文摘

血清淀粉样蛋白A (SAA)生产增加了关节炎滑膜组织发炎,它充当一个细胞因子/化学引诱物炎症和免疫细胞和基质降解酶的诱导物。SAA绑定lipoxin已被证明4受体,formyl-peptide相关成员2 g蛋白耦合受体家族(ALX)和引起炎性活动在人类主要呈synoviocytes (FLS的)。我们报告识别uteroglobin,小球状蛋白质有强大的抗炎活动,作为一个可能的ALX配体。Uteroglobin-specific协会与ALX证明了酶免疫测定实验用人细胞系工程表达人类ALX受体。Uteroglobin ALX的相互作用导致SAA的抑制反应,如磷脂酶的衰减2活化和细胞趋化性。FLS的,uteroglobin显示对抗反对SAA-induced interleukin-8释放和减少细胞迁移。这些小说角色描述通过ALX uteroglobin可能有助于阐明遗传和临床观察表明在uteroglobin启动子多态性与疾病的结果,具体的预测类风湿性关节炎患者的骨侵蚀或IgA肾小球肾炎和结节病的严重性。

1。介绍

血清淀粉样蛋白A (SAA)是一种急性期蛋白质和类风湿性关节炎(RA)的炎症标志物及其疾病进展(1]。在急性期反应,SAA含量可以增加1000倍的人类的循环,使其成为主要急性期反应物(4月)2]。SAA促进释放的细胞因子和趋化因子呈synoviocytes (FLS)绑定到它的受体,如晚期糖化终产物受体(3)或通过lipoxin4相关的受体(ALX),也称为formyl-peptide 2受体(4]。

ALX最初报道2000年在FLS的由我们集团(5]。这是七个跨膜蛋白偶联受体家族的成员具有不同类型的配体。促炎细胞激活表达ALX与细菌和病毒多肽显示,内生急性期分子,如SAA、纤溶尿激酶受体(6- - - - - -9]。抗炎的级联事件最初报道引发的脂质配体,如内源性arachidonate-derived lipoxin脂氧合酶产品4(LXA4)[10- - - - - -12),LXA4派生的模仿,epi-LXA4。然而,添加annexin-1(一种激素性抗炎蛋白)日益增长的家庭ALX配体提供了证据表明,这种受体也可以调节抗炎信号(13通过蛋白质)。

steroid-inducible Uteroglobin (UG), 16 kDa分泌蛋白与强大的抗炎和免疫调节活动,被发现与annexin-1分享短肽序列的相似性,称为antiflammin主题(14- - - - - -17]。内源性九肽或antiflammins报道进行监管对炎症和重叠的生物活性的影响(18- - - - - -21]。antiflammins UG及其肽衍生品,也有报告称,调节对磷脂酶的影响2(中国人民解放军2)活动、白细胞激活formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP)和补充片段C5-induced趋化作用,和单核细胞和中性粒细胞的吞噬作用22- - - - - -25]。形成鲜明对比的数据报道解放军antiflammins的抑制能力2活动(14,19,26,27]。即使基本九肽antiflammin-2被证明缺乏PLA2的抑制活性(28),卡迈勒等人报道了其选择性人类ALX绑定,从而提供一个潜在的抗炎作用机制(29日]。

像annexin-1 UG也被称为分泌,glucocorticoid-inducible蛋白(17),显示强大的免疫调节特性,类似于LXA4释放,如抑制il - 6 (30.在航空公司[],减少细胞的浸润31日),减少前列腺素的合成(即PGF2和铂族元素2(32]),并降低lysophosphatidic酸离子水平(33]。

UG的能力限制的可用性细胞内花生四烯酸(通过强烈抑制磷脂酶2活动),防止脂质介质的生成提出了作为主要的机制导致其抗炎活性14,15]。这使得我们调查UG是否也可以通过ALX和信号交互,以及引起相似的抗炎作用。

目前的报告表明,UG与ALX,类似于LXA4和/或annexin-1,激活一个强有力的负反馈机制细胞炎症活动。我们表明,一些之前报道生物反应可以基于UG与ALX的分子间相互作用。

