文摘

骨骼肌炎症和萎缩与代谢障碍如胰岛素抵抗密切相关。槲皮素、天然多酚类黄酮素,引起抗炎和抗氧化活动。在这项研究中,我们研究了影响obesity-induced小鼠骨骼肌炎症和萎缩。雄性C57BL / 6小鼠正常饮食的情况下,高脂肪饮食(HFD),和一个HFD补充九周的槲皮素。槲皮素减少炎性细胞因子水平和巨噬细胞积累的骨骼肌HFD-fed肥胖的老鼠。它也降低了成绩单和蛋白质含量的具体萎缩性因素,Atrogin-1 MuRF1,骨骼肌的HFD-fed肥胖老鼠,防止肌肉的减少和肌肉纤维的大小。体外,槲皮素显著减少炎症和激活受体的转录水平的信号分子(ERK, p38 MAPK和NF - B)在cocultured肌管/巨噬细胞,这是伴随着萎缩性因素的表达。在一起,这些发现表明,槲皮素可以减少obesity-induced骨骼肌萎缩通过抑制炎症受体及其信号通路。槲皮素可能对预防obesity-induced肌肉炎症和sarcopenia是有用的。

1。介绍

骨骼肌是最丰富的组织,与各种各样的生理功能,因此肌肉损失结果不仅在物理障碍,而且在代谢障碍1]。炎症介质如肿瘤坏死因子-α(TNFα)和白细胞介素- 6 (il - 6)是分解反应的重要介质,如蛋白质损失和代谢紊乱,如胰岛素抵抗[2]。他们促进蛋白质降解上调表达的两个阳性泛素E3-ligases,盒蛋白质(MAFbx / Atrogin-1),和肌肉无名指蛋白1 (MuRF1),参与了泛素蛋白酶体通路,所以导致骨骼肌萎缩(3]。最近的研究表明,肥胖是与骨骼肌损失和功能障碍,称为sarcopenic肥胖(4]。很可能obesity-induced炎症,特点是增加巨噬细胞浸润和水平的炎性细胞因子/趋化因子(如肿瘤坏死因子α;单核细胞化学引诱物蛋白1,MCP-1) [5- - - - - -7),与肌肉萎缩。鉴于肌肉萎缩和炎症加剧obesity-induced胰岛素抵抗[8),抑制饮食组件obesity-induced骨骼肌炎症和/或萎缩对预防肥胖引起的代谢紊乱可能是有用的。

槲皮素(3,3′,4′,5,7-pentahydroxyflavone)是一种多酚类黄酮化合物中发现许多食物来源和深入追究其影响健康抗氧化和抗炎等多个活动(9- - - - - -12]。我们先前表明,槲皮素抑制趋化因子的释放,如巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1α/ CCL3)从cocultured脂肪细胞/巨噬细胞通过干扰炎症信号(13),也减少脂肪积累通过抑制巨噬细胞炎症和细胞因子释放在肥胖的脂肪组织14]。有趣的是,这类黄酮还能抑制氧化应激和/或unloading-derived废弃的骨骼肌萎缩在骨骼肌细胞和肌肉组织15,16]。然而,目前尚不清楚是否可以预防肥胖引起的骨骼肌炎症和萎缩。

在目前的研究中,我们首次证明槲皮素通过减少obesity-induced减少骨骼肌萎缩肌肉炎症,它通过抑制炎症受体信号。槲皮素可能有助于防止obesity-induced sarcopenia和sarcopenia-related代谢失调。

2。材料和方法

2.1。动物

八周大的雄性C57BL / 6小鼠分别安置在一个特定的无菌动物设施,12-12 h光暗周期。老鼠正常饮食(RD)(13%的热量以脂肪从大豆油;美国麦迪逊,哈伦Teklad WI),高脂肪饮食(HFD)(60%的热量以脂肪的猪油和大豆油;研究饮食公司,新布伦瑞克,新泽西州,美国),或者一个HFD补充槲皮素为0.05% (0.05 g槲皮素/ 100 g的饮食)槲皮素(HFD / Q0.05)或0.1% (HFD / Q0.1) 9周。槲皮素是购自Jena生物科学GmbH德国耶拿。动物有免费的食物和水。所有动物实验动物伦理委员会批准韩国蔚山大学和符合国家卫生研究院的指导方针。这些动物被有限公司2窒息,他们的肌肉解剖。

