文摘

背景。早产儿通常受肠道炎症。因为人类小肠不到期,直到怀孕,早产儿有一个独特的挑战,为急性或慢性炎症可能会改变肠道的正常发展。肿瘤坏死因子(TNF)已经被证明能够敏锐地改变成年老鼠的杯状细胞数量和绒毛长度。在这项研究中,我们检测肿瘤坏死因子的影响绒毛的体系结构和上皮细胞在不同的发展阶段的不成熟小肠。方法。检查TNF-induced炎症的影响,我们注射急性,短暂,或慢性暴露小鼠肿瘤坏死因子在新生儿和青少年。结果。通过肿瘤坏死因子TNF诱导显著绒毛削弱receptor-1 (TNFR1)介导的机制,导致损失的绒毛。这个响应TNFR1信号改变肠道发育期间,尽管常数TNFR1蛋白表达。急性TNF-mediated信号也显著减少Paneth细胞。结论。综上所述,TNF提供造成的形态学变化的影响在发展中肠道炎症。此外,他们建议一种机制,再加上一个不成熟的免疫系统,可能有助于解释独特的易感性NEC等不成熟的肠道炎症性疾病。

1。介绍

对早产儿肠道炎症是一种常见的发生。相对保护子宫内的环境后,新生儿突然暴露于nonmaternal抗原和不正常菌群在重症监护环境(1]。甚至婴儿正常的食物可以导致不成熟的肠道炎症。暴露于公式被证明能增加促炎细胞因子在不成熟的肠2),和母乳的母亲接触到西方饮食已被证实含有大量长链饱和脂肪酸,增加诱发炎症的不成熟小肠(3]。虽然这些数据表明,早产儿的饮食让他们患慢性肠道炎症,慢性炎症的影响在发展中肠并不完全理解。值得注意的是,肠内喂养是最强的一个风险因素发展的坏死性小肠结肠炎(NEC) (4),导致问题的作用feeding-induced慢性肠道炎症可能在感应和疾病的病理生理学。

NEC早产儿的主要是一种疾病,主要影响婴儿出生在最短的妊娠期(4,5]。NEC的发病率是最高的28岁的和相对妊娠32周无论当一个婴儿出生时,表明肠道发育调节的变化敏感性[6,7]。NEC是夸大了炎症的重要组成部分8- - - - - -10)等强大的炎性细胞因子介导的肿瘤坏死因子(TNF)和血小板激活因子(PAF)参谋长(11]。在人类研究中,新生婴儿发达NEC表达明显高于血清TNF水平相比,控制(11),和NEC的动物模型,动物对待anti-TNF抗体疾病的发病率和严重程度较低(12]。我们实验室最近报道,重大发展阶段相关的变化中可以看出肠道杯状细胞粘液分泌TNF暴露后的小鼠回肠8小时(13]。此外,急性暴露TNF介导的早期阶段的组织损伤沙门氏菌肠道感染(14)和绒毛高度的降低会引起烧伤患者(15]。然而,肿瘤坏死因子在NEC的病理生理学的具体作用并非完全已知和背后的机制启动炎症信号代表我们理解的一大空白。

考虑到(1)易感性NEC似乎developmentally-dependent,(2)早产儿肠道炎症经常接触,和(3)肿瘤坏死因子诱导炎症可以发展依赖对肠上皮细胞的影响,我们测试是否TNF诱导其他小肠发育相关的变化。更好地了解不同曝光的炎症会影响发展中肠道,我们肠道的检查组件架构以下几种不同类型的肿瘤坏死因子。在接下来的研究中,我们表明,急性和慢性暴露于TNF都发育阶段影响依赖发展中小肠。

2。材料和方法

2.1。老鼠和TNF注射

TNFR1 C57BL / 6 j−−/,TNFR2−−/,TNFR1−−/2−−/从杰克逊实验室老鼠购买。cd -老鼠从查尔斯河实验室购买。所有的转基因小鼠C57BL / 6 j背景和C57BL / 6 j作为野生型比较。对急性肿瘤坏死因子实验,C57BL / 6 j或cd -小鼠腹腔内注入表示年龄为0.5μg / gbw TNF (PeproTech)和维持8小时分开母亲和没有提要在33°C湿润孵化器(Petiatric.com)。小肠远端1/3的收获和孤立的回肠样本。组织被临时冻结或者Carnoy固定解决方案;组织准备在5免疫组织化学是石蜡包埋和切片μm。慢性肿瘤坏死因子实验,cd -老鼠每周腹腔内注射0.5μg / gbw TNF。注射P7岁开始和结束前一个星期安乐死。在注射,老鼠被安置在正常情况下爱荷华州立大学动物保健设施。在试验的最后一天,组织收获如上所述。动物实验都是根据协议执行机构批准的动物保健和使用委员会在爱荷华大学。

