文摘

皮肤损伤在成年哺乳动物带来的一系列事件和炎症在受伤区域首先启动,提供大量炎症因子,这是最后的疤痕形成的关键。虽然胎儿和裸体小鼠的postinjured皮肤愈合无疤由于缺乏炎症或免疫缺陷的情况下,我们设计了一个可行的acid-responsive ibuprofen-loaded保利(L-lactide)(丙交脂)纤维支架通过掺杂碳酸氢钠,防止过度的炎症和最终实现无疤愈合。的形态学结果显示,动物体内实验处理acid-responsive ibuprofen-loaded丙交脂纤维支架展出减轻的炎症,加速愈合过程,通过干涉和监管胶原蛋白沉积胶原分布α光滑的肌肉肌动蛋白(αsma)和碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)表达式。胶原蛋白I /胶原蛋白的低比率三世和TGF -β1 / TGF -β3和更高比例的矩阵metalloproteinase-1(金属蛋白酶- 1)/组织抑制剂metalloproteinase-1 (TIMP-1) acid-responsive ibuprofen-loaded丙交脂纤维支架组经实时qPCR。这些结果表明,抑制过度炎症会导致普通胶原蛋白分布的因素和适当的比率,促进或抑制疤痕形成,然后减少疤痕区,最后实现无疤愈合。

1。介绍

在成年哺乳动物的皮肤伤口愈合是一个动态的过程,包括炎症、增殖、成熟或重构阶段(1]。与中性粒细胞炎症启动第一,积累在伤口面积,其次是常驻巨噬细胞和循环单核细胞浸润伤口(2]。扩散的特点是reepithelialization,血管生成,肉芽组织形成,和矩阵沉积(3),不可避免地会导致纤维疤痕组织的形成。重构是胶原蛋白的积累和重塑,这在很大程度上是由成纤维细胞和最终形成疤痕。这些创伤可能导致问题的结果,特别是当跨关节创伤,他们可以损害的机动性和灵活性或影响显著的位置,这会导致毁灭性的心理后果(4]。与成人伤口愈合,胎儿的皮肤伤口愈合没有伤疤,在某种程度上,将对他们不损伤后炎症反应,直到山在妊娠后期(5]。在另一项研究中,裸体小鼠的postinjured皮肤的特点是缺乏伤疤,因为裸体小鼠免疫缺陷(6]。所以控制炎症过程中是相当重要的最后无疤愈合。

针对无疤愈合早期的胎儿,有几个没有疤痕再生的特点。例如,足够的III型胶原蛋白含量可能阻止疤痕组织的形成,和过度的I型胶原蛋白的分泌可能会导致一个杂乱无章的纤维结构和肥厚性疤痕形成7]。有三个高度同源转化生长因子-β(TGF -β)基因在哺乳动物中,TGF -β1、TGF -β2,TGF -β3 (8]。一般来说,TGF -β1、TGF -β2已知促进纤维素增生和疤痕,而TGF -β3被认为是减少疤痕(9- - - - - -11)和表达下调TGF -β1、TGF -β2 (8]。基质金属蛋白酶(MMPs)构成家庭的锌肽链内切酶能够降解大部分的细胞外基质(ECM)的结构组成(12),由他们组织抑制剂(TIMPs) [13]。无疤伤口MMP与TIMP的比率更高,有利于重建和胶原蛋白的积累少14]。特别是,TGF -β可以分泌中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等(15在炎症反应),这一点非常重要,TGF -β能促进ECM合成和抑制矩阵通过调节基质金属蛋白酶和TIMPs营业额(16]。因此,通过调节胶原再生没有疤痕,TGF -β通过控制炎症,MMP与TIMP迫切需要研究。