2.2。细胞培养和治疗

鼠标C2C12成肌细胞细胞系和单核细胞/ macrophage-like细胞株Raw264.7从美国购买类型文化(美国马纳萨斯写明ATCC)集合。的C2C12成肌细胞(5×105细胞在37°C /毫升)种植有限公司5%2杜尔贝科的修改鹰的介质(DMEM)(美国纽约Gibco)含10%胎牛血清的边后卫(Gibco)、青霉素100单位/毫升,100年μg / mL链霉素(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)和20μg / mL庆大霉素(Gibco)。当细胞融合达到了100%,中分化培养基所取代,包括马血清DMEM + 2% (Gibco),后改变了2天。Raw264.7细胞培养融合在37°C公司的80%降至5%2RPMI介质(Gibco)包含10%的边后卫,青霉素100单位/毫升,100年μg / mL链霉素(表达载体),20μg / mL庆大霉素(Gibco)。coculture, Raw264.7细胞分离有0.05% trypsin-EDTA (Gibco)和相应Raw264.7细胞融合成肌细胞的数量的25% (8 - 10×105成肌细胞/ 24-well板)是直接播种到文化板块包含3 day-differentiated在无血清DMEM肌管。肌管和Raw264.7细胞cocultured(有限公司)。控制,同样数量的Raw264.7细胞和肌管单独和混合培养后收集/收获,命名为混合物(混合),FFA治疗条件一样,命名为/ FFA混合。cocultures孵化24 h,治疗后500年μM软脂酸(FFA)在无血清DMEM包含50μM BSA(公司/ FFA)。棕榈酸(σ)溶解在乙醇和共轭与BSA 10: 1克分子比之前使用。建立肌管和巨噬细胞都使用50μ槲皮素在血清DMEM的1 h (Co / FFA / Q)。等量的DMSO被用作控制quercetin-treated集团。孵化后,文化上层清液通过elisa收集测量细胞因子浓度;同时样品的细胞被洗两次与PBS和细胞溶解在试剂盒试剂(表达载体)定量实时聚合酶链反应和免疫印迹分析裂解缓冲。

2.3。实时定量聚合酶链反应

腓肠肌肌肉组织收集并存储在RNAlater−20°C(美国Ambion、奥斯汀、TX)。50毫克肌肉组织的总RNA提取样本,或与试剂盒细胞细胞溶解试剂(表达载体)。两个微克整除的总RNA反向转录使用M-MLV逆转录酶(WI Promega,麦迪逊,美国)。存在放大在重复执行的cDNA SYBR预混料交货Taq工具包(豆类生物Inc .)、福斯特、钙、美国)使用一个热循环骰子(豆类生物有限公司、日本)。所有反应都是根据执行相同的时间表:95°C 10 s紧随其后的是40 95°C的周期5 s为30年代和60°C。结果分析与实时系统TP800软件(豆类生物Inc .)和所有值归一化辅助基因的水平β肌动蛋白。中使用的引物分析表中列出1。

表1
老鼠引物用于存在。
2.4。测量细胞因子的蛋白质

腓肠肌肌肉(100毫克)均质在1毫升Tris-HCl 100毫米和250毫米的蔗糖缓冲区(pH值7.4)补充0.25%的蛋白酶抑制剂的鸡尾酒在10000 g(σ)和离心10分钟在4°C。肿瘤坏死因子的水平α文化和组织匀浆或MCP-1上层清液由酶联免疫吸附分析(elisa)测定使用TNF OptEIA老鼠α和/或MCP-1集(美国新泽西州BD生物科学)。大量的细胞因子调整蛋白质含量的匀浆测定BCA蛋白质化验设备(美国皮尔斯,罗克福德,IL)。

2.5。西方墨点法

老鼠被有限公司2窒息。短暂,腓肠肌肌肉组织被切割,立即在液态氮冷冻。蛋白质提取、组织和细胞培养中均质裂解缓冲包含150毫米氯化钠,Tris-HCl 50毫米,1毫米EDTA, 50 mM氟化钠,10毫米Na4P2O7,1% IGEPAL, 2毫米Na3签证官4蛋白酶抑制剂的鸡尾酒,0.25%,1%磷酸酶抑制剂鸡尾酒(σ)。匀浆是离心机在12000 g 20分钟在4°C。50个样品μg和10μg总蛋白提取自组织和细胞培养,分别受到使用多克隆抗体CD68免疫印迹分析,MuRF1,核因子k光多肽基因增强剂b细胞抑制剂α(我κBα,圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国),和磷酸化细胞外signal-regulated激酶(p-ERK1/2) ERK1/2,磷酸化p38增殖蛋白激酶(p-p38 MAPK),和p38 MAPK(细胞信号,丹弗斯、马、美国)。α微管蛋白被用作加载控制,测量用鼠标α微管蛋白抗体(美国马Abcam)。