2.2。绒毛形态测量学和细胞数量

回肠部分是沾)(Sigma-Aldrich)。为了最小化分割可变性,所有部分都来自肠道的中心样本只包含完整的绒毛的地区。在每一个样本用于测量,至少3地区统计解剖差异降到最低。测量在每个计算得到至少5个独立的动物。总共至少20个绒毛从3不同区域/各组实验动物进行了分析。绒毛长度和面积测量用10倍目标(100 x总放大倍数)从地下室的入口开放的绒毛。绒毛长度测量通过画一条平分线中心的绒毛。面积是衡量周围画一条线的外部结构。绒毛上皮细胞与60 x目标数(600 x总放大倍数)从地下室的入口处对外开放开始曲线的绒毛小费。至少五个动物的肠道部分总共至少70绒毛各组实验动物进行了分析。 To detect Paneth cells, slides were stained with Alcian Blue/Periodic Acid Schiff stain (Sigma-Aldrich). Cells were quantified with a 60x objective (600x total magnification) by a single blinded investigator. Intestinal sections from at least five animals were analyzed for each experimental group and at least 100 crypts were counted per animal. All data were obtained using a Nikon NiU microscope using Nikon Elements software (Nikon).

2.3。细胞溶解产物,PCR,免疫印迹

回肠样本均质使用TissueLyser LT(试剂盒),然后清除,煮如前所述[16]。蛋白质是由sds - page分离和转移到硝化纤维膜。膜被封锁的1 h Tris-buffered盐水有0.05%渐变20 (TBST)和5%脱脂奶粉,孵化anti-TNFR1主要抗体(圣克鲁斯生物技术)在一夜之间在4°C,并与二次孵化抗体(细胞信号)45分钟。辣根过氧化物酶与西方闪电增强化学发光检测设备(PerkinElmer生命科学)。mRNA量化,回肠样本均质如上和RNA分离使用RNeasy +迷你包(试剂盒)根据制造商的指示。RNA浓度和质量测定使用NanoDrop 1000分光光度计(热费希尔科学)。使用高容量cDNA逆转录合成第一链cDNA装备与核糖核酸酶抑制剂(技术)。定量实时逆转录-聚合酶链反应(存在),使用Taqman快速执行通用PCR反应混合液(2 x)(技术)和Taqman基因表达分析TNFR1引物(技术)。存在反应是运行在一个C1000热循环(埃普多夫)和使用CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad)。10 ng的cDNA使用/反应。 The threshold cycle (CT) value for each well was obtained by using the instrument’s software. Fold change in gene expression was determined by normalizing gene expression toβ肌动蛋白在每个样本。2 方法是用来比较基因表达水平之间的样本。

2.4。细胞凋亡检测

细胞凋亡率在组织学标本测定原位益生元结扎DNA碎片试验(隔离;微孔),我们之前的报道指出17]。

2.5。复制和统计分析

所有数据至少代表三个独立的实验。统计学意义上的差异与单向方差分析评估(方差分析)。测试后对比组用Holm-Sidak多个对比测试。所有的统计数据都使用棱镜执行软件(图垫)。最低级别的意义被设定为< 0.05,误差指定平均数标准误差。

3所示。结果

3.1。回肠绒毛长度显著增加,在特定的发展阶段

我们曾表明,杯状细胞数量的增加小鼠回肠developmental-dependent方式在生命的前4周(13]。来确定回肠高度开发的类似的模式,我们测量了回肠绒毛的长度在不同开发阶段的整个生命的前4周的老鼠。回肠绒毛长度在开发过程中稳步增加(图1(一))。出生并不影响绒毛长度、E19没有区别,P0老鼠。

