文摘
目的。该研究旨在探讨雌激素受体的影响α(ER -α炎症反应与发展)基因型与1型糖尿病微血管并发症的女孩。方法。152名年轻经常月经来潮女孩诊断为1型糖尿病患者和84名年轻,健康的月经来潮女孩被招募。呃- - - - - -α基因分型是由PCR。血清浓度的17β雌二醇,以及il - 6、TNF -α、VEGF、il - 10,测量。CD4+Foxp3+通过流式细胞术TH17细胞分离和分析。结果。1型糖尿病女孩携带TT基因型的特点是最低的血清雌二醇水平和最高il - 10、il - 6、TNF -α和VEGF。某些细胞因子的水平之间的关系和雌激素受体的基因变异α多态性进行了分析。频率的CD4+Foxp3+TH17细胞也增强了TT轴承女孩与1型糖尿病及相关细胞因子分析的水平。此外,观察血清雌二醇水平和细胞因子浓度之间的相关性。结论。我们建议TT雌激素受体的变体α多态性可能与增强的炎症反应,进而可能导致加速糖尿病retino - 1型糖尿病和肾病的女孩。这一发现可以帮助医生预测糖尿病微血管并发症的发病和进展。
1。介绍
最分析遗传因素的控制自身免疫是某些基因的多态性,在特定的等位基因有助于防止一些自身免疫性疾病。相反,然而,一些基因变异引起这种疾病的发展和发展(1]。
影响自身免疫的另一个因素是性别,女性被认为是更容易开发自身免疫性疾病(2- - - - - -5]。
女性的自身免疫性疾病的患病率可能部分取决于性激素对免疫系统的影响(3,6]。众所周知,一些疾病的自身免疫反应是阻碍怀孕期间,当雌激素的水平很高3,6]。雌激素能够诱导的扩张抑制调节性T细胞亚群)[7- - - - - -9),这使得他们潜在的保护性因素发展的自身免疫性疾病。亚群的功能是显示美国和其他损害在1型糖尿病患者10- - - - - -13]。此外我们发现,亚群的水平,以及他们表达Foxp3的能力,可能部分取决于雌激素受体α多态性,可能同时影响炎症反应在DM1(1型糖尿病)女性14]。
慢性低度炎症与1型糖尿病相关的是通过检测血清生物标志物水平的炎症和可能导致晚期糖尿病微血管并发症的发展:retino——和肾病15,16]。有数据显示,DM1贫困患者的代谢控制有较高的c反应蛋白水平,并产生更多的促炎细胞因子(12,16]。在各种细胞因子参与促进和维持慢性炎症反应、肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)和il - 6系统增加1型糖尿病患者(16- - - - - -19]。肿瘤坏死因子-α和il - 6,反过来,有可能上调血管内皮生长因子(VEGF)的表达,导致新血管形成retino -和肾病进展19- - - - - -21]。此外,肿瘤坏死因子-α和il - 6也显示美国和其他有影响的监管条件和Treg / Th17平衡在1型糖尿病患者11,22,23]。Th17细胞参与炎症和自身免疫性疾病的发病机制和他们也占主导地位在1型糖尿病患者(24- - - - - -27]。
考虑到所有这些,我们旨在检查如果IVSI−397 t > C雌激素受体α多态性与慢性炎症反应有关,与1型糖尿病微血管并发症的女孩。
2。方法
2.1。主题
152年的研究小组由年轻,经常月经来潮女孩被诊断为1型糖尿病人从儿科诊所招募,糖尿病学和内分泌学、Gdańsk的医科大学。患者的平均年龄年。1型糖尿病的定义根据美国糖尿病协会的标准28]。共存的患者自身免疫、慢性,急性炎性疾病被排除在研究之外。在所有检查患者的c -肽水平低于0.5 ng / mL。所有患者接受人性化胰岛素的剂量毫克/公斤。抽样时血糖水平随着肾功能的生化测定,脂质状态、c反应蛋白(CRP)和糖化血红蛋白(HbA1c)监控。
对照组由84名年轻、健康的岁女孩月经来潮年门诊控制访问期间招募。没有自身免疫的迹象,慢性、炎症或肿瘤疾病的采样和在他们的家人没有证据表明DM1披露所确认的医疗记录,实验室检查和实验室检测。
