文摘

核苷酸的尿苷联结(UTP)释放到细胞外环境作为信号分子通过激活特定的嘧啶受体(P2Y)。P2Y受体G protein-coupled受体表达在许多细胞类型。这些受体调节几个细胞反应和它们参与细胞内钙动员。我们调查的角色前列腺素类铂族元素₂P2Y信号在小鼠胚胎成纤维细胞(mef),因为这些细胞参与不同的个体发生的和physiopathological过程,其中包括促炎激活后组织修复。有趣的是,这^{2 +}动员引起UTP-dependent P2Y激活降低了铂族元素₂当这个前列腺素类是由mef转染与cox - 2或铂族元素₂是体内添加到培养基中。这个Ca^{2 +}动员是重要的成纤维细胞的不同代谢途径的激活。此外,抑制cox - 2与选择性coxibs阻止UTP-dependent P2Y激活这些细胞。铂族元素P2Y反应的抑制作用₂包括PKCs的激活和PKD,响应,可以抑制后药理这些蛋白激酶的抑制。此外,铂族元素₂降低了成纤维细胞迁移引起P2Y-agonists UTP等。综上所述,这些数据表明,铂族元素₂参与调节P2Y信号在这些细胞。

1。介绍

P2受体purinergic受体选择性腺苷5′联结(ATP)、腺苷5′二磷酸(ADP)、尿苷5′联结(UTP)和尿苷5′二磷酸(UDP)。这些核苷酸作为细胞外信号分子和发挥他们的活动绑定并激活特定的膜受体,设计P2受体(1,2]。有两个家庭的P2受体结构不同:P2X ionotropic离子通道受体和P2Y metabotropic G protein-coupled受体(3- - - - - -5]。目前,七P2X亚型和八个P2Y受体亚型是公认的,包括受体敏感嘧啶和嘌呤(6]。受体为嘌呤和嘧啶核苷酸参与许多神经元以及nonneuronal机制,包括短期purinergic信号如神经传递、神经调节,神经分泌、免疫反应、炎症、血小板聚集,血管舒张,和长期purinergic信号的细胞增殖,分化,运动性和死亡在发展和再生7]。

目前,有八个接受P2Y受体:P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2Y11, P2Y12, P2Y13, P2Y14 [8,9]。metabotropic受体,耦合的磷脂酶C (PLC),可以激活不同的核苷酸,这取决于P2Y受体和物种研究[10]。核苷酸释放到细胞外介质后这些受体受到刺激导致增加细胞内甘油二酯(DAG)和肌醇联结(IP3),后跟一个释放的钙从细胞内的商店11,12]。这些受体广泛分布于多种细胞类型;他们的存在在成纤维细胞被冈田克也首次报道等。13]。成纤维细胞对炎症和损伤,参与组织损伤后的修复阶段,或在其他病理情况下,如血管硬化(14]。

前列腺素E₂(铂族元素₂)是一种重要的化工介质产生花生四烯酸通过环氧酶通路。铂族元素的各种生物效应₂由四个受体称为e前列腺素类受体(EP1 EP4),这是G protein-coupled膜受体(15]。EP1导致细胞内钙的动员。这在胞内钙瞬态变化^{2 +}改变了许多蛋白质的活动,包括几个PKC亚型。因此,铂族元素₂唤起Ca^{2 +}——PKC-mediated效应细胞表达EP1 [16]。EP2 EP4信号生成增加细胞内的环腺苷酸(集中营)的水平,而EP3导致减少细胞内营水平(17,18]。然而,除了EP-mediated效果,后卫可能产生其他EP-independent行动,例如,通过purinergic信号(19,20.]。