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图1
急性肿瘤坏死因子降低回肠绒毛长度在特定的发展阶段。(a)的回肠段从小鼠小肠在年龄和绒毛指示长度是显微镜下测量。每个点代表一种动物的平均绒毛长度所产生的平均至少20连续3不同区域/动物绒毛。(b)小鼠肿瘤坏死因子治疗表示年龄和绒毛长度确定(红、肿瘤坏死因子;黑色,控制; 每一个点; 、意义用虚线)。(c)小肠绒毛长度测量好后TNF治疗和控制C57BL6和CD1小鼠(相比 ; 对两株)。(d)代表组织切片在不同发展阶段的例子。
3.2。急性肿瘤坏死因子降低回肠绒毛长度在特定的发展阶段

我们先前已经表明TNF年龄相关性影响肠道粘液生产和分泌13];然而,肿瘤坏死因子的影响在发展中肠道形态成熟小肠仍然未知。要测试这些影响,我们检查回肠与TNF腹腔内注射后8小时。这个时间点是基于我们之前的研究肿瘤坏死因子暴露在不成熟的肠道杯状细胞的数量(13,16]。绒毛长度的老鼠相比,年龄组的治疗。TNF诱导显著的绒毛在P7削弱,好,P21, P28(图1 (b))。相比之下,P0幼仔免受这种效果,建议保护信号通路的存在或响应能力降低TNF在这个发展阶段。确定TNF-induced绒毛削弱特定于C57Bl / 6 j应变,我们重复这个实验好cd -老鼠和比较这些数据结果在C57Bl / 6 j小鼠从图1 (b)。肿瘤坏死因子显著钝化回肠绒毛cd -老鼠(图1 (c))。我们的数据也符合strain-independent效应,但应该注意的是,显示真正的应变独立实验需要更多的线,这是超出了本研究的范围。

3.3。TNF-Induced绒毛削弱由绒毛表面积减少,上皮细胞损失

进一步描述TNF-induced肠道形态学的变化,我们量化上皮细胞衬绒毛横断面图。类似的效果出现在绒毛长度、绒毛上皮细胞的数量没有出生时受到肿瘤坏死因子的影响。然而,在随后的4周,TNF诱导显著降低总上皮细胞相比,控制(图2 (b))。我们下一个测量小鼠肿瘤坏死因子处理的平均绒毛面积相比,控制。控制动物,绒毛面积显著减少生命的第一周,随后大幅增加在第二,第三,第四个星期的生活。TNF治疗出生时没有重大影响但诱导在后世绒毛表面积显著减少( )(图2(一个))。

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图2
急性肿瘤坏死因子诱导回肠绒毛面积减少在开发过程中上皮细胞群。回肠段小肠从控制和收获TNF-treated老鼠显示年龄段。(a)绒毛地区由跟踪周长在尼康元素软件;(b)上皮细胞数字显微镜下量化。数据显示为TNF-induced改变和控制(100%)。从控制在每一个等价的年龄显著差异用星号( ; )。(c)代表组织样本所示。
3.4。肿瘤坏死因子诱导在不成熟的肠上皮细胞凋亡增加

测试如果TNF-induced绒毛高度、表面积,和上皮细胞群可以诱导细胞凋亡,组织学样本好小鼠肿瘤坏死因子是由原位染色处理低聚糖结扎(隔离)相比,检测DNA碎片和控制。小鼠暴露于急性肿瘤坏死因子细胞凋亡明显多于年龄组( )(图3)。


图3
肿瘤坏死因子在不成熟的肠细胞凋亡增加绒毛。好小肠样本被原位染色低聚糖结扎(隔离)相比,DNA碎片和控制。积极事件每25绒毛是显微镜下计算。在事件显著增加TNF-treated集团( ; )。
3.5。需要TNFR1 TNF-Induced绒毛削弱

我们曾表明,肿瘤坏死因子可以影响肠道上皮细胞和肠阻塞的杯状细胞通过TNF receptor-1 (TNFR1)信号13,16]。来确定TNF-dependent影响绒毛长度,面积,和上皮细胞的质量也取决于TNFR1,好TNFR1−−/,TNFR2−−/,TNFR1−−/2−−/小鼠腹腔注射肿瘤坏死因子和回肠绒毛测量比较迷人的控制。肿瘤坏死因子诱导绒毛在野生型和TNFR2削弱−−/老鼠,但老鼠缺乏TNFR1。这TNFR1演示了一个要求,为TNFR2没有作用。同样,TNF治疗诱导损失只有在野生型和TNFR2绒毛区域−−/老鼠,再次证明要求TNFR1的存在。然而,只有野生型小鼠显示上皮细胞数(图的重大损失4)。