2.6。组织学分析

一夜之间,腓肠肌肌肉被固定在室温下10%甲醛和嵌入石蜡。Eight-micron-thick部分是沾hematoxylin-eosin()),安装在玻璃幻灯片,并与一个Axio-Star +显微镜观察。肌肉纤维的直径测定使用显微镜AxioVision软件(卡尔蔡司,哥廷根,德国)。五个微观领域为每个样本被数在200 x放大。

2.7。统计分析

结果给出了意味着±标准平均误差(SEM)。变量使用学生的比较 以及或方差分析(方差分析)和邓肯的多个测试。差异被认为是重要的 。

3所示。结果

3.1。槲皮素对炎症反应的影响的骨骼肌HFD-Fed老鼠

我们首先研究了槲皮素对骨骼肌的影响炎症。如数据所示1(一)和1 (b),HFD-fed小鼠肿瘤坏死因子等炎性细胞因子水平上升α和MCP-1与RD-fed老鼠相比,暴露于槲皮素减少这些影响。骨骼肌转录和蛋白质水平的F4/80和CD68 HFD-fed更高的老鼠比RD-fed老鼠,也减少了槲皮素剂量依赖性的方式(数字1 (c)和1 (d))。随后,我们检查了槲皮素对炎症的影响受体如肿瘤坏死因子受体超家族成员9 (4-1BB)和toll样受体4 (TLR4),来促进obesity-induced在骨骼肌炎症反应17,18]。炎症性受体的转录水平低的骨骼肌HFD / Q0.05 -和HFD / Q0.1-fed HFD-fed的老鼠比老鼠(图1 (e))。

(一)
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(b)
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(c)
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(e)
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图1
槲皮素对obesity-induced骨骼肌炎症反应。八周大的雄性C57BL / 6小鼠喂养正常饮食(RD),高脂肪饮食(HFD),或一个HFD补充槲皮素(HFD / Q0.05) 0.05%或0.1%槲皮素(HFD / Q0.1) 9周。((a)、(c) (e))中存在细胞因子的分析记录(TNFα和MCP-1)、巨噬细胞标记(F4/80和CD68)和炎症(4-1BB和TLR4)受体在腓肠肌肌。β-actin基因的mRNA水平规范化水平。(b)蛋白水平的细胞因子TNFα,MCP-1衡量ELISA。(d)和CD68α-tubulin被西方墨点法确定。乐队的强度测量densitometrically使用ImageJ软件。数据意味着±6动物每组的扫描电镜。 和 HFD和RD组之间; 和 HFD之间/ Q0.05 HFD / Q0.1组和HFD组。
3.2。槲皮素对Obesity-Induced骨骼肌萎缩的影响

骨骼肌萎缩的特点是减少肌肉和纤维尺寸(16,19]。槲皮素并没有改变食物摄入量和体重HFD / Q0.05-fed有倾向的老鼠体重增加的更少比HFD-fed老鼠,正如前面报道(14),但不是不同于HFD / Q0.1-fed老鼠(表2)。如图2(一个)骨骼肌重量的比率,全身重量比RD-fed低HFD-fed老鼠,这是HFD预防减少/ Q0.05 -和HFD / Q0.1-fed老鼠。同样,组织学检查腓肠肌横截面显示肌纤维直径是高HFD / Q0.05 -和HFD / Q0.1-fed老鼠比HFD-fed老鼠(图2 (b))。接下来,我们研究了槲皮素对萎缩性的表达的影响因素。如图2 (c)、萎缩性Atrogin-1基因的表达和MuRF1调节HFD-fed老鼠中,但不是在HFD / Q0.05 -和HFD / Q0.1-fed老鼠。MuRF1蛋白水平也显著降低HFD / Q0.1-fed老鼠相比HFD-fed老鼠和相似水平的RD-fed老鼠(图2 (d))。

表2
体重、食物摄取和器官重量。
(一)
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(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
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图2
槲皮素对obesity-induced骨骼肌萎缩的影响。(a)比率的股四头肌(四)、腓肠肌(Gastr)和比目鱼肌重量,整个身体的重量。(b)的意思是腓肠肌肌纤维的直径。显微镜的直径测定AxioVision软件。每样5微观领域在200 x放大计算。(c)中存在的萎缩性基因的表达分析Atrogin-1和MuRF1腓肠肌肌。相对β-actin基因的mRNA水平被规范化水平。(d) MuRF1α-tubulin由西方墨点法。乐队的强度与ImageJ MuRF1和α-tubulin测量软件。数据意味着±6动物每组的扫描电镜。 和 HFD和RD组之间; 和 之间的HFD / Q0.05 HFD / Q0.1和HFD组。
3.3。槲皮素对炎症反应的影响和表达的萎缩性因素Cocultured肌管/巨噬细胞与棕榈酸治疗