2。材料和方法

2.1。道德声明

本研究按照美国准则和执行内部审查委员会批准在芝加哥伊利诺伊大学研究的地方。

2.2。细胞培养

人类原发性滑膜成纤维细胞(FLS)从膝盖关节镜活检获得培养在EMEM补充10%胎牛血清的边后卫。新鲜培养基含有5%的边后卫被添加到每个实验之前细胞培养24小时。FLS的段落使用7 - 11。

早幼粒细胞白血病细胞株(HL-60)生长(34在RPMI 1640含10%的边后卫。稳定转染与空pcDNA-3 HL-60细胞 或者包含ALX pcDNA-3开放阅读框 被培养的400μG418的g / mL。

中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养αmem补充与腺苷、脱氧腺苷,胸苷(0.2毫克/毫升),和10%的边后卫。稳定转染CHO细胞与空pINF质粒 或者包含ALX pINF开放阅读框 被选中的5μ嘌呤霉素的g / mL。

人类子宫内膜cells-1A (HEC-1A)和HEC-1AUG好心的仙女博士提供的a(临床生理病理学,大学的佛罗伦萨,意大利),生长在麦科伊介质,补充10%的边后卫和碳酸氢钠(2.2 g / L)。抗生素G418作为选择性 。人类重组UG (hrUG)请提供Claragen Inc .(美国马里兰州罗克维尔市)。人类重组SAA1/2 (hrSAA)从Peprotech购买(美国新泽西州落基山)。

2.3。RNA隔离和一

总RNA提取与试剂盒试剂(位于马里兰州Rockville生命技术)。RNA逆转录(RT)系统根据制造商的指示(美国WI Promega,麦迪逊)和RT - pcr进行如下:UG,正向引物(外显子1):5′ctc ACC CTG GTC ACA CTG三大′;反向引物(外显子3):5′ttg亚美大陆煤层气有限公司AGA GCA gg CTG GT-3′的退火温度50°C和30个循环扩增为了获得344个基点的片段。嵌套一所需的UG FLS的检测,与正向引物如上所述,反向引物(外显子2):5′-GGG TGT CCA CCA GCT TCT TC-3′的退火温度47°C和30个循环扩增得到180个基点的片段大小。ALX分析是如前所进行的发表(5]。

2.4。反义寡核苷酸

Phosphorothioate寡核苷酸买来IDT(美国IA珊瑚镇)。ALX,以前公布的反义寡核苷酸和感觉被使用(12]。UG的反义益生元5′- C * T * G * AAA AGT太极拳ATG GC * * G * 3′,炒益生元:5′- C * C * G * TGC TGT ACC标签TG * * G * 3′(*表示phosphorothioate债券)。寡核苷酸在最后加入细胞培养上清液浓度的8μ48 h和g / mL readministered第二次治疗前72 h。

2.5。修改后的酶免疫测定(EIA)

CHO细胞培养在96 -孔板confluency高达80%。细胞被洗了三次与PBS前孵化中UG稀释浓度增加αmem (200μ信用证在4°C) 10分钟。与PBS洗涤后,这些细胞被孵化1 h与山羊anti-UG抗体室温(20μ解决方案包含g / mL)稀释 文化上层清液和新鲜αmem (5% v / v)。细胞被洗两次与PBS和孵化为45分钟在室温下1:2000稀释辣根peroxidase-conjugated抗体抗体(向量实验室,伯林盖姆,CA)。贡献endoperoxidase被废除的细胞治疗与0.01%过氧化氢为30秒。与PBS两个洗后,这些细胞被孵化与o-phenylenediamine盐酸盐溶液在室温下柠檬酸缓冲(皮尔斯生物技术,罗克福德,IL)含0.03%过氧化氢。比色反应是停止使用2 N硫酸。上层清液(200μL)从每个被转移到一个96孔板和颜色强度以490海里。的值被蛋白质含量归一化。细胞试验中使用的固定在10%三氯醋酸溶液(1 h 20°C)。干燥后,每个好沾1%的内容sulforhodamine B(σ,圣路易斯,密苏里州),洗在50%醋酸和resuspended三基本解决方案,其次是检测在510海里。