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图4
需要TNFR1 TNF-induced回肠绒毛削弱和绒毛区损失。小肠绒毛长度、面积和上皮细胞计数测定小鼠缺乏一个或两个以上TNFRs (R1−−/,R2−−/,或者R1-2−−/)。小鼠肿瘤坏死因子测量和控制相比,相同的压力。数据显示为不同的控件,设置为100%。显著差异( 从控制用星号表示TNF治疗。
3.6。回肠TNFR1表达在开发过程中是恒定的

我们的发现表明TNF-induced绒毛削弱的程度取决于不同的发展阶段。测试是否这些影响是由于回肠成熟度的差异,而不是个体发育的差异TNFR1表达,回肠组织从野生型小鼠在不同年龄和研究通过免疫印迹分析TNFR1表达。在开发过程中未发现显著差异在TNFR1表达(图5)。这一发现很重要,因为它演示了一个发育stage-dependent TNFR1下游效应器,改变反应变化不改变受体表达。


图5
在开发过程中小肠TNFR1表达是恒定的。TNFR1蛋白质表达水平被免疫印迹检测P0 P28老鼠的小肠匀浆。一个代表性的免疫印迹显示。图表显示了平均TNFR1表达指出年龄( 动物/组;肌动蛋白表达规范化;所有年龄相比P0)。没有检测到任何年龄之间的显著差异。
3.7。慢性暴露肿瘤坏死因子诱导绒毛削弱以剂量依赖的方式

由于我们的数据表明急性肿瘤坏死因子的影响发育依赖回肠的体系结构,我们研究了慢性暴露的影响。为此,老鼠用TNF治疗一周一次开始第七页,直到一个星期前安乐死。以这种方式,我们开发了三组老鼠:控制老鼠,老鼠暴露在单一剂量的肿瘤坏死因子在考试前1周(短暂的接触,或B-TNF),和老鼠暴露在每周P7 TNF治疗开始,到最后一个剂量发生前一周安乐死(慢性接触或C-TNF)。使用这种方法,我们研究了ilea老鼠从每组绒毛长度。类似于急性照射,小鼠暴露于慢性肿瘤坏死因子显示绒毛长度的重大损失。老鼠接受短暂的接触(B-TNF)明显比对照组短绒毛,和老鼠处理慢性接触(C-TNF)明显短绒毛比短暂的曝光(图6(一))。确定慢性暴露于TNF将影响TNFR1的水平,我们测量的TNFR1 mRNA水平组织P21小鼠接受B-TNF和C-TNF相比控制。P21我们选择的时间点,因为在这个年龄小鼠慢性收到多个肿瘤坏死因子的剂量,但肠道仍不成熟(而不是被认为是成熟的P28肠)。TNFR1水平没有显著差异在B -或C-TNF组相比,控制(图6 (d))。

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图6
慢性TNF治疗exposure-dependent影响小肠的架构。小鼠肿瘤坏死因子对待安乐死的前一个星期(短暂接触指定为B-TNF),或每周开始P7直到一个星期前安乐死(慢性接触指定为C-TNF)。小肠是收获了(a)绒毛高度,(b)绒毛面积,和(c)上皮细胞数量如上所述。对所有组织, 。括号(a)表示 。星号(b)和(c)表示 肿瘤坏死因子与控制。(d)来确定慢性暴露肿瘤坏死因子影响TNFR1水平,P21 TNFR1 mRNA水平的量化组织的小鼠接受B-TNF和C-TNF相比控制。TNFR1水平没有显著差异。
3.8。慢性TNF时代,存在剂量依赖的相关性对绒毛表面积和上皮细胞数量的影响

