产量的趋势IL-17A和il - 10(两者都是)是指出在LPMC-CM CC患者相比noninflamed控制在较低的蛋白质浓度(图2)。其他细胞因子没有显著改变(图调查2)。

3.2。减少抑制CD4⁺外周t细胞增殖在媒体的存在条件从结肠粘膜CC的病人

我们下一个调查能力结肠粘膜的可溶性因子抑制t细胞增殖,曾被证实在体外(4,16,17]。一个倾向减少了外围CD4细胞的增殖抑制作用⁺T细胞是指出在厘米从文化活检(DNB-CM) ()发炎CC患者相比noninflamed控制(图3)。这是明显与总蛋白浓度的DNB-CM检测外周t细胞增殖。

相比之下,没有观察到不同的增殖抑制的存在从noninflamed LPMC-CM控制CC患者相比(图3)。

3.3。增强il - 1β和il - 6水平的条件培养基CC粘膜发炎

t细胞的分化和功能是由不同的细胞因子,我们未来分析8细胞因子在池条件培养基从DNB LPMC分数来自CC粘膜发炎而控制。我们发现超过两倍,8倍增加il - 6和il - 1的水平β分别从CC DNB-CM患者相比,控制,而没有发现改变干扰素-的水平γIL-17A, TNF、il - 4和il - 10(表1)或TGF -β(数据没有显示)。类似的趋势水平的il - 6和il - 1的增加β指出在LPMC-CM CC患者控制相比,尽管它是调查汇集从只有两厘米CC病人(数据未显示)。

4所示。讨论

我们在这里报告一本小说在体外溶性的影响因素分析模型结肠粘膜的CC患者外周T淋巴细胞激活和分化。我们发现,尽管微妙的胶原性结肠炎黏膜的炎症患者,在结肠镜检查,肉眼不可见的可溶性因子在粘膜足以显著提高干扰素的生产γ、IL-17A、il - 6、il - 1β外围CD4、il - 4和il - 10⁺T细胞暴露于他们在体外。这是第一个研究探讨溶性因素的作用肠道粘膜的CC病人的T细胞,这部小说系统反映的影响在活的有机体内接触新招募的外周血T细胞可溶性因子在结肠粘膜发炎的环境CC患者与正常粘膜相比。

厘米从剥蚀活检CC粘膜发炎引起的赞成和抗炎细胞因子的生产增加了周边T细胞。微观结肠炎是微妙的溃疡性结肠炎和克罗恩病相比,这可能表明,在CC结肠微环境促进生产的抗炎细胞因子平衡炎症反应。显然这是不足以阻止炎症。研究基质条件培养基的影响克罗恩氏患者粘膜细胞因子生产的T细胞表明增加干扰素-γ和IL-17生产但没有提供数据的影响抗炎细胞因子的生产(4]。

没有指出TGF -差异β生产由外围CD4⁺CC患者T细胞在厘米比控制。而TGF -β在正常黏膜可能会抑制t细胞功能,il - 6和il - 1的含量显著增加β在CC粘膜发炎可能促进促炎Th17细胞分化[7,18生产大量IL-17A]。CC患者的结肠环境也可能促进外围CD4细胞的分化⁺IL-17 /干扰素- T细胞γ双生产Th17 / Th1细胞已经提出调解肠道炎症过程(19- - - - - -21],确凿的发现IL-17A和干扰素,提高水平γ。

我们发现一个趋势抑制t细胞增殖减少了可溶性因子从剥蚀的结肠粘膜活检CC患者相比,控制。这是按照发现发怒等人在基质条件培养液来自克罗恩氏粘膜发炎(4]。年长的研究已经证明,粘膜微环境减少固有层淋巴细胞的增殖反应抗原受体刺激(17,22),但他们仍活跃在他们的帮手和溶细胞的功能(22,23]。本研究结合发怒等的研究。4]表明,这些影响是至少部分印在T淋巴细胞的当地环境,而不是一个内在特征。

从剥蚀厘米活检相比,固有层单核细胞- (LPMC)厘米CC患者并不影响t细胞增殖而LPMC-CM从控制。这些不同的影响尚不清楚这两种类型的厘米,需要执行进一步的实验来阐明CMs的成分的差异。

尽管我们观察到增强周边T细胞产生il - 10的CC患者存在厘米,已知抑制T细胞增殖和细胞因子的生产(24),我们发现减少外周T细胞增殖和促炎细胞因子的生产。这表明其他免疫调节分子合成的促炎细胞因子在胶原性结肠炎。

细胞因子的生产没有增加血清总蛋白浓度较高的厘米。一种解释可能是抑制和/或有毒的存在因素CM限制t细胞反应。此外,各种分子对其功能有不同的最佳浓度和高浓度可以限制他们的活动。为了进一步阐明这对CD4和解释观察到的差异⁺t细胞分化我们想调查一个更大的小组之间的细胞因子和比较蛋白质概要厘米从noninflamed CC病人,控制和DNB和LPMC之间通过蛋白质组学分数。

总之,我们已经建立了一个在体外溶性的影响因素分析模型结肠粘膜的CC患者外周T淋巴细胞活化和细胞因子的生产。尽管CC微妙的炎症,我们的数据证明显著改变通过外围CD4细胞因子生产⁺T细胞的mucosa-derived可溶性因子CC患者相比,控制。我们的一个未来的目标是测试在体外模型CD8的分化⁺T细胞,我们之前的报道增加了CC患者的结肠粘膜的数字。我们也要评估其使用在评估药物的影响,包括那些在当前的使用,在结肠粘膜内环境和淋巴细胞,从而促进决定最佳分子以及所需剂量抑制t细胞的炎症反应。

利益冲突

尼尔斯·Nyhlin为默沙东公司担任议长。约翰波尔福尔克博士担任发言人制药,默沙东,AbbVie。Curt Tysk担任议长福克博士制药,Tillotts制药,显示出,默沙东公司,阿斯利康。

作者的贡献

Ashok Kumar Kumawat参与创建的研究设计和实施研究,数据分析,论文的起草。Olof Hultgren参与数据分析。安娜,Nils Nyhlin Wickbom、约翰·波尔和Curt Tysk病人参与招聘和活检集合进行结肠镜检查。伊丽莎白Hultgren-Hornquist负责研究设计,协调,和数据分析。Ashok Kumar Kumawat Elisabeth Hultgren-Hornquist Olof Hultgren, Curt Tysk参与论文的终结。所有作者阅读和批准了期末论文。

确认

本研究支持由瑞典社会医学(Bengt您基金会,资助SLS-176271/2011和98031/2010),Nyckelfonden勒布鲁大学医院,据英国大学医院研究基金会,Lars Hierta基础。作者非常感激护理人员和部门的肠胃科胃肠病学,据英国大学医院,为他们出色的支持在收集粘膜活检。他们也感谢教授保罗·威廉乏味的技术指导。