治疗皮肤损伤,目前可用的一些策略,如局部应用补C5 (17)或微生物纤维素(18]。这些方法加速受伤皮肤的愈合过程,但在此过程中忽视了疤痕形成。据报道,基本成纤维细胞生长因子(bFGF)可能antiscarring效应(19]。然而,bFGF的生物活性和生物利用度应用于受伤的区域都是不允许的。电纺是一种广泛使用的技术生产纳米纤维的各种天然或合成聚合物(20.,21]。实际上电纺纤维支架的三维(3 d)结构,设计和ECM一样,支持细胞附着、增殖、迁移、分化,促进细胞分泌的生物活性分子,并加速功能的组织或器官的形成。和障碍或常规的纳米纤维可以满足不同组织的要求。实际上电纺纤维的高孔隙率和比表面积使他们作为抑制病变细胞的有用的药物载体和组织工程支架细胞增长,导致完整的再生(22]。因此,药物实际上电纺纤维支架有良好的潜在药物载体和细胞生长支架。

考虑细菌感染会导致周围的微环境,成为酸性(23];我们设计了一个可行的acid-responsive控释系统修复组织支架,用于智能地调节抗炎剂释放酸微环境的变化在pH值降低7.4以下的地区,导致的一个很好的抑制炎症早期和后期无疤修复。布洛芬(伊布·)应用作为模型药物(图1)。结果可能会投一些突出炎症和创伤之间的关系,开发新型药物生物材料为无疤愈合。

2。材料和方法

2.1。材料

保利(L-lactide)(丙交脂,Mw = 100 kDa, Mw / Mn = 1.6)从σ公司购买。二氯甲烷(DCM)、碳酸氢钠(某人,NaHCO₃),N, N-dimethylformamide (DMF)购买的试剂级,从化学试剂国药控股有限公司有限公司所有其他化学品和溶剂试剂级或更好,买来GuoYao评议公司(上海,中国),除非另有指示。

2.2。实际上电纺纤维的制备支架

电纺的是根据我们以前的报告(24]。1.0 g丙交脂完全溶解在4 g DCM和2 g DMF实际上电纺丙交脂纤维(PLLA-EF)。准备ibuprofen-loaded丙交脂实际上电纺纤维膜(I-PLLA-EF), 1 g丙交脂和40毫克的伊布·完全溶解在一个包含4 g mix-solvent DCM和2 g DMF电纺。对于acid-responsive IBU-loaded实际上电纺纤维(AR-I-PLLA-EF), 1 g丙交脂和40毫克的伊布·溶解在4 g DCM和2 g DMF;然后0.12毫升NaHCO₃饱和水(96毫克/毫升)的解决方案是添加到伊布·/丙交脂溶液的缓慢与磁力搅拌器搅拌30分钟。混合溶剂然后把在一个连接到高压注射泵设备。一个负电极覆盖与铝箔作为收集器板。

2.3。特性和体外药物释放

环境扫描电子显微镜(整体、范QUANTA250,荷兰)被用来调查实际上电纺纤维的形态。实际上电纺纤维支架(重量,100毫克)同时沉浸在离心管包含25毫升磷酸盐溶液(PBS, pH = 7.4)或acetate-acetic酸钠缓冲溶液(pH = 5.0)。样本在37°C孵化48 h和轻微的晃动(100 rpm)。在预定的时间间隔,1毫升缓冲溶液收集并替换为1毫升新鲜缓冲溶液。收集介质释放药物的数量是由紫外可见光谱在224海里。标准校准情节的伊布·0 - 0.05毫克/毫升的浓度范围是用于确定浓度的药物释放。然后释放药物的比例计算基于初始药物纳入实际上电纺支架的重量。

2.4。动物模型

所有程序之后的政策,上海交通大学医学院和美国国立卫生研究院。所有的动物都来自动物繁育中心,上海第六人民医院隶属于上海交通大学,医学院的中国。雄性大鼠8周Sprague-Dawley ()重200 - 250克每笼被安置一个免费的食物和水,在一个房间里,控制湿度和温度(22°C),在12 h光/暗周期。老鼠被允许适应一周之前的实验。