慢性肿瘤坏死因子(C-TNF)引起的发育依赖绒毛削弱,我们接下来研究了其对绒毛表面积和上皮细胞数量的影响。而急性肿瘤坏死因子诱导治疗好绒毛面积和上皮细胞数量的减少,21(图2),简短(B-TNF)和慢性(C-TNF)治疗诱导显著增加在区域和上皮细胞计数在这些年龄,建议改变绒毛架构从细长的绒毛短,更广泛的绒毛的慢性炎症(等于面积减少长度)。有趣的是,这一趋势在P28小鼠未见。接触B-TNF诱导显著增加绒毛面积但上皮细胞数量减少,和接触C-TNF诱导绒毛地区没有变化,上皮细胞数量减少。这些效果展示发展stage-dependent影响慢性暴露于TNF在小肠架构(数据6 (b)和6 (c))( )。

3.9。急性但不是慢性TNF诱导TNFR1-Dependent亏损Paneth细胞群

我们的实验室和其他所描述的重要保护作用Paneth细胞不成熟的肠道(8,18- - - - - -20.]。肿瘤坏死因子已被证明是重要的成人肠[Paneth细胞颗粒释放21,22];然而,无论急性或慢性的影响TNF Paneth细胞不成熟小肠不太好描述。检查我们对小鼠急性,短暂,或慢性肿瘤坏死因子暴露如上和量化包含Paneth颗粒细胞的数量在回肠相比控制。老鼠只检查从好到P28成熟Paneth细胞没有出现在老鼠直到P7和P10[之间23,24]。急性肿瘤坏死因子诱导重大损失的粒状Paneth细胞好和P28老鼠(图7(一))( )。然而,老鼠Paneth细胞数量没有区别对待短暂或慢性治疗(图7 (b))。以确定急性TNF-induced Paneth细胞损失TNFR依赖,我们研究肿瘤坏死因子的影响好老鼠缺乏TNFR1 TNFR2,或两者兼而有之。肿瘤坏死因子诱导只在TNFR2粒状Paneth细胞的重大损失−−/老鼠示威要求TNFR1(图7 (c))( )。

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图7
急性肿瘤坏死因子暴露诱发TNFR1-dependent Paneth细胞损失。(a)小鼠治疗急性(注射8小时前收集)TNF曝光和粒状Paneth每个隐窝细胞(100隐窝动物)组织学方法计算 老鼠每条件;括号, )。(b)老鼠接受简短(B-TNF;单一注射1周恢复)或慢性(C-TNF;每周注射)暴露如上和粒状Paneth每个隐窝细胞数;没有观察到显著变化。(c)代表组织部分所示。(d)来确定急性TNF-induced Paneth细胞损失TNFR-dependent,老鼠缺乏一个或两个TNFR治疗急性暴露肿瘤坏死因子( ,星号表示 在R2中−−/老鼠)。

4所示。讨论

早产儿通常受肠道炎症,由于正常接触新的环境因素,通过病理情况下,如肠穿孔和坏死性小肠结肠炎。然而,影响肠道炎症的发展并不完全理解。在这项研究中,我们描述的正常生长模式肠道绒毛。我们下一个提供证据表明急性肿瘤坏死因子暴露在开发过程中可以冲正常绒毛高度。我们也证明慢性肿瘤坏死因子暴露会冲高更重要。这种通过TNFR1-mediated削弱发生机制。自从TNFR1表达通过小肠的发展保持不变,TNF-induced绒毛削弱可能依赖于下游TNF信号在开发过程中差异表达的目标。最后,我们表明,急性TNFR1-mediated信号也诱发显著降低颗粒包含Paneth细胞的数量。综上所述,这些形态变化引起的肿瘤坏死因子暴露可能有助于解释为什么这个细胞因子起着重要的作用在NEC的发展不成熟的肠道。

我们的数据表明,这两个急性和慢性肿瘤坏死因子暴露诱发显著的不成熟的回肠的变化。TNF介导不同的生理效应通过两个独立的跨膜受体,TNFR1, TNFR2 [25,26]。生理水平的肿瘤坏死因子导致优惠TNFR2结扎,促进细胞迁移、增殖和伤口愈合27],而更高的TNF浓度导致TNFR1结扎和随后激活炎症反应(25]。我们实验室最近表明TNF导致TNFR1-dependent,发育stage-dependent肠道杯状细胞分泌粘液的变化13]。同样的,我们在这些实验证明TNF-induced绒毛削弱通过TNFR1-dependent TNFR-2独立的机制。TNFR1是有趣的的发展阶段依赖微分效应的蛋白质含量TNFR1保持不变的生活从出生到4周,当回肠达到成熟。有趣的也是,肿瘤坏死因子对最不成熟的肠道影响很小(P0)尽管类似TNFR1水平。我们最初的假设是最不成熟的肠道会显示肿瘤坏死因子暴露的最大影响。然而,肿瘤坏死因子没有影响绒毛长度、绒毛面积,或上皮细胞计数。这是类似于我们的数据对杯状细胞(肿瘤坏死因子的影响13)和相关临床缺乏发展的NEC在极度早产的婴儿年龄(28]。这些数据暗示一个身份不明的下游目标TNFR1发展阶段相关的表达式或另一个发展stage-dependent充当阻遏TNFR1信号影响。无论哪种方式,这变更TNFR1信号可能是重要的,因为肠道炎症是一种常见的发生在早产儿。

