文摘

丝氨酸蛋白酶抑制剂据说减毒气道炎症和抗氧化剂在multiorgan。然而,丝氨酸蛋白酶抑制剂的影响nafamostat甲磺酸盐(砰的一声),gabexate甲磺酸盐(FOY)和乌司他丁(UTI)长期挑战慢性哮喘小鼠模型尚不清楚。BALB / c小鼠(6小鼠/组)气管内的接种5剂Dermatophagoides pteronyssinus(Der p;50μL, 1毫克/毫升)每隔一周。治疗剂量的砰的一声(0.0625毫克/公斤),FOY(20毫克/公斤),或泌尿道感染(10000 U /公斤),分别腹腔内注入这些老鼠。控制老鼠收到无菌PBS。最后的挑战在3天后,老鼠牺牲评估(AHR)气道高反应,装修,和炎症;肺组织学特性;和细胞因子表达谱。与未经处理的控制相比,老鼠接受砰的一声,FOY,泌尿道感染和气道高反应性降低,杯状细胞增生,减少嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞浸润,减少Der p-induced血清中il - 4水平和IL-5, il - 6, IL-13,支气管肺泡灌洗液和IL-17水平,抑制核转录因子(NF)κ肺组织的活动。丝氨酸蛋白酶抑制剂砰的一声,FOY和泌尿道感染有可能被下调Th2细胞因子治疗哮喘的疗效和Th17细胞功能,抑制NF -κB激活的肺部组织。

1。介绍

哮喘是一种常见的气道慢性炎症性疾病,特点是间歇性的呼吸急促,气道代答,气喘,咳嗽对过敏原的反应。哮喘慢性炎症的特点是嗜酸性招聘、气道高反应性(AHR),杯状细胞增生/化生上皮肥大增生、粘液分泌过多,胶原蛋白沉积,平滑肌细胞肥大和增生,牙龈纤维化(1,2]。

激活肺上皮细胞利用ROS作为组件的细胞内的信号级联诱导随后的CD4 + T细胞激活(3]。CD4 + T细胞,包括Th1、Th2 Th17, Treg细胞,是活跃在不同阶段的支气管哮喘,和各种细胞的表达产品肺部炎症(扮演着不同的角色4]。细胞外的内源性蛋白酶和外源性蛋白酶在哮喘病理生理学也扮演重要角色。丝氨酸蛋白酶类胰蛋白酶,肥大细胞颗粒丰富,是一个强有力的protease-activated受体2(杆)激活剂5]。类胰蛋白酶促进人类肥大细胞脱粒,嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞迁移,放大组胺支气管收缩的影响肺组织,刺激气道成纤维细胞和平滑肌细胞生长6,7]。此外,许多高空过敏症与哮喘有关,和真菌的屋尘螨过敏原等外源蛋白酶。两个主要的尘螨抗原,Der p 3和Der 9日是丝氨酸蛋白酶,可以增加血管通透性和分离上皮细胞相互作用杆(8]。因此,目标蛋白水解活性与特定抑制剂可能会降低protease-induced炎症过程。

纯化人尿胰蛋白酶抑制剂(UTI)丝氨酸蛋白酶抑制剂,已被广泛用于急性炎性疾病患者如播散性血管内凝血(DIC)、休克、和胰腺炎9]。Gabexate甲磺酸(FOY)和nafamostat甲磺酸盐(6-amidino-2-naphthyl p-guanidinobenzoate dimethane磺酸盐;砰的一声)nonantigenic合成丝氨酸蛋白酶抑制剂,用于治疗胰腺炎和DIC和作为体外循环和血液透析抗凝血剂10,11]。在以前的报告使用急性哮喘小鼠模型,我们表明,砰的一声,FOY抑制antigen-induced气道嗜酸性粒细胞,IgE生产,il - 4和TNF -α水平和增强il - 12水平,关键Th1细胞因子,在支气管肺泡灌洗液(BALF);然而,泌尿道感染没有影响(12]。然而,Yasui等人报道,泌尿道感染可能是儿童哮喘恶化的生物标志物(13]。Ishizaki等人建议,砰的一声抑制气道嗜酸性炎症和气道上皮重建在卵白蛋白(OVA)小鼠过敏性哮喘模型(14]。然而,这些合成和纯化的免疫调节效应血清丝氨酸蛋白酶抑制剂在Der p-induced慢性哮喘模型仍然未知。