综上所述,两种信号通路产生DAG和IP3,促进Ca^{2 +}动员。这个变更可能会影响一些蛋白质的活动,如PKC和,事实上,以前的工作描述,G protein-coupled受体的信号是由机制涉及PKC等蛋白激酶(21]。虽然它已经表明,铂族元素₂是一个强有力的抑制剂的purinergic信号由一些purinergic受体(19,20.),还不知道这种潜在的动力分配和P2信号作为一种机制之间的相互整合炎症和细胞外核苷酸的存在。在目前的工作我们有调查之间的这种相互作用动力分配和P2受体在小鼠胚胎成纤维细胞(mef)。我们的数据在巨噬细胞和扩展以前的工作表明,这两个通道之间的通信功能mef添加新块知识了解纤维母细胞活动可能受到这些双重信号通路。

2。材料和方法

2.1。试剂

UTP、离子载体和标准试剂来自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。DFU来自默克公司(美国新泽西州的法律)。前列腺素E₂从开曼群岛化学(美国安阿伯市MI)。Go6976、Go6983 Go6850,标准信号通路抑制剂Calbiochem(美国圣地亚哥,CA)。Fura-2 /我从英杰公司(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。细胞因子是来自PeproTech(英国伦敦)。抗体P2Y2、P2Y4 P2Y6受体来自Alomone实验室(耶路撒冷,以色列)和其他抗体来自圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯、钙、美国),从细胞信号(丹弗斯、马、美国),或者从以前描述的来源(22]。对电泳试剂来自Bio-Rad(美国大力神,CA)和Sigma-Aldrich。组织培养的菜肴是猎鹰(美国新泽西州林肯公园)和文化媒体表达载体。

2.2。动物

cox - 2野生型小鼠(WT)和COX-2-deficient,混合背景129 sv和C57BL / 6,从杰克逊实验室获得。老鼠被安置在12 h光/暗周期和提供食物和水随意。动物照顾根据协议经伦理委员会批准的机构(以下指令2010/63 /欧盟的欧洲议会)。

2.3。制备小鼠胚胎成纤维细胞(mef),细胞培养,mef不朽

mef准备从WT E14.5胚胎和COX-2-deficient老鼠。简单地说,雌性老鼠被公司实施安乐死₂在14.5后的观念。使用剪刀时,腹部被打开和胚胎卵黄囊完整的孤立。基因分型的卵黄囊摘除和留存。每个胚胎的头和内脏被丢弃。切割胚胎经过18 g针驱散细胞(23]。mef培养(2×10⁶细胞每60毫米盘或12-multiwell盘子2×10的密度⁵细胞/)在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)补充10%胎牛血清的边后卫,100 U /毫升青霉素,100μ在37°C g / mL链霉素,5%的公司₂(24,25]。和主要MEF转染SV40的大t抗原表达载体使用Lipofectamine 2000(表达载体),根据制造商的指示,获得无限增殖MEF细胞系(称为MEF WT, KO,或KI-carrying cox - 2转基因)。

2.4。转染

ectopically表达cox - 2, COX-2-deficient mef和4是暂时性的转染μ克的质粒DNA(每6-well板)使用Lipofectamine 2000指令后的试剂供应商。简而言之,MEF细胞融合暴露了70% - h Lipofectamine试剂包含pPyCAGIP-COX-2 pPyCAGIP或控制向量。年底这段时间,转染媒体取代新鲜中含有10%的边后卫。cox - 2的表达是由蛋白质印迹。

2.5。测定铂族元素₂通过酶免疫分析法

铂族元素₂积累在培养基测定。化验、WT和KI (COX-2-deficient mef overexpressing cox - 2) mef镀在6-well板密度为1.5×10⁶细胞/在2毫升DMEM和治疗在没有或有限合伙人的存在(200 ng / mL) +细胞因子(IFN -肿瘤坏死因子-,il - 1,20 ng / mL) 18 h在37°C。文化上层清液在12000×g离心5分钟和铂族元素₂水平取决于特定的免疫测定(DetectX前列腺素E₂美国阿伯化验,安阿伯MI),根据制造商的指示。