所有女孩的血液收集在卵泡期(2和4之间天)月经周期。此外,血浆17的水平β雌二醇在所有个人决定。所有研究受试者知情同意和遵循赫尔辛基宣言的原则,道德委员会批准Gdańsk的医科大学。
2.2。单核苷酸多态性
基因组DNA的主题是隔绝EDTA-stabilized血液使用血液迷你隔离设备(授权生物技术、波兰)。多态性的呃- - - - - -α分析了基因聚合酶链reaction-restriction片段长度多态性(PCR-RFLP)。DNA扩增了5′-CAACCAAGACTACAAGTAC-CGCGTCAGTGA-3′寡核苷酸作为底漆和5′-AACCAGCGGAAGAGGTCAAGGG-3′寡核苷酸作为反向引物。放大产品(1374个碱基对)孵化为2.5 U限制性内切酶的Pvu II (MBI Fermentas, Inc .)、美国)的16个小时37°C。等位基因大小如下:师:936 + 438 C: 1374 kb。DNA限制性片段可视化紫外线照射下在2%琼脂糖凝胶溴化乙锭染色。
2.3。隔离Th17细胞
肝素化静脉血样收集并用于隔离PBMCs(外周血单核细胞)。
在Ficoll-Uropoline PBMCs被密度梯度分离制备。分析Th17细胞,PBMCs停牌2×10的密度6细胞/毫升和培养RPMI 1640年补充heat-inactivated 5%胎牛血清(FCS)。文化刺激了十四烷酸50 ng / mL的佛波醇酯(PMA)(美国σ)+ 1μ美国ionomycin L /毫升(σ)为4 h的1μL /毫升的莫能菌素(美国BioLegend)。
2.4。流仪染色和分析
细胞被沾anti-CD4抗体(IgG1鼠标Pe / Cy5、克隆RPA-T4 BioLegend,美国),在室温下孵化20分钟。然后细胞内染色的表达与anti-IL17A IL17A (IgG1,美国鼠标FITC、克隆BL168 BioLegend)抗体。表达的细胞表面和细胞内标记评估使用流式细胞仪(美国正欲LSRII)浇注后活细胞由散射特性决定的。建立了积极的信号为每个染色使用适当的控制同形像。数据分析FACSDiva 6.0软件(美国,正欲)。
2.5。细胞因子的测量
血浆细胞因子测定夹杂物的研究。血清il - 6的水平,肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)、血管内皮因子(VEGF)和il - 10测定使用商业酶联免疫吸附测定试剂盒(研发系统,明尼阿波利斯,明尼苏达州。根据制造商的协议,美国)。
2.6。统计分析
结果分析了使用Statistica版本。9.0 (StatSoft, Inc .)、美国)。等位基因频率的构象哈迪温伯格平衡的比例进行了测试测试。分析了正态分布变量与单向方差分析测试。事后近红外光谱测试用于评估统计学意义。比较斜分布变量的非参数克鲁斯卡尔-沃利斯方差分析测试应用。此外,使用多元回归分析发现变量之间的关系。是水平的意义。
3所示。结果
3.1。的IVS1−397 t > C雌激素受体α多态性和患者的临床特征
1型糖尿病的特点女孩参加这项研究展示在表1。基因型频率在DM1组如下:CC, 24.3%, CT, 46.1%, TT, 29.6%,符合哈迪温伯格平衡()。基因型频率在群健康的女孩被CC, 21.4%, CT, 55.9%, TT, 22.6%。DM1之间的基因型分布在统计学上没有不同的病人和健康组(;测试)。患者不同的临床特征IVS1−397 t > C雌激素受体α多态性是相同的年龄,糖尿病持续时间、糖化血红蛋白、体重指数、白蛋白排泄率和血清肌酐水平。然而,我们观察到,女孩轴承CC基因型低BMI和CRP水平相比TT轴承患者(和、职责)。