因此,我们调查的潜在疗效的丝氨酸蛋白酶抑制剂砰的一声,FOY,泌尿道感染过敏性气道炎症和气道重塑Der p-challenged慢性哮喘小鼠模型。

2。材料和方法

2.1。道德声明

动物实验按照原则的概述中国医科大学动物保健和使用委员会制度。本研究获得了批准的证词动物使用由中国医科大学(IACUC没有协议。101 - 97 - n)。老鼠被安置在microisolator笼子(实验室产品,Inc .)、梅伍德,新泽西,美国)和无菌水和食物喂食随意在特定病原体自由条件在中国医科大学动物设施。腹腔注射小鼠牺牲的甲苯噻嗪(200μg /鼠标)和氯胺酮(2毫克/鼠标)。

2.2。老鼠和试剂

特定的无菌,男,6至8-week-old BALB / c小鼠购买国家实验动物中心,中华民国。Der p提取(1 g冻干全身在乙醚提取;Allergon, Engelholm,瑞典)溶解在pyrogen-free等渗盐水,通过0.22毫米过滤器过滤,储存在−80°C,直到进一步的使用。LPS水平Der p准备被欧盟/毫克Der p < 0.96(鲎变形细胞溶解产物测试,E-Toxate;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)。砰的一声(Futhen;日本千叶鸟居制药有限公司),FOY(小野制药有限公司、日本大阪)和泌尿道感染(Mochida制药有限公司、日本东京),已被临床使用,在使用前被溶解在无菌PBS。

2.3。Der p挑战和支气管肺泡灌洗(BAL)

每个实验包括以下组(/组)和小鼠随机分配。接种BALB / c小鼠气管内的五个剂量的Der p(1毫克/毫升,50μL)每隔1周。小鼠腹腔内推荐(i.p)注射治疗剂量的砰的一声(0.0625毫克/公斤),FOY(20毫克/公斤),或者在气管内的泌尿道感染(10000 U /公斤)Der p挑战期。在平行实验中,天真的小鼠腹腔内(i.p)注射无菌PBS和PBS的挑战。老鼠最后挑战牺牲了3天后,先前报道(15]。气管被曝光和插管,然后落下帷幕了,有两个1毫升整除的盐水。总共1.8到1.9毫升的BALF一直恢复技术。BALF样本存储在−80°C,直到进一步的分析。微分细胞计数都是使用cytospin制剂(细胞/ 100μ刘L (BALF)沾污渍(生物科技、台湾)总白细胞计数后失明的方式。

2.4。侵入性测量气道阻力

当天实验中,小鼠体重与戊巴比妥钠麻醉(60毫克/公斤,i.p)。鼠标使用18 g tracheostomized金属套管。呼吸系统阻力(Rrs)和呼吸系统倒电容(Ers)是使用循环式人体体积描记仪测量的连接通过一个气管内插管flexiVent加拿大蒙特利尔系统(SCIREQ, Inc .)根据制造商的协议。小鼠有或没有蛋白酶抑制剂是顺序暴露增加剂量的喷雾在PBS醋甲胆碱:0,0.0625,0.125,0.25,0.5,1.0,2.0和4.0毫克/毫升(Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)。

2.5。肺组织组织学

石蜡包埋的肺部组织切成5μ米部分,沾染了周期性acid-Schiff (PAS)污渍。光学显微镜(400×放大)是用于组织学评估。杯状细胞增生的上皮衬里得分为杯状细胞在上皮细胞的比例(14]。尽量减少抽样误差,五点评分系统(0到4级)使用:年级0,没有杯状细胞;1级,< 25%的杯状细胞;2级,25 - 50%的杯状细胞;三年级,50 - 75%;4级,≥75%。