2.6。磷脂酶一2(中国人民解放军2)分析

磷脂酶活性测定通过确定释放的游离酸形式氚化花生四烯酸酯化后贴上花生四烯酸膜磷脂(35]。值氚化AA释放在上层清液由中恢复过来γ在表示时间点闪烁计数。

2.7。Interleukin-8释放

ELISA用于衡量文化上层清液之前报道的发布引发水平(5)和制造商的指令(美国表达载体)。

2.8。趋化性分析

趋化性分析被执行(如前所述)(8,16]。简单地说, 和 培养在RPMI包含0.1%的边后卫,然后播种到8μ米孔聚碳酸酯膜transwells。SAA、UG等transwells的钱伯斯表示浓度越低。1 h孵化后37°C,悬浮液的收集。随后,细胞治疗与碘化propidium数量和形态,流式细胞仪分析。

人类FLS的被镀confluency到transwells 8μ米孔聚碳酸酯插入使用天池或苯酚red-free DMEM。12 h后在无血清条件下,趋化性评估2 h后的受体激动剂进入众议院。手动迁移细胞数(结晶紫染色法)或衡量代谢比色测定(甲瓒,EZ4U ALPCO诊断,温德姆,NH,美国)。

2.9。统计分析

所有实验至少重复三次(除非另外注明)和mRNA凝胶通过rt - pcr结果显示为代表的两种表现。数据报告为平均数±标准差。方法之间的比较和对照组学生的治疗 以及和重要 值小于0.05确定统计学意义。

3所示。结果

3.1。描述与ALX UG的交互

为了确定UG可以绑定到ALX,我们首先使用一个附着细胞系中国仓鼠卵巢细胞(CHO),稳定转染与模拟pINF向量以及overexpressing人类ALX修改后的酶免疫测定(EIA)。更高的观察和具体UG绑定 细胞与模拟 (图1)与ALX mRNA表达只在 转染细胞(图1插图)。


图1
外生hrUG绑定CHO细胞表达ALX酶免疫分析法所示修改。CHO细胞表达的空向量pcDNA3向量 或者包含完整ALX开放阅读框 被暴露于hrUG浓度增加。asterix符号表示数据点 当比较值< 0.02 来 数据系列。结果绘制一式四份的平均数±标准差决定在三个独立的实验。一是用于监控ALX mRNA表达与ALX cDNA稳定转染CHO细胞(插图)。控制代表没有模板添加到反应。ALX lipoxin是4受体或FPR2 / ALX。的结果是代表两个执行的凝胶。

细胞上的受体蛋白质化验在4°C,因为交互本身可以被修改的细胞活动,如蛋白质的内化/受体复杂、驱逐或掩蔽膜通过干预事件。

自从UG-dependent剂量曲线 显示其他蛋白质/受体的存在依赖于UG在这些细胞中,如纤连蛋白(36),我们不能排除进一步UG去通过其他途径的影响。

3.2。人类重组UG调节SAA-Induced ALX-Dependent细胞信号

UG的能力调节ALX信号确定在CHO细胞通过比较UG和SAA的影响,单独或组合,在解放军2活动(图2)。SAA调节解放军2激活细胞中选择性overexpressing ALX ( ,图2(一个)),而没有获得响应控制细胞( ,图2 (b))。此形成鲜明对比的是UG效应导致的选择性downmodulation基底的解放军水平2活动(图2(一个))。有趣的是,结果表明,UG触发器的早期峰值瞬时活动在SAA的存在 。这种早期的解放军2活动高峰是紧随其后的是持续抑制SAA-induced激活以后点(图2(一个))。还有一个瞬变的早期峰值UG在模拟转染CHO细胞(图2 (b)),这是低于SAA和UG的早期综合效应 。