2.6。钙动态分析

mef附加到盖玻片孵化在洛克的解决方案(如前所述)(20.]。purinergic受体受体激动剂的作用是化验near-maximal有效浓度(100μ(UTP)26]。在其他的研究中,5μ米铂族元素₂申请前5分钟核苷酸灌注在前列腺素类的存在。药理抑制剂使用时,他们在指定的浓度和preincubated所需倍中指定文本和数字的传说和前列腺素类孵化期间保持和/或purinergic受体激动剂刺激。在340年和380年双激发后纳米荧光被记录和分析。背景信号减去从每个波长和F_340年/ F_380年比例计算(27]。或者,在某些情况下(在相应的指示图的传说),钙动员测量使用nonratiometric Fluo-4直接探测(表达载体),以下供应商的指示。在这种情况下,改变荧光测定的荧光显微镜(观察者Z1,计划目标高度消色透镜,蔡司)配有Cascade1K相机,使用Axiovision 4.8成像分析程序和表达为反应细胞的百分比。视频calcium-dependent荧光成像的通量也收购了。

2.7。RNA分离和定量PCR (qPCR)分析

1μg总RNA的提取与三试剂(Ambion,生活技术),使用Transcriptor反向转录合成第一链cDNA工具包为rt - pcr的迹象后,制造商(罗氏)。实时PCR进行SYBR绿色(罗氏)MyiQ实时PCR系统(Bio-Rad)。鼠标EP1 TaqMan探针,EP2, EP3, EP4, P2Y2, P2Y4用于本研究从应用生物系统公司购买和实验验证的每个TaqMan探针扩增效率进行设置(28,29日]。PCR热循环参数95°C 10分钟,40 95°C的周期15秒,1分钟和60°C。每个样品一式两份,并规范化运行36 b4的表达。折叠感应(FI)决定基于叠化计算(RQ,相对数量)。

2.8。制备细胞总蛋白提取和免疫印迹分析

细胞均质在缓冲区包含10毫米Tris-HCl, pH值7.5;1毫米MgCl₂1毫米EGTA, 10%甘油、0.5%的皮套裤,1毫米β巯基乙醇,蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(σ)。30分钟的提取是涡在4°C和13000×g离心法15分钟后,上层清液被储存在−20°C。蛋白质含量测定与布拉德福德试剂(Bio-Rad)。免疫印迹分析蛋白质的提取进行了分析使用所述电荷耦合装置相机一个发光图像分析仪(分子成像,BioRad)以确保带强度的线性。微的值确定使用数量一个软件(Bio-Rad)。

2.9。mef移民Transwells

在24 transwells迁移进行了分析(裸8μ米多孔transwells)根据制造商的指示(纽约康宁合并)。5×10⁴mef被播种在上部腔体和细胞被允许附加2 h。与PBS彻底清洗后删除不依从细胞,一夜之间,mef被饿死。细胞被刺激的组合表示刺激(铂族元素₂在参议院和10%的边后卫UTP, UTP或铂族元素₂到500年μL在众议院,用作化学引诱物)。板块在37°C孵化隔夜的20倍μ克/毫升的丝裂霉素C (Sigma-Aldrich)抑制细胞增殖。膜是用多聚甲醛固定(4%;pH值7.2)和结晶紫染色(Sigma-Aldrich)的解决方案。细胞迁移的数量完全通过8μm毛孔决心。