动物分为两组(每组大鼠20日)并使用氯胺酮麻醉(1毫升/公斤体重)。圆形全层皮肤伤口2厘米直径扩展通过膜carnosus无菌的两边背中线(图1(a))。在第一组,右侧病变治疗与任何支架(对照组)和左病变治疗实际上电纺纤维支架(丙交脂组)。在第二组,左病变治疗ibuprofen-loaded实际上电纺纤维支架(I-PLLA-EF组)和右病变治疗稳定acid-responsive ibuprofen-loaded实际上电纺纤维支架(AR-I-PLLA-EF组)。动物在每组每日评估,但安乐死3、7、14、21天(后操作。从伤口皮肤组织样本网站被全部切除深度和一分为二的形态学观察和分子生物学分析。

2.5。检查伤口关闭率

为了确定伤口愈合率,伤口被画在图醋酸纸上用记号笔第三,7日,14日,21天,用数码相机拍摄的。伤口的面积测量与平面电脑通过扫描醋酸项目表。伤口闭合率是使用以下公式计算: 原来的伤口面积是初始的伤口在一天0。

2.6。组织学检查

组织学检查进行评估再生组织的质量。标本固定在10%福尔马林磷酸盐,在乙醇脱水,二甲苯清除,为了安排嵌入石蜡。5毫米above-treated标本被分组和苏木精和伊红染色(他)组织学观察。此外,马森的三色的染色进行观察胶原的框架。组织学评价的一部分,所有的幻灯片被病理学家在光学显微镜下检查,没有知识之前的治疗。

2.7。免疫组织化学染色

bFGF和免疫组织化学染色α光滑的肌肉肌动蛋白(αsma)是由各自的抗体。部分与二甲苯脱蜡、水化EtOH浓度的减少;内源性过氧化物酶被3%的过氧化氢为10分钟;非特异性结合被1%的牛血清白蛋白(BSA)为30分钟。组织部分加工在10毫米柠檬酸缓冲(pH值6.0)和加热到100°C为抗原检索10分钟。初选是申请bFGF(1: 100)和αsma(1: 100)在一夜之间在4°C。生物素化的二次抗体应用于1:200年30分钟。颜色开发进行轻拍3到5分钟为所有样本,其次是苏木精复染色。

2.8。蛋白质分离和免疫印迹分析

提取蛋白质分数,冰冻组织中均质裂解缓冲(50毫米三pH值7.4,150毫米氯化钠,1% Triton-X 100脱氧胆酸0.5%,0.1% SDS和Protease-Inhibitor-Cocktail (1: 100 v / v;σ)]。孵化后30分钟在冰上,样本为15分钟在12000 r.p.m离心机。,在4°C,上层清液被转移到一个新的管蛋白质分数。蛋白质浓度测定使用Bio-Rad化验(Bio-Rad实验室、大力神、CA) BCA(热科学、沃尔瑟姆,MA)作为标准。然后20μg每个样本的蛋白质电泳使用12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page),然后转移到聚偏二氟乙烯膜(微孔,贝德福德,MA)与5%的脱脂牛奶被Tris-buffered盐水- (TBS) T(10毫米三、150毫米氯化钠和0.1% Tween-20)在室温下1小时。细胞膜主要抗体孵育2小时,洗了几次TBS-T,然后孵化了辣根过氧化物酶共轭二次抗体1小时。最后,膜清洗和开发是一个增强化学发光检测系统(微孔,贝德福德,MA)。信号强度量化的图像分析仪(图片J)。本研究中使用的主要抗体反αsma (1: 500;美国芝加哥Proteintech)。GAPDH分析了内部控制与anti-GAPDH抗体(1:1500;热科学,沃尔瑟姆,MA)。

2.9。定量实时聚合酶链反应分析

皮肤伤口处理后不同的支架或负控制14天,再生组织的总RNA制备使用试剂盒试剂(热科学、沃尔瑟姆,MA)根据制造商的指示。RNA的完整性验证了光密度吸收比率OD260 / OD280 nm在1.8和2.0之间。互补脱氧核糖核酸的合成进行了根据RNA PCR设备协议(热科学、沃尔瑟姆,MA)。引物序列见表1。定量聚合酶链反应(qPCR)放大进行了一式三份,使用SYBR绿色PCR试剂系统。实时定量PCR进行如下:初始变性10分钟在95°C和40 PCR循环组成的15秒95°C和45秒60°C。量化总是使用内生控制GAPDH规范化。相对量化进行了比较方法如前所述[25]。