2.6。胶原蛋白分析

从每组肺组织(100毫克)的老鼠在液氮和机械均质提取2毫升的汉克的平衡盐溶液(哈佛商学院)。胶原蛋白与Sircol胶原蛋白量化分析工具(Biocolor、贝尔法斯特、英国)。

2.7。流式细胞术分析

单克隆抗体(mab)使用包括PE和/或FITC-conjugated anti-mouse CD4 (BD Pharmingen) FITC-conjugated anti-mouse CD8 (BD Pharmingen) Percp-conjugated anti-mouse CD3 (BD Pharmingen)和FITC-conjugated anti-mouse CD25。BALF细胞()沾在冰上30分钟的马伯,洗,量化使用FACScan (becton dickinson Immunocytometry系统,圣何塞,CA,美国)。

2.8。血清Der p-Specific IgG1和IgG2a / 2 b和总IgE

血清样本的总IgE缓冲区(1:2)和Der p-specific IgG1和IgG2a / 2 b在缓冲区(1:4)用于ELISA。简而言之,96 -孔板涂上Der p (2 g / mL 0.1 Na₂有限公司₃/ NaHCO₃,pH值8.3)。在4°C隔夜孵化后,盘子都洗了,然后复制血清样本添加2 h。洗后,生物素anti-mouse IgE抗体(2μg / mL;BD PharMingen)添加到井1 h,其次是洗涤和添加一个streptavidin-HRP共轭(1:1000;BD PharMingen)。盘子洗和发达的三甲microwell过氧化物酶底物(科克加德&佩里实验室,马里兰州)。吸光度是阅读在OD_450年。从曲线总IgE水平测定准备使用商业鼠标IgE标准。Der p-specific IgE, IgG1 IgG2a / 2 b被发现使用生物素anti-mouse IgE, IgG1和IgG2a / 2 b抗体(2μg / mL;BD PharMingen),结果表示为OD_450年值。

2.9。细胞因子ELISA

il - 4、IL-5、il - 6、il - 12和IL-17与ELISA测定Ready-SET-Go !圣地亚哥工具包(eBioscience CA)。IL-13和正γ测量使用ELISA DuoSet !工具包(研发系统,阿宾顿,英国)。化验都执行根据制造商的协议使用工具包提供的标准。

2.10。定量实时聚合酶链反应(qPCR)

肺组织的总RNA提取使用试剂盒试剂(生命表达载体技术)根据制造商的协议。总RNA样本reverse-transcribed cDNA使用高容量cDNA逆转录工具包(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。使用1 qPCR执行μL (cDNA,由于“快速上手”项目普遍SYBR绿色主设备(罗氏)。以下引物组被使用:β肌动蛋白,5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3′, 5′-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′;TGF -β1、5′-GCGGACTACTATGCTAAAGATGT-3′, 5′-GTTGTGTTGGTTGTAGAGGGGCA-3′;咆哮,5′-GTACATCACCATGGCGTATG-3′, 5′-TCTTCTCTGGGTTGGCACACA-3′;eotaxin 5′-CCATCTGTCTCCCTCCACCATG-3′, 5′-ATCCCACATCTCCTTTCATGCC-3′;GATA-3 5′-GAAGGCATCCAGACCCGAAAC-3′, 5′-ACCCATGGCGGTGACCATGC-3′;白介素5′-CTGGTGACAACCACGGCCTTCCCTA-3和5-ATGCTTAGGCATAACGCACTAGGTA-3′;IL-13 5′-CTGCAGTCCTGGCTCTCG-3′, 5′-CTTTTCCGCTATGGCCACTG-3′;IL-17 5′-AGATCTGGACGCGCAAACATGAG-3′, 5′-GGGTCGTCGACGGGTCTCTGTTTAG-3′。