因为巨噬细胞和游离脂肪酸增加肥胖的骨骼肌(20.,21),我们cocultured C2C12骨骼肌肌管(Mb) Raw264.7巨噬细胞(MQ)的棕榈酸(FFA)模仿肥胖的微环境,与槲皮素处理细胞。槲皮素显著抑制炎性细胞因子肿瘤坏死因子的转录和蛋白质含量的增加α和在这些cocultures MCP-1(数据3(一个)和3 (b))。记录的其他细胞表面分子参与炎症反应,包括4-1BB和TLR4,明显减少了槲皮素(图3 (c))。同意这个,coculture Mb / MQ的FFA的磷酸化ERK和p38 MAPK和退化的我κBα,而这些炎症信号分子的激活显著地抑制了槲皮素(人物的存在3 (d)和3 (e))。此外,coculture Mb / MQ和FFA强烈萎缩性基因的表达增加Atrogin-1 MuRF1,和肥胖的骨骼肌(图2 (c)),这增加抑制了槲皮素(图4(一))。槲皮素还发现减少的MuRF1蛋白质水平cocultured Mb / MQ FFA(图处理4 (b))。

(一)
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(b)
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图3
槲皮素抑制炎症反应在cocultured肌管和FFA巨噬细胞治疗。C2C12肌管(Mb)与Raw264.7 cocultured巨噬细胞(M⌀) 24 h (Co)然后处理500μM棕榈酸在接下来的24小时(公司/ FFA)。控制,同样数量的M和M⌀被收集后单独培养和混合/收获,命名为混合物(混合),FFA治疗条件一样,命名为/ FFA混合。建立了Mb和M⌀使用50μM槲皮素在血清DMEM的1 h (Co / FFA / Q)。(一),(c))中存在的分析记录的炎性细胞因子(TNFα和MCP-1)和炎症受体(4-1BB和TLR4)。(b)蛋白质含量TNFα和MCP-1释放到培养基被ELISA测定。(d)磷酸化ERK的兵,磷酸化p38 MAPK, p38 MAPK, IκBα,α-tubulin取决于西方墨点法。(e)的强度乐队使用ImageJ测量。三个独立的数据意味着±SEM一式三份的实验。 , , 公司之间的差异/ FFA组和混合,混合/ FFA,或公司团体。 和 公司之间的差异/ FFA / Q和Co / FFA组。
(一)
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(b)
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图4
槲皮素抑制萎缩性的表达因素cocultured肌管和FFA巨噬细胞治疗。C2C12 Mb是cocultured⌀24 h,然后处理500μM FFA在接下来的24小时。槲皮素(50μM)添加1 h coculture开始之前,和DMSO作为控制。(a)中存在萎缩性基因的分析记录,包括Atrogin-1和MuRF1。(b)表达式MuRF1和α-tubulin取决于西方墨点法。乐队的强度测量使用ImageJ软件。三个独立的数据意味着±SEM一式三份的实验。 公司之间的差异/ FFA组和混合,混合/ FFA,或公司团体。 和 公司之间的差异/ FFA / Q和Co / FFA组。

4所示。讨论

骨骼肌炎症中起着至关重要的作用在肌肉萎缩和系统性的代谢功能障碍(5,22]。人们认为骨骼肌肉的比例增加了10%,总体重与胰岛素抵抗的风险减少11% (23]。因此,预防骨骼肌炎症和/或萎缩已经预测来提高obesity-induced代谢失调(19]。研究表明,槲皮素增加骨骼肌线粒体功能和减弱胰岛素抵抗在肥胖的老鼠24,25]。它还减少循环炎症标记物在高脂肪饮食的老鼠26),在骨骼肌基因肥胖小鼠的炎症反应27]。然而,目前尚不清楚是否槲皮素保护肥胖引起的骨骼肌炎症和萎缩。