2.10。统计分析

数据被表示为均值±标准差(SD)。统计学意义与学生的决定以及当有两个实验小组。多重比较的组进行单向方差分析(方差分析)和事后测试Windows 9.1 (SAS)。P值< 0.05在统计学上被认为是重要的。所有实验进行三次。

3所示。结果

3.1。特性和体外药物释放

这些药物载体的关键组件是碳酸氢钠(NaHCO₃),它可以被纳入使用coelectrospinning实际上电纺纤维。所描述的柯et al。26),NaHCO₃与酸溶液反应和有限公司₂迅速释放出纤维纤维支架孵化成酸性溶液时,加速药物释放的内部部分纤维。

形态实际上电纺纤维支架没有珠子的纤维结构,纤维在大小和均匀随机互联(图1(d)),所有样品都是通过扫描电镜进一步测试孵化后48 h(图5.0 pH值1(e))。而最初的形成(图1(d)),实际上电纺纤维的三维结构支架培养48 h后pH值5.0保持三维纤维结构,即使纤维肿胀轻微而原始形成如图1(d)。IBU-loaded实际上电纺纤维支架的体外释放档案在pH值5.0解决方案如图1(f)。释放药物的总量约30.6%和78.2%的I-PLLA-EF和AR-I-PLLA-EF孵化48 h后缓冲溶液pH值5.0,分别。加载的释放率与NaHCO伊布·加快₃在纤维酸性溶液。

3.2。分析皮肤伤口闭合的大鼠模型

伤口的大小在所有团体被记录在天0,术后3、7、14、21和百分数表示最初的伤口面积(图2)。伤口面积显著减少在所有组7天后皮肤切除。剩余在第7天伤口面积在对照组为73.11%,58.52%,42.25%,25.00%,丙交脂组,I-PLLA-EF组,分别和AR-I-PLLA-EF集团()。此外,主要差异发生在14天之后皮肤切除残余伤口面积是51.84%,39.06%,16.00%,和6.25%,分别在上面的序列一样;这些差异具有统计学意义()。

3.3。组织学检查炎症反应和疤痕形成

组织学分析来确定细胞影响伤口处理不同的纤维支架。脚手架立刻坚持伤口渗出物吸收。我们发现支架集成到新的组织和显示恶化随着时间的推移。他们没有退化在手术后第三天21天,和所有类型的支架植入皮下组织有退化和消失。如图3术后三天,表皮和真皮显示伤口的面积不足,只剩下皮下组织。炎症在每组观察皮下组织和出现在伤口周围的完整的组织。观察炎性细胞在真皮的周边地区,成纤维细胞的增殖和轻微的出血。在伤口愈合的炎症阶段,IBU-loaded组表现出更轻的炎症细胞的浸润程度;尤其是AR-I-PLLA-EF集团的控制炎症反应比I-PLLA-EF组。特别是AR-I-PLLA-EF集团第七天,表皮变得甚至的表面。后21天在AR-I-PLLA-EF组缺陷几乎消失了,伤口充满fibroproliferative组织。表面的伤口是新的上皮覆盖。

马森的三色的染色组织学部分受伤的皮肤样品显示更多的胶原含量(蓝染色)对照组和丙交脂组比IBU-loaded两组随时间(图4)。术后21天,AR-I-PLLA-EF组的胶原蛋白含量低于其他三组。

3.4。bFGF和免疫组织化学检查αsma表达

原位评价bFGF的表达,免疫组织化学的方法是使用。在I-PLLA-EF组和AR-I-PLLA-EF组免疫组织化学显示重要的染色bFGF(图5)。postwounded第三天,在四组bFGF的表达存在弱染色但AR-I-PLLA-EF组中表达较高。术后7天,所有组bFGF的表达增加,仍在AR-I-PLLA-EF组高于其他人。第14天的显著差异是bFGF的表达显示强阳性染色与大面积AR-I-PLLA-EF组。AR-I-PLLA-EF集团的这种优势持续21天稍微表达高于术后第14天。