2.11。核提取物和EMSA

核提取物是从肺组织准备根据制造商的指示(Panomics红木)。LightShift化学发光EMSA工具包(皮尔斯,罗克福德)是用于检测NF -κB的表达。

2.12。统计分析

结果表示为±标准差。学生的以及被用来比较两组之间的结果。一个< 0.05被认为是具有统计学意义的价值。

3所示。结果

3.1。蛋白酶抑制剂对小鼠气道阻力的影响

我们使用重复Der p挑战测试三种蛋白酶抑制剂的影响(砰的一声,FOY和不一致)每allergen-induced慢性气道炎症的小鼠模型。在去年过敏原挑战72 h后,所有组的老鼠受到乙酰甲胆碱激发试验。与挑战天真组相比,老鼠Der p-challenged组显著更高的Rrs和人的价值观。组织收到了蛋白酶抑制剂,Rrs和人值明显降低相对于那些Der p组剂量乙酰甲胆碱≥1.0毫克/毫升(图1)。

3.2。蛋白酶抑制剂对Der p-Induced气道炎症的影响

接种BALB / c小鼠气管内的五个剂量的Der p在PBS每隔1周和牺牲了72 h后最后的挑战。天真挑战组BALF中大多数细胞巨噬细胞(图2)。然而,细胞的总数,巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞是小鼠暴露于Der p明显高于天真的集团,并显著降低在砰的一声,FOY和泌尿道感染组比p组。

3.3。蛋白酶抑制剂减弱Der p-Induced肺部病理

哮喘气道的特征包括炎症、增生的杯状细胞、粘液分泌和胶原沉积。老鼠的肺组织学检查在72 h后抗原挑战(图3(一个))。相对于天真的集团组织从Der p-challenged小鼠肺组织部分表现出增加气道炎症,矩阵在牙龈地区沉积,增生的杯状细胞(图3 (b))。相比之下,丝氨酸蛋白酶抑制剂处理的小鼠显著减少气道炎症,减少PAS-positive细胞,和更少的增生性的杯状细胞与Der p组。然而,胶原沉积水平没有显著差异之间的砰的一声,FOY,泌尿道感染组和Der p组(图3 (c))。

3.4。蛋白酶抑制剂对BALF中t细胞亚群和血清抗体水平的影响

蛋白酶抑制剂对t细胞亚群的影响通过流式细胞术和BALF中单克隆抗体CD3 +、CD4 +、CD8 +、CD25 +(图4(一))。相对幼稚的组,有显著增加的百分比CD3 + / CD4 +、CD4 + CD25 + t细胞在Der p组。然而,没有明显差异的百分比CD3 + / CD4 +、CD4 + CD25 +淋巴细胞之间的砰的一声,FOY和泌尿道感染组和Der p组。CD3 + / CD8 + t细胞的比例在五组BALF没有不同。

蛋白酶抑制剂的影响评估在重复Der p-challenged小鼠体液免疫反应状态,血清样本化验为Der p-specific IgG1和IgG2a / 2 b和总IgE水平(图4 (b))。与天真的老鼠相比,血清Der p-specific IgG1和IgG2a / 2 b和总IgE水平Der p组显著增加。然而,没有显著差异水平之间的这些抗体砰的一声,FOY,泌尿道感染组和Der p组。

3.5。蛋白酶抑制剂减少促炎和Th2细胞因子在BALF和血清

确定这些蛋白酶抑制剂对T-cell-mediated反应有任何影响,我们检测BALF和血清t细胞细胞因子。如图5与Der p治疗相比,砰的一声,福伊,和泌尿道感染治疗显著降低血清中il - 4的水平和IL-5, il - 6, IL-13, IL-17 BALF中。然而,il - 12和干扰素-γ水平BALF并不受砰的一声,FOY,泌尿道感染的治疗。

3.6。蛋白酶抑制剂调节Der p-Induced促炎细胞因子和趋化因子基因表达的肺部组织

与Der p组相比,砰的一声,FOY,泌尿道感染治疗导致il - 6的含量明显低于mRNA和IL-17A mRNA表达(相对于β肌动蛋白mRNA)在肺组织(图6(一))。相对其他基因的mRNA水平,包括TGF -β1、咆哮、eotaxin、GATA-3 IL-13,砰的一声没有显著不同,FOY和泌尿道感染组与Der p组(数据没有显示)。