胃肠道的胚胎发生在所有哺乳动物几乎是相同的;然而,发展阶段在出生时可能显著不同物种之间(29日]。虽然人类婴儿已经成熟的肠道在足月分娩,出生的老鼠更早在发育过程中(29日,30.),不达到成熟度级别相当于一项人类婴儿直到出生后4周(1]。因此,前4周的老鼠生活合理近似人类胎儿发育,下半年发展阶段当早产儿最容易发展NEC。因此重要的是要注意,绒毛长度增加的前4周期间生活年龄的函数(图1(一))。

在我们的实验研究肠道慢性炎症的影响,建模两种类型的慢性TNF治疗。短暂的定量检测小鼠单个TNF治疗一周后,检查和慢性给药小鼠一周过去后多个每周TNF治疗。我们的数据表明,这两种类型的慢性暴露于TNF诱导绒毛削弱在好,P21和P28。然而,有趣的是,虽然慢性暴露于TNF诱导失去所有年龄段的绒毛高度、好P21和小鼠显著增加绒毛面积和上皮细胞计数曝光。这表明一个构象的变化从薄长绒毛短,更广泛的绒毛的慢性炎症。这可能是一个补偿机制把绒毛上皮细胞层更接近固有层中大部分适应性免疫细胞存在。有趣的是,这一趋势在P28小鼠未见,再一次展示发展stage-dependent影响小肠肿瘤坏死因子的架构。

我们和其他人最近报道失去Paneth细胞在婴儿发达NEC (18,31日),和我们最近开发了一种新的NEC的两面夹攻模型小鼠,采用Paneth细胞损失开发符合人类疾病的伤害(18]。在这个模型中,发生重大伤病只Paneth消融后细胞,这表明损伤,或丧失,Paneth细胞需要开发NEC。肿瘤坏死因子已被证明导致成年老鼠Paneth细胞脱颗粒(22),因此我们想要确定肿瘤坏死因子会发展中肠的类似的效果。我们的数据表明,急性肿瘤坏死因子显著减少颗粒包含Paneth好和P28小鼠,细胞减少,这是由于TNFR1-dependent机制。有趣的是,慢性暴露于TNF没有影响Paneth细胞群,表明虽然Paneth细胞对肿瘤坏死因子暴露,回肠自然补偿保护Paneth细胞在慢性炎症。这些数据对应于额外的从我们的实验结果显示减少的溶菌酶的表达,一个关键粒状Paneth细胞分泌,在回肠肠状的文化接触肿瘤坏死因子(32]。

总之,我们已经表明,慢性暴露的不成熟的回肠肿瘤坏死因子诱导不仅功能变化,建筑的变化。这些发现可能对阐明NEC的病理生理学有重要的影响。我们最近提出的“自下而上”模式的NEC推测细菌入侵肠道组织主要是通过隐窝,而不是通过绒毛先前认为的技巧(8]。在这个模型中,TNF-induced削弱由feeding-induced或其他慢性炎症可以引起随后减少肠道的腔的内容之间的距离和固有层。这将大大缩短距离增加的能力小肠细菌到达地下室和渗透。这,连同其他肿瘤坏死因子的影响,如损耗的黏液层和脱粒Paneth细胞,可能使细菌更容易渗透到肠道固有层,导致炎症反应和凝固性坏死NEC的特征。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

支持这项工作是由美国国立卫生研究院/趋势[DK083677(澳博)DK097335(澳博)和DK095004 (MRF)],克罗恩氏和结肠炎基金会的美国高级研究奖(MRF),和孩子的奇迹网络(澳博)。