雌激素浓度,17岁的水平β血清中雌二醇测定天2和4之间的所有检查女孩月经周期。在健康对照组的雌二醇水平CC之间没有差别,CT和TT的变种呃- - - - - -α基因(表2,)。DM1组中,然而,女孩携带CC基因型的特点是最高的雌二醇水平。这种激素的水平是减少T等位基因副本的存在。证实这个观察,我们进行了多元回归分析,发现−397 t等位基因的存在()有显著影响(17)血清水平β雌二醇。患者的年龄(;),以及糖尿病的持续时间(;),没有影响血清雌二醇水平。
此外,分析了群女孩1型糖尿病患者对现有微血管并发症:retino和肾病。结果如表所示3。TT基因型与肾病更常见于DM1女孩相比nephropathy-free DM1对象(表3(a))。同样,TT变体与视网膜病变更常见于DM1女孩比DM1女孩没有这个并发症(表3(b))。
3.2。Th17细胞频率在1型糖尿病女孩根据雌激素受体的基因变异α多态性
提到,我们先前的研究显示之间的关联−397 t > C雌激素受体的多态性α基因和监管CD4的数量特征+Foxp3+T细胞与1型糖尿病(女孩14]。考虑到这样一个事实:在1型糖尿病患者之间的平衡调节性T细胞和他们的对立,Th17,中断22,26,27),我们决定是否以及如何后者细胞的频率取决于−397 t > C雌激素受体α多态性。在分析Th17细胞频率根据雌激素受体的基因变异α多态性,我们发现这些细胞之间的差异,但只有在与1型糖尿病(表群女孩4)。事后近红外光谱测试发现CC和TT运营商之间的显著差异()。
3.3。血清细胞因子水平的分析根据雌激素受体的基因变异α多态性
慢性低度炎症参与开发和糖尿病微血管并发症的发展:retino和肾病。因此,我们旨在分析水平的细胞因子,il - 6、TNF -α血清中VEGF、il - 10,女孩的1型糖尿病患者,找出是否雌激素受体α多态关联的生产。
统计分析表明,DM1女孩与共存微血管并发症有更高水平的il - 6 ()、肿瘤坏死因子-α(),VEGF ()比健康对照组(表5)。此外,这些细胞因子的水平高于DM1女孩与共存的并发症DM1相比女孩免费retino -和肾病。血清il - 10水平,DM1女孩与共存的并发症产生的细胞因子低于其他两组的女孩(表5)。
在下一步我们的工作,我们分析了某些细胞因子的水平和雌激素受体的基因变异α多态性。结果如图所示1。我们发现1型糖尿病女孩轴承TT基因型产生更高水平的il - 6、TNF -α,VEGF与CC和CT同行相比。这些细胞因子水平降低以及C等位基因副本的存在。使用多元回归分析,我们证实存在−397 t等位基因与增加生产的il - 6 (;)、肿瘤坏死因子-α(;),VEGF (;)。相比之下,TT基因型轴承女孩产生il - 10低于CC和CT同行(图1)。多元回归分析表明,−397 t等位基因的存在显著降低了il - 10水平(;)。在所有分析细胞因子事后分析发现CC和TT运营商之间的显著差异()。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.4。协会Th17细胞与细胞因子分析频率
扩展我们的研究在这一领域,我们观察分析细胞因子的浓度之间的潜在关系,血清水平的17岁β雌二醇,CD4的频率+IL17A+Th17细胞与1型糖尿病的女孩。我们发现17之间的负相关β雌二醇水平和il - 6的浓度,TNF -α和VEGF(表6)。此外,Th17细胞的频率呈正相关,这三种炎性细胞因子(表的水平6)。至于il - 10的水平,我们发现它的浓度和血清17之间的正相关关系β雌二醇以及Th17频率(表6)。
4所示。讨论
自身免疫性疾病发病率的增加女性患者带来了极大的兴趣在性激素的调节免疫反应。在本文,我们分析了协会的雌激素受体α多态性与炎症反应与1型糖尿病经常月经来潮女生。类似于我们之前的论文关于IVS1−397 t > C多态性(14),我们发现TT基因型与增强炎症反应有关。TT基因型轴承女孩产生更少的雌二醇和CRP高于CT和CC基因型轴承。这是符合论文关于IVS1−397 t > C ER -α多态性在冠心病的女性29日- - - - - -31日]。研究Herrington et al。