我们首先研究了槲皮素的影响在obesity-induced骨骼肌炎症。槲皮素减少炎性细胞因子/趋化因子(TNF水平α和MCP-1)骨骼肌的HFD-fed肥胖老鼠,这种抑制作用被证实与FFA cocultured肌肉细胞/巨噬细胞治疗。鉴于槲皮素可以降低FFA的血浆浓度在遗传肥胖老鼠朱克(28),减少炎性细胞因子的槲皮素可能与减少循环FFA相关部分。接下来,我们询问是否减少骨骼肌炎症的槲皮素防止肥胖引起的骨骼肌萎缩。Atrogin-1和MuRF1被认为是关键球员在骨骼肌萎缩的发展,促进蛋白质的降解3]。功能研究表明,消融Atrogin-1或MuRF1保护小鼠免受肌肉萎缩,而过度Atrogin-1降低肌小管细胞大小(29日,30.]。有趣的是,我们发现槲皮素补充剂预防obesity-induced减少肌肉和纤维尺寸的骨骼肌HFD-fed肥胖的老鼠。符合这一点,表达萎缩性因素Atrogin-1 MuRF1表达下调,表明槲皮素预防obesity-induced骨骼肌萎缩,可能通过抑制肌肉炎症。

应该注意的是,转录的蛋白质连接Atrogin-1和MuRF1受到信号通路如ERK, p38 MAPK和我κ核因子B激酶(IKK) / kappa-light-chain-enhancer激活B细胞(NF -κB) (20.,31日- - - - - -35]。因此,槲皮素的保护作用可能通过抑制这些激酶的磷酸化和大概的NF -κB激活。事实上,我们发现,激活的炎症信号分子显著地抑制了槲皮素的存在,表明槲皮素的保护作用与肌肉萎缩是由抑制炎症信号传导和细胞因子的释放。像obesity-induced脂肪炎症,骨骼肌炎症的特征是与肌肉细胞,巨噬细胞浸润和他们的互动,这增加了生产中扮演着关键角色的炎性细胞因子(7,20.]。补充我们证实,槲皮素显著降低了成绩单和CD68 macrophage-specific标记的蛋白质含量和骨骼肌的F4/80 HFD-fed肥胖老鼠,表明它在阻止巨噬细胞积累,这是符合我们体外观察到抑制巨噬细胞的趋化现象的活动(13]。因此,巨噬细胞浸润减少了槲皮素可能会降低巨噬细胞/肌细胞之间的相互作用,促进他们的炎症反应7,17,这可能是有利于减少骨骼肌炎症。

通常炎症受体等的toll样受体)和肿瘤坏死因子受体超科(TNFRSF)参与启动obesity-induced炎症反应。例如,绑定的远期运费协议TLR4导致下游信号激活炎症信号分子如MAP激酶ERK和p38 [36,37]。同时,参与4-1BB (TNFRSF9)与其配体4-1BBL (TNRSF9)可以激活炎症信号通路MAP激酶参与T细胞和巨噬细胞38),而我们也表明4-1BB / 4-1BBL交互在脂肪细胞/巨噬细胞或肌肉细胞/巨噬细胞促进obesity-induced脂肪和肌肉炎症(17,39];因此炎症受体表达及其信号被认为是有用的目标,防止obesity-induced炎症(17,39]。有趣的是,我们发现槲皮素减少炎症受体TLR4的成绩单和4-1BB在骨骼肌中,以及在Mb / MQ cocultures。此外,在cocultures也抑制磷酸化ERK和p38 MAPK和退化的我κBα,这些信号通路的下游组件由炎症激活受体(17,39,40]。这些发现表明,减少炎性细胞因子在肥胖的骨骼肌的生产槲皮素可能至少部分炎症的差别归因于对这些受体本身和抑制炎症的信号。

总之,本研究首次表明,槲皮素可以防止obesity-induced骨骼肌萎缩通过抑制炎症反应。这些影响炎症的差别与对这些受体TLR4 4-1BB和抑制炎症信号通路(图5)。槲皮素可能是一个有用的饮食对预防obesity-induced肌肉炎症和sarcopenia组件。


图5
槲皮素对的示意图表示obesity-induced骨骼肌炎症和肌肉萎缩。肥胖导致巨噬细胞浸润和FFA增加骨骼肌。巨噬细胞释放炎性细胞因子和/或肌肉细胞直接接触,导致炎症信号通路的激活,也通常诱导FFA的绑定。atrogenes的炎症信号通路诱导表达。这将导致肌肉的损失,和这些变化最终导致当地和系统性胰岛素抵抗。槲皮素能抑制巨噬细胞浸润和激活的炎症通路,导致萎缩性基因的表达减少。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Ngoc德勒和金Chu-Sook贡献同样这项工作。

确认

这项工作是支持的科学研究中心项目(食品与营养基因组学研究中心授予2008 - 0062618)的韩国NRF由韩国政府(最高明的)和一个联盟授予由最高明的(2012 r1a2a4a01002702)。