部分从伤口αsma表达在皮肤伤口后14天的操作(图6)。积极的染色αsma对照组是最强的,减少适当的顺序先后在PLLA-EF集团I-PLLA-EF集团和AR-I-PLLA-EF组。的表达αsma AR-I-PLLA-EF组低于其他三组。

3.5。免疫印迹分析

免疫印迹分析表明,水平的αsma表达减少IBU-loaded组相对于non-IBU-loaded组(图7)。的表达水平αsma在对照组和减少PLLA-EF组最高,I-PLLA-EF组,分别和AR-I-PLLA-EF集团。的表达αsma AR-I-PLLA-EF组中至少四组。

3.6。存在分析

第14天,胶原蛋白的相对表达我(Col-I)和胶原蛋白III (Col-III) AR-I-PLLA-EF组明显不同于对照组()如图8(一个)。Col-I AR-I-PLLA-EF组的表达是最低的四组低于对照组,四倍多的表达Col-III AR-I-PLLA-EF组最低的四组,大约两倍低于对照组。虽然Col-I的相对表达式和Col-III AR-I-PLLA-EF组四组都是最低的,在一个相对高的表达比Col-I Col-III, Col-I / Col-III AR-I-PLLA-EF组的比例仍低于对照组,低近两倍,如图8 (b)()。有趣的是,相对表达式Col-I和Col-III丙交脂组高于对照组,虽然他们之间没有显著的统计学差异,也许由于刺激胶原蛋白沉积的丙交脂脚手架没有伊布·。

如图8 (c)的相对表达TGF -β1、TGF -β3从对照组增加,丙交脂组,分别和I-PLLA-EF集团AR-I-PLLA-EF组轮流。对照组有显著的统计差异和AR-I-PLLA-EF集团与TGF -的表达β1 AR-I-PLLA-EF集团几乎四倍高于对照组和TGF -的表达β3 AR-I-PLLA-EF集团甚至超过8倍高于对照组()。由于相对较高的表达TGF -β3比TGF -β1、TGF -的比率β1 / TGF -β3 AR-I-PLLA-EF组低于对照组,如图8 (d)()。

从对照组,丙交脂组和I-PLLA-EF集团AR-I-PLLA-EF集团相对金属蛋白酶- 1的表达增加,TIMP-1的相对表达降低,如图8 (e)。所以金属蛋白酶- 1的比例/ TIMP-1增加反过来作为显示在图8 (f)。金属蛋白酶- 1的表达AR-I-PLLA-EF集团几乎是三倍高于对照组和TIMP-1 AR-I-PLLA-EF组的表达低于对照组(超过两倍)。和金属蛋白酶- 1的比例/ TIMP-1 AR-I-PLLA-EF组比对照组高出六倍多()。

4所示。讨论

理想的伤口治疗应该加速愈合,减少瘢痕的并发症。然而,无疤治疗是困难的在成年哺乳动物的组织。因此,越来越多的关注已经针对筛选和开发产品,加速伤口愈合和防止疤痕有效(26]。在某些病理条件下,如恶性肿瘤,感染,或炎症,病变可能会降低周围的pH值低于7.4 (27]。一个研究提出的证据表明,早期的发酵期间并发细菌丰度迅速增加,pH值下降迅速,没有任何初始pH值增加(28]。另一项研究还显示,在控制细菌的感染,或在病变区域的pH值增加(29日]。和碱性pH值可以增加biofilm-associated和浮游细菌的抑菌和杀菌活动(30.]。因此,细菌倾向于酸周围的微环境,这是有利于细菌的生长和扩散。因为过度的炎症反应,导致不恰当的细胞外基质沉积会导致过度生长,硬化,和/或瘢痕组织(31日),我们结构化acid-responsive ibuprofen-loaded丙交脂纤维支架控制过度的炎症反应,希望能实现完全再生没有疤痕。