2.10。统计分析

图中的值与均值±SD相对应。与学生的统计显著性估计以及未配对的观察。由SPSS数据分析了Windows统计软件包版本21。

3所示。结果

3.1。转基因的表达cox - 2损害P2Y-Dependent Ca^{2 +}动员

mef cox - 2表达释放铂族元素₂在没有额外的刺激。这种积累是增强与有限合伙人的结合促炎的刺激后,TNF -,il - 1和干扰素-(图1(一))。此外,铂族元素的存在₂抑制UTP-dependent Ca^{2 +}动员在MEF细胞,当这个PG体内添加或当cox - 2产生的转基因(图1 (b))。一个视频成像的Ca^{2 +}cox - 2 WT瞬变和KI(表达cox - 2转基因)mef对待不同的刺激(动力和UTP)补充图所示S1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2014/832103。有趣的是,当cox - 2的媒介KI mef被新鲜培养基包含选择性cox - 2抑制剂DFU (coxib),受损P2Y信号以响应UTP观察相同的细胞没有介质变化是废除(图S1)。的分析途径参与P2Y-dependent Ca的障碍^{2 +}动员在WT mef和cox - 2转染细胞(KI)显示一个类似的模式为外生铂族元素之间的反应条件₂或者当cox - 2与DFU抑制(图2)。Ca的UTP动员^{2 +}之间的相似mef WT或COX-2-deficient老鼠(数据未显示),无论DFU治疗。除此之外,一个广泛的PKCs和一些酪氨酸激酶抑制剂(staurosporine)部分获救的应对UTP KI细胞。有趣的是,小说PKCs的抑制(,,,)[30.]和PKD (Go6976 CID755376, resp),而不是经典的PKC亚型(,,;抑制Go6983),恢复了应对UTP铂族元素的存在₂由于cox - 2的活性。相反,激活甘油二酯的PKCs / PKD模拟PDBu废除了UTP-dependent Ca^{2 +}佛波醇动员,而无所作为αpdd无法影响这两种类型的细胞的反应。PKA激活与渗透的营模拟(dibutyril-cAMP)治疗后也无法影响UTP信号(图2)。在一起,这些结果表明,小说PKCs和PKD是参与了铂族元素的抑制效果₂在UTP-dependent Ca^{2 +}动员。

3.2。转基因的表达cox - 2积累P2Y4核受体

来识别损伤的机制P2Y信号这些受体的分布MEF细胞持续合成铂族元素₂进行了分析。如图3显示,P2Y2、P2Y4 P2Y6在场这些细胞;然而,相当一部分P2Y4本地化的核受体,这种情况与DFU压制后抑制cox - 2。这也是在WT mef治疗铂族元素₂(补充图S2)。有趣的是,的表达EP1-4铂族元素₂受体和P2Y2 P2Y4受体不会受到的异位表达cox - 2(数字4(一)和4 (b))。进一步研究了铂族元素的影响₂在Ca^{2 +}动员、治疗的KI mef Ca^{2 +}钙离子载体ionomycin导致相同不管孵化DFU或铂族元素₂(图4 (c))。事实上,Ca的形状^{2 +}细胞外钙时通量表现出类似的资料^{2 +}浓度维持高(0.5毫米)或低(0.1毫米)。然而,Ca^{2 +}动员在回应thapsigargin(即。,after inhibition of the replenishment of the ER stores) was significantly inhibited in the presence of PGE₂(图4 (d))。后者条件引起的类似于动员thapsigargin KI细胞在缺乏媒介替代(例如铂族元素的积累₂在培养基中,没有显示)。

3.3。在mef Thapsigargin-Dependent磷酸化

对铂族元素的影响进行评估₂在Ca^{2 +}动员,细胞治疗前列腺素和thapsigargin立即。如图5(一个)所示,铂族元素的一种蛋白激酶磷酸化的抑制₂和较小的区段在促炎的情况下。类似的结果CaMKII的磷酸化和ACC,而AMPK磷酸化被铂族元素的影响最小₂。这些数据显示一个复杂模式之外的这些酶的磷酸化P2Y激活,如前所述在巨噬细胞20.]。

3.4。铂族元素₂抑制P2Y-Dependent细胞迁移

mef迁移是影响细胞外核苷酸(31日]。如图5 (b)mef携带cox - 2显示,transwell迁移分析转基因和维护的DFU显示反应在细胞治疗UTP,增加减毒与铂族元素预处理后的一个过程₂。有趣的是,当铂族元素₂出现在上部和下部之间的隔间,细胞迁移是完全废除强调的影响前列腺素mef监管的能动性。