3.7。蛋白酶抑制剂抑制NF -κB激活Der p-Challenged肺组织

转录因子核因子(NF)κB扮演一个重要的监管作用,促炎细胞因子的生产如TNF -α、il - 6和il - 1。抑制NF -有疗效κB在炎症条件下活动(16]。图6 (b)显示了NF -结果κB激活整个肺的五组小鼠使用电泳迁移率改变分析(EMSA)。NF -κB-specific dna蛋白质绑定活动显著增加Der p组肺组织。相比之下,老鼠接受砰的一声,FOY,泌尿道感染显著抑制NF -κB活动与对待Der p。

4所示。讨论

使用小鼠实验模型的研究大大促进了我们对哮喘下过敏性炎症机制的理解。然而,模型包括短期、高层接触致敏动物抗原对调查产生严重的局限性病变发展在慢性哮喘的发病机制1]。我们之前显示重复挑战通过气管内的接触尘螨,没有辅助治疗,导致慢性肺部炎症。老鼠用在这个模型中表现出一些症状,在人类所观察到的类似慢性哮喘,包括有浓度过敏原特异性IgE水平高;肺嗜酸性粒细胞和AHR;和增加IL-5 IL-13 IL-17和干扰素-γ在BALF水平;增加co-stimulatory B7.2 BALF细胞表达;和气道重塑的特点,包括胶原蛋白沉积和杯状细胞增生17,18]。在这项研究中,我们评估了可能的保护作用的砰的一声,FOY,泌尿道感染管理敏感时期在慢性哮喘小鼠模型。

(AHR)气道高反应是一个关键的哮喘的病理生理特征。气管压力(Ptr)显示在哮喘气道高反应性机制的,以及用于气道高反应性抑制药物治疗的作用机制。Ptr相结合通过气道流动压力和气道倒电容压力(19]。Rrs和人是两个重要的气管压力系数(Ptr)根据一个呼吸系统运动方程:,在那里是时间,是肺体积变化,气流。当过敏原进入呼吸道引起气道阻塞,它增加Rrs和人水平在哮喘气道阻力(20.,21]。在这项研究中,治疗三个丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制Rrs和人的价值观和气道炎症和重塑。丝氨酸蛋白酶抑制剂有抗炎作用,所反映的总数的减少细胞和巨噬细胞的百分比,中性粒细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞BALF相对于那些Der p组。此外,这些抑制剂也减少气道炎症和增生性杯状细胞的数量,如肺组织学所示,尽管他们没有改变胶原沉积。因此,砰的一声的抑制效应,FOY,气道高反应性和泌尿道感染可能与气道炎症,减少嗜酸性粒细胞浸润,杯状细胞增生气道重塑。然而,这些丝氨酸蛋白酶的比例没有显著影响CD3 + CD4 +, CD3 + CD8 +, CD4 + CD25 + t细胞亚群在BALF或不同的抗体血清中同形像。

Th2细胞因子如il - 4、IL-5 IL-13发挥重要作用在哮喘的病理生理学,包括AHR和气道壁重构(22]。在哮喘发病机理、il - 4是一个上游调节过敏炎症的细胞因子促进Th2细胞分化[23]。IL-5是嗜酸性粒细胞特定终端分化、生长,生存(24,25]。il - 4和IL-13引起粘液分泌过多,导致增加连同IL-5气道高反应性和气道重塑与TGF -β和il - 6 (26]。在这项研究中,我们表明,丝氨酸蛋白酶抑制剂IL-5的分泌,降低BALF中il - 6, IL-13和血清中il - 4。因此,我们推测,砰的一声,FOY和泌尿道感染减少嗜酸性粒细胞浸润,气道高反应性和气道重塑调制Th2细胞因子的生产和/或活动。