在我们的组织化学研究中,布洛芬有效控制过度炎症愈合过程的早期阶段,和AR-I-PLLA-EF组的炎症甚至比I-PLLA-EF组轻,这是因为从NaHCO布洛芬的加速释放导致了₃。此外,布洛芬可以阻止炎症前列腺素的生物合成,尤其是前列腺素E2 (32,33]。因此,布洛芬可以减轻术后疼痛和瘙痒在某种程度上,这可能有利于和平愈合过程,由于抓挠频率的降低,尤其是对孩子。

除了胎儿皮肤伤口愈合不损伤后炎症反应,山胎儿伤口不同于成人的伤口也在细胞外基质(ECM)成分,生长因子和细胞差异表达,等等(34]。改变其中一个反应可能导致无疤愈合在成年哺乳动物。马森的三色的染色组织学部分显示,对照组和丙交脂组更多的胶原沉积比IBU-loaded两组随着时间的推移。进一步通过存在分析,我们发现的相对表达Col-I和Col-III AR-I-PLLA-EF组明显不同于对照组()如图8(一个);Col-I的表达式和Col-III AR-I-PLLA-EF集团都是最低的四组,同时,相对高的表达比Col-I Col-III, Col-I / Col-III AR-I-PLLA-EF组的比例仍低于对照组,如图8 (b)()。这些结果正好与其他研究[7,17]。bFGF,这是一个强有力的内皮细胞分裂素和化学引诱物,成纤维细胞,和角化细胞可以促进新陈代谢,ECM的增长,中胚层衍生细胞的运动(35]。在我们的免疫组织化学检查,染色AR-I-PLLA-EF组bFGF的强大和染色的面积大于其他组,如图5。这是符合史的研究等。19]在bFGF antiscar影响伤口修复体外和体内,虽然其他研究认为减少FGF活动与无疤伤口愈合(36]。此外,αsma对伤口收缩(至关重要16),在肝纤维化中起着重要的作用,因为它持续myofibroblasts形成肉芽组织(36),这不可避免地导致纤维化瘢痕组织的形成。从我们的免疫组织化学检查和免疫印迹分析,的表达水平αsma AR-I-PLLA-EF组四组最低;AR-I-PLLA-EF集团形成疤痕的潜力,在某种程度上,低于其他群体。

有很多研究关注于TGF -β和表达比率TGF -β1/2和TGF -β在无疤治疗(38,37]。进一步的研究发现,当TGF -β3(−−)小鼠胎儿受伤,伤口愈合疤痕,相反,当TGF -β3管理在成人的伤口,疤痕减少(38,39]。胎儿皮肤完全具有再生的能力,成人无疤治疗可能需要更高比例的TGF -β3 TGF -β1/2,与上述研究结果是一致的。其他重要的分子完全愈合是基质金属蛋白酶和TIMPs。像其他研究暗示有高水平的基质金属蛋白酶表达从裸体小鼠真皮成纤维细胞40)和无疤伤口MMP与TIMP的比例更高,这可能是由于减少的表达TGF -β1,降低MMP和TIMP表达增加,有利于胶原蛋白的积累和疤痕41),我们的研究表明,从对照组,丙交脂组,和I-PLLA-EF集团AR-I-PLLA-EF集团相对金属蛋白酶- 1的表达增加,TIMP-1的相对表达降低,如图8 (e);金属蛋白酶- 1 / TIMP-1的比率增加,显示在图8 (f)。所有这些发现暗示一个完整的和无疤愈合。

5。结论

小说acid-responsive ibuprofen-loaded实际上电纺纤维支架很容易根据NaHCO捏造₃antiscar皮肤愈合。总的来说,这项研究的结果表明,acid-responsive ibuprofen-loaded实际上电纺纤维支架可以防止过度炎症早期伤口愈合的药物载体和细胞再生提供支架实现一个完整的和无疤愈合后期。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

梓鸣元(赵的贡献同样这项工作。

承认

这项工作得到了国家自然科学基金(号。51373112,51003058,81272935)。