(一)
(一)
(b)
(b)
图2
SAA-induced磷脂酶一2活动是减毒通过UG在CHO细胞overexpressing ALX。SAA-induced解放军的时间响应2活动 细胞(a) 5分钟监测一段的存在和没有UG,相比模拟转染CHO细胞(b)。意义是由学生的注意 以及SAA治疗与SAA + UG的治疗。*为 和* * 。代表四个不同的平均数±标准差实验结果一式三份的决定。
3.3。UG的功能结果在SAA-Induced释放引发和细胞趋化作用在人类细胞系和初级滑膜成纤维细胞

由于内源性合成UG可以提供潜在的混杂因素,HEC-1A细胞,这自然不会表达UG基因,被用于与HEC-1A工程过度表现UG进行比较 。另外一个反义益生元(AS-ALX)治疗成立调节受体表达在HEC-1A(图3(a))。如图3(b),左边的图,野生型HEC-1A细胞缺乏内生UG的合成反应与增加了五倍SAA引发的综合控制,然而发布引发水平相对较低背景值,当细胞表达ALX AS-ALX被治疗细胞沉默。在 细胞内源性UG合成、SAA-induced引发释放水平也降低(图3(b),右边的图)。UG分泌也减少了单独发布引发的基线值水平。总的结论是,SAA影响引发仍与UG礼物;然而,则明显较低。


图3
SAA-induced引发水平显著下调overexpressing UG HEC-1A细胞。(一)一HEC-1A ALX mRNA的细胞和ALX-antisense (AS-ALX) oligo-treated HEC-1A细胞。的结果是代表两个执行的凝胶。(b) SAA-dependent引发释放以ELISA, HEC-1A细胞,抑制时使用ALX-antisense益生元。在 细胞SAA-induced引发释放是HEC-1A相比显著降低。学生的 以及对SAA与AS-ALX HEC-1A细胞或治疗 细胞进行了计算, (* *)。数据规范化使用细胞的数量。结果是三个独立实验的平均数±标准差与四倍的决定。

趋化性是主要的引发的释放的结果。因此,我们决定UG的影响在HL-60细胞和FLS的SAA-induced趋化作用。FLS的已知拥有SAA-dependent ALX-mediated反应,包括趋化作用[7]。南非航空公司在细胞趋化作用有剂量依赖性的影响 (黑条),但不是在模拟转染细胞(白色的酒吧,图4(一))。其效力与观察到5%的边后卫,通过多个标准刺激用来激发趋化作用,nonreceptor-restricted机制,也能够调动模拟HL-60细胞(图4)。除了增加引起的趋化反应SAA,表达水平的ALX和内源性UG也发现与细胞在趋化作用(图的数量4 (b))。更具体地说,在控制基线值样本比较模拟和时增加了一倍多 细胞和他们进一步增加如果内源性UG合成沉默(图4 (b)和插图)。

(一)
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(b)
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图4
SAA-stimulated HL-60迁移是由ALX而被UG抑制。(一)迁移 和HL60下议院SAA时两种不同浓度(100和500海里)或5%的边后卫(积极的控制)。(b) HL60迁移, ,UG-antisense HL60细胞治疗在SAA(500海里)或5%的边后卫补充道。结果均值±SD四个独立实验一式三份的决定。

SAA的影响和UG细胞趋化作用被证实使用人类主要读者,只有decameric的痕迹和更高分子量复合物的UG可见被西方墨迹图(略高于测试检测的极限~ 2 / ng蛋白质 细胞,数据未显示)。这些UG数量(计算)~ 12点可以忽略不计,因为他们代表的浓度三个日志订单低于预估亲和力ALX不到~ 1000倍,实现了添加了体内UG (100 nM和图1)。结果在图5表明SAA-induced趋化作用在人类FLS的强烈抑制UG的克分子数相等的浓度,在UG本身没有影响迁移的细胞控制样本的数量。并行实验SAA引起了不同海拔的引发和确定选择性积累降低腔室,在UG抵消这些影响(图5 (b))。结果还表明,SAA-induced引发梯度功能相关中断以来引发阻止血清导致细胞的数量显著减少迁移从上到下室transwell(图5 (c))。