IL-17水平升高BALF和血液中发现的严重哮喘患者(27,28]。IL-17中扮演着一个关键的角色在气道炎症,中性粒细胞招募,气道高反应性和气道重塑29日,30.)在哮喘气道嗜酸性增强Th2细胞介导炎症反应,调节各种炎症介质的表达(31日]。il - 6发挥了至关重要的作用在改变Treg和Th17细胞之间的平衡,并控制il - 6活性可能是一个有效的方法治疗各种自体免疫和炎性疾病(32]。在我们的研究中,丝氨酸蛋白酶抑制剂降低il - 6的分泌和IL-17 BALF和中性粒细胞减少招聘在肺部,表明砰的一声,FOY,泌尿道感染可以通过调制Th17细胞抑制中性粒细胞招募活动。

糖皮质激素和阿司匹林长期以来一直用于治疗炎症性条件。轻度和中度哮喘可能相关的嗜酸性粒细胞的炎症反应,其中包括Th2细胞免疫反应。然而,严重哮喘是皮质类固醇阻力与中性粒细胞炎症有关,与Th17细胞免疫反应(33]。哮喘患者长期使用糖皮质激素可以开发严重的副作用。阿司匹林可以抑制Th17-associated炎症,但它能增强Th2-associated气道炎症的发生34]。在这项研究中,丝氨酸蛋白酶抑制剂似乎减弱Th2和Th17-associated炎症,这可能有助于治疗严重的哮喘。

先前的研究表明NF -增加κ敏B的活动,也可以诱导活性氧等各种代理(3,35]。NF -κB, redox-regulated转录因子,起着至关重要的作用在Th2细胞分化和调节生产所需的促炎介质诱导过敏性气道炎症在肺上皮细胞36]。因此,NF -κB信号通路已被建议作为一个有前途的治疗干预的目标在哮喘37]。在这项研究中,砰的一声,FOY和泌尿道感染抑制NF -κB激活在肺组织中作为抗氧化剂。

值得注意的是,泌尿道感染,尿胰蛋白酶抑制剂纯化,从人类源集中,有很好的效果对我们重复Der p-challenged慢性哮喘小鼠模型。在我们之前的报道,泌尿道感染没有影响短期致敏小鼠哮喘模型,可能只是哮喘恶化的生物标志物。这两项研究的区别是,当前的研究长期治疗用于重复Der p-challenged慢性哮喘小鼠模型。这些结果表明,泌尿道感染可能是炎症生物标记与急性哮喘恶化和有反馈作用对改善慢性过敏性哮喘的气道炎症。详细机制泌尿道感染的影响allergen-induced气道炎症需要进一步调查。

5。结论

总之,我们的结果表明,丝氨酸蛋白酶抑制剂砰的一声,FOY,气道高反应性泌尿道感染减毒,过敏性气道炎症和重塑一个慢性哮喘小鼠模型。这些影响的差别是伴随着对这些Th2细胞因子和Th17细胞功能,抑制NF -κB激活的肺部组织。丝氨酸蛋白酶抑制剂可能疗效治疗asthma-associated气道炎症。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Chih-Che林、林Li-Jen Shulhn-Der Wang Chung-Jen蒋介石Yun-Peng曹国伟,Shung-Te拷参与的设计研究。Chih-Che林和林Li-Jen执行大部分的实验。王Shulhn-Der建立动物模型。约瑟夫·林准备砰的一声,FOY和泌尿道感染。Chung-Jen蒋介石和Yun-Peng曹国伟准备Der p动物实验。Chih-Che林、林Li-Jen Shung-Te花王写道。Chih-Che林和林Li-Jen贡献了同样的工作。

确认

这项研究是由美国国家科学委员会的支持,台湾,中华民国(NSC 102 - 2320 - b - 039 - 017和101 - 2320 - b - 039 - 056 - my2)和中国医科大学(CMU100-TS-08)。进行了实验和数据分析部分通过使用医学研究中心核心设施,研发办公室在中国医科大学,台中,台湾、中国。