30.,31日]表明,CC基因型携带者可能结合雌激素比TT轴承更强烈的个人。因为C等位基因,但不是T等位基因,包含一个功能的转录因子结合位点B-myb,可能的转录上调呃- - - - - -α基因(30.,31日]。减少基因转录导致减少的表达α雌激素受体可能导致雌激素信号,从而减弱其抗炎效果不太有效。这符合研究表明低雌激素浓度增加生产的促炎细胞因子(32- - - - - -34]。TT轴承DM1女孩参加本研究产生更高水平的促炎细胞因子(TNF -α、il - 6和VEGF)比CT和CC运营商。此外,这些细胞因子的生产与血清雌二醇水平负相关。il - 6和TNF -α活化剂的NF -κ核因子B (-κB)通路,微血管并发症的发病机制是一个重要的因素(35]。此外,他们能够移植VEGF表达(19- - - - - -21,36),显示retino在发病机制中发挥作用——和肾病21,37]。相反,VEGF能诱导il - 6和TNF -的生产α(38]。促炎的持续的活动分子发起一个正反馈循环导致微血管病的开发和后续发展(15- - - - - -19]。事实上,在我们的研究与retino DM1女孩或肾病患者中更常见CT / CC基因型比那些TT基因型。我们可以推测,T等位基因负责更严重的炎症反应导致糖尿病并发症的发展更快。炎症相关的TT变体IVS1−397 t > C雌激素受体α多态性是更有可能的,因为DM1女孩轴承TT基因型产生抗炎细胞因子il - 10比CT和CC运营商。这符合研究通过Verthelyi,表明il - 10的水平产生细胞增加雌激素的影响下(39),DM1女孩轴承TT基因型产生这种荷尔蒙在最低的水平。
当前研究的另一个重要的观察是,1型糖尿病女孩携带CD4的TT基因型频率较高+IL17A+T细胞。Th17细胞的激活被认为是参与自身免疫和炎症性疾病(24]。在我们先前的论文显示Th17细胞的患病率在1型糖尿病患者。这项研究是针对一组32岁男性和女性患者和显示之间的负相关Th17细胞和监管CD4水平+IL17A+亚[27]。提出了当前研究结果证实,扩大那些之前报道。此外,Th17细胞的观察到更高的频率在TT公司扩展了以前的工作论文(14),我们表明,TT基因型轴承DM1女孩明显减少的CD4水平+Foxp3+亚群。
进一步确认的促炎效应Th17 DM1学科,我们发现这些细胞频率之间正相关,il - 6的水平,TNF -α和VEGF。有趣的是,这三个促进炎症细胞因子被证明与Th17细胞有关。il - 6,而与糖尿病并发症的发展(19,40),也有利于Th17细胞的分化23]。肿瘤坏死因子-α的细胞因子可能对调节性T细胞产生负面影响,因此他们并没有有效地控制炎症细胞的作用[11,41]。肿瘤坏死因子的生产——就越大α是,越有可能转向Th17 Treg / Th17平衡。此外,Th17细胞能够产生TNF -α直接或间接地(42]。的VEGF的频率也有数据显示,Th17细胞与细胞因子的水平在另一个患者自身免疫,炎症disease-systemic红斑狼疮(SLE) [43]。最后,钟等人发表的研究表明,中和抗体IL17A显著降低VEGF在肿瘤小鼠的数量44]。
总之,高浓度的促炎因子分析(Th17细胞,细胞因子)DM1女孩携带TT基因型促进炎症反应增强,导致对开发和糖尿病并发症的发展。的TT基因型IVS1−397 t > C雌激素受体α多态性在1型糖尿病女孩可能与慢性炎症反应通过有关糖尿病并发症的发病率就越高。这一发现可以帮助医生预测糖尿病的发病和进展retino和肾病。
缩写
| IL: | 白介素 |
| DM1: | 糖尿病1 |
| 亚群: | 调节性T细胞 |
| 肿瘤坏死因子: | 肿瘤坏死因子 |
| VEGF: | 血管内皮生长因子。 |
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
承认
这项工作是支持的国家科学研究委员会ST28 (Gdańsk医科大学的)。