(一)
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(b)
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(c)
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图5
衰减SAA诱导细胞的迁移和引发发布hrUG FLS的。(a)的迁移FLS的接触的边后卫,SAA(100海里),或与UG SAA(100海里),显示如上%的变化控制(基底生长介质)。结果是三个独立实验的平均数±标准差与重复的决定。(b)发布引发水平以ELISA上下室介质FLS的治疗后5%的边后卫,SAA(100海里)单独或结合UG或LXA4(100海里)。结果均值±SD重复的决定从两个实验。数据规范化使用细胞数量。(c)迁移FLS的SAA(100海里)治疗后低室时引发抑制性抗体被添加到低,上部,或两个隔间transwell系统。学生的 以及SAA与控制 值< 0.005(* *)和SAA与SAA + UG治疗 值< 0.01 ( )(a)和< 0.002 ( )(b)。结果均值±SD从四决定执行的两个实验。

4所示。讨论

调查与UG-knockout老鼠透露,这种蛋白质的缺乏会导致表型表明炎症的关键/ s自我平衡的作用,自身免疫,癌症和其他进程37]。

UG与ALX似乎与抗炎/ proresolution事件有关。虽然越来越多的ALX受体激动剂已经报道,信号通路的特征仍然是不完整的。2006年,Kamal等人报道,antiflammin-2 ALX,引起postreceptor信号响应,如快速磷酸化ERK1 ERK2,抑制中性粒细胞的功能提供数据交互与内皮单层流(29日]。

我们报告首次UG可以绑定到ALX并通过这种受体抒发SAA-induced细胞抑制PLA2活性。UG绑定ALX产量紧张性抑制基底解放军2活动水平。时结合SAA,快速和脉冲解放军2激活观察,其次是抑制SAA活动。事实上,中国人民解放军2观察到激活配置文件与GPCRs SAA通常观察到激活促炎介质如FMLP或白三烯B4(38,39]。UG脉冲解放军2激活与LXA重叠4简介,伴随着一个广泛的膜脂质重塑没有完全激活促炎的事件,如合成的促炎类花生酸unesterified AA (10,12,35]。此外,UG抑制SAA-induced解放军的时间剖面2活动和使用低浓度二价阳离子的测定(Ca2 +加上毫克2 +< 0.8毫米)强烈建议这些事件涉及到细胞内的人民解放军2亚型,扩大在UG的除了抗炎作用的抑制分泌形式的解放军2按照最初的报道,当UG属性最初描述(14]。

值得注意的是,受体的进一步证据对抗UG和SAA之间获得了通过测量SAA-induced引发释放。建立了在UG ALX作用,SAA信号通过抑制其表达与ALX反义益生元。UG的描述对这一事件的影响进行了使用HEC-1A细胞系缺乏内生UG合成、和稳定转染细胞 。水平的引发后公布SAA挑战被发现HEC-1A中要比不发生变异的病人高 并受到ALX反义治疗。值得注意的是,还引发生产的基础水平高于野生型比UG生产HEC-1A HEC-1A,表明UG的自分泌作用是至关重要的两个得罪SAA-induced, ALX-mediated释放引发,调节引发基底的水平。内生UG合成时的作用在调节基底引发生产水平与p38磷酸化的抑制基底的水平,表明内生UG可能关键“防止”ALX贡献促炎网络通过反对与促炎的配体。

射线等。40)报道,过敏原诱发的表达升高血清淀粉样蛋白应用UG小鼠的肺部。SAA发现更高的生产提供一个趋化信号树突细胞的迁移和UG显示抑制SAA-induced mL4-7细胞的迁移。这些细胞是由稳定使转染hec - 293细胞FPR2(鼠标同族体人类FPRL1 / ALX受体)的互补脱氧核糖核酸构建剂量依赖性的方式。在当前的报告中,我们还发现,UG抵消SAA-induced细胞迁移(如不依从HL-60细胞ALX-dependent方式,以及附着主要人类FLS的)。

我们已经表明,UG合成发生在相关的骨髓细胞谱系(数据没有显示)。我们的结果显示绑定αUG来 没有进一步绑定的外生UG指出。HL-60细胞被选择为我们研究自SAA-induced趋化性髓细胞及其依赖ALX已经建立(6]。我们的结果确认SAA HL-60细胞能够促进细胞趋化性如果与ALX细胞转染。使用UG的反义益生元废除内生UG合成,结果表明,失去了UG合成伴随着SAA的加剧了HL-60细胞趋化现象的反应。这个建议,提出了引发HEC-1A释放,从内部合成UG施加紧张性抑制促炎介质引发的细胞反应的激活。

虽然工程细胞系的使用允许的目的与ALX UG交互特征和产生的生物反应,FLS的被用来评估这些事件的病理生理相关性尤其是人类关节炎滑膜关节。此外,细胞迁移的能力在SAA chemoattraction报道(6所以影响UG的趋化作用进行了测试。UG是SAA-induced FLS的趋化作用的有效抑制剂,抑制伴随着显著的减少引发的水平。事实上,引发测量上、下两院的transwell系统采用这些实验表明,SAA,但不是的边后卫,建立一个清晰的趋化因子梯度所反对的克分子数相等的数量的UG的存在。

综上所述,有可能通过UG行为ALX以外的途径。纤连蛋白的实验表现我们不能排除或其他受体可能结合UG和触发通路,创建与ALX相声信号。

UG基因的单核苷酸多态性(A587G)似乎与低腐蚀性疾病的风险在风湿性关节炎患者41]。这表明UG可以发挥保护作用,慢性炎性关节疾病。UG将来可能是一个有吸引力的治疗选择,评审的Pilon [42]。证据这种效果来自各个领域的研究。老鼠缺乏UG极易受肺纤维化和重组UG是防止bleomycin-induced生产促炎细胞因子和TGF -辅助2βprofibrotic。所以,UG似乎是关键在预防肺纤维化小鼠(43]。同时,人类特征缺乏UG对炎症表现出倾向,纤维化和肿瘤疾病(42]。UG是表示可能作为肺surfactant-protective代理,尤其是在新生儿呼吸窘迫综合征。人类重组UG在第一个临床试验测试其有效性在保护表面活性剂、磷脂和蛋白质的复杂混合物,从PLA2催化降解和被证明是安全的,当管理气管(37]。UG也发现防止IgA介导的疾病,如IgA肾病,防止沉积的IgA-fibronectin immunocomplexes组织,如肾肾小球(44]。

总之,识别可能的ALX-mediated UG活动扩展描述为UG之前所描述的消炎作用。我们的结果表明,UG可以强有力地影响积极反馈机制(引发释放)参与SAA炎性细胞激活。UG可能发挥着卓越的作用在调节炎症活动跨各种目标的组织。与ALX互动,表达了对吞噬细胞,巨噬细胞和中性粒细胞等,以及当前记录的能力UG内源性合成髓系细胞谱系,扩展了UG的病理生理意义,抗炎活动以外的器官,比如肺癌和子宫内膜,丰富的蛋白质和抗炎活动先前承认(16,45,46]。

缩写

ALX: Lipoxin一4受体
AP1: 激活蛋白1
赵: 中国仓鼠卵巢细胞
FI: 荧光强度
读者: 纤维母细胞像synoviocytes
HEC-1A: 人类子宫内膜细胞1号线
HL-60: 人类早幼粒细胞细胞系60
il - 1β: 白介素- 1β
引发: 白介素8
LXA4: Lipoxin一4
NF-kB: 核因子k B
中国人民解放军2: 磷脂酶一2
SAA (rhSAA1): 血清淀粉样蛋白一
UG (rhUG): 重组体人uteroglobin,也称为CC10蛋白质。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者表达深深的感谢博士Aprile Pilon, Claragen Inc .(马里兰州罗克维尔市),提供rhUG和αug Abs和亚历山德罗妖精博士,临床生理病理学,佛罗伦萨,意大利佛罗伦萨大学提供人类子宫内膜cells-1A (HEC-1A)和HEC-1AUG。这项工作是支持由国家卫生研究院(没有。AR45931斯特凡诺百花大教堂)和关节炎基金会,芝加哥大章(Snezna Sodin-Semrl)。贡献的作者论文之前他们在当前机构/公司就业。