4所示。评论

细胞外核苷酸,UTP等被描述为先天免疫监管机构代理通过P2受体(32,33]。事实上,P2受体激动剂越来越被视为一个新类的先天免疫系统介质释放后的网站由于感染或炎症细胞损伤(34]。事实上,后卫和P2Y反应之间的相互作用的背景下,巨噬细胞激活,极化,解决炎症被描述(20.]。然而,少即是已知的关于P2Y受体和铂族元素的作用₂在其他细胞类型。由于这个原因,在这个工作中,我们提供了新的数据精细调节P2Y信号在mef使用特定的受体激动剂。因为成纤维细胞在免疫反应中发挥作用(35),我们的数据表明,mef可能发挥核心作用在监管proresolution和组织修复阶段(36]。

我们有特征的表达P2Y2 P2Y4, mef P2Y6,使用功能和免疫学方法。实验进行的mef WT和COX-2-deficient动物,cox - 2转基因。铂族元素的释放₂UTP-dependent Ca受损^{2 +}动员反应,可以归因于铂族元素的积累₂在培养基。这些数据清楚地建立一个监管P2Y受体的铂族元素₂MEF细胞中,除了其他细胞如巨噬细胞(20.]。有趣的是,在完整的动物,这样的铂族元素₂可以由几个细胞cox - 2表达一致的方式行事。此外,它被描述P2X7受体激活需要铂族元素的释放₂在巨噬细胞37)进而调节P2Y反应。考虑到这一点,似乎有一个复杂的P2受体之间的串扰和铂族元素₂释放。

所有的克隆P2Y受体激活磷脂酶C导致IP3生成和Ca^{2 +}从细胞内释放商店。然而,P2Y受体的反应是由机制涉及受体的脱敏,包括磷酸化蛋白激酶蛋白激酶C (PKC)等衰减受体信号(38]。此外,先前的研究已经表明,P2Y受体脱敏归因于PKC-dependent机制(39,40]。在目前的工作中,我们为铂族元素的参与提供了证据₂通过PKC在P2Y受体脱敏,分析Ca^{2 +}动员读出。我们阐明主要的PKC同工酶的变化负责^{2 +}动员选择选择性PKC抑制剂(30.]。控制,我们使用铂族元素₂DFU,选择性cox - 2抑制剂恢复UTP响应,MEF WT和KI细胞,这表明铂族元素的P2受体调节信号₂。也,我们使用Go6976抑制经典的PKC,和Go6850结构类似于选择性PKC抑制剂staurosporine不善。Go6850展示了PKC高选择性,1,2,,,同功酶(41]。Go6983是pan-PKC对PKC抑制剂,,,。此外,佛波醇12日13-dibutyrate (PDBu), PKC的有力催化剂/ PKD,佛波醇didecanoate (αPDD),这是一个不活跃的衍生物PDBu,支持这些激酶的作用在铂族元素P2Y活动的监管₂。此外,PKDs调节不同的细胞过程,如P2信号(26]。先前的数据描述,PKC激活作为上游的基因激活步骤(42]。出于这个原因,我们使用选择性PKD1抑制剂,CID755376。综上所述,这些数据表明,激活PKC / Ca PKD减少^{2 +}UTP动员。使用选择性PKC和PKD抑制剂我们假设PKCs的关键作用,虽然我们不能确定所涉及的特定亚型Ca的变更^{2 +}动员的铂族元素₂与UTP刺激后。治疗后没有效果与dibutyryl-cAMP表明,铂族元素的抑制₂PKA无关。这些结论同意先前的铂族元素描述P2Y信号调节的证据₂(20.]。我们的数据也表明,EP1-4和P2Y受体表达不会受到cox - 2的活动。有趣的是,铂族元素₂并不影响Ca^{2 +}ionomycin通量,但抑制thapsigargin的影响,表明铂族元素₂改变Ca^{2 +}从细胞内商店动员。

铂族元素₂促进P2Y4的内化mef转染与cox - 2的效应抑制cox - 2与DFU后抑制。基于这些结果,我们假设Ca的变更^{2 +}动员在应对UTP mef转染与cox - 2可能是由于较低的膜的本地化P2Y4铂族元素₂产量提高。此外,Ca的封锁^{2 +}动员的铂族元素₂具有重要的反映的激活不同的信号通路,包括PKCs等主要监管机构通过AMPK活化和抑制ACC和能量代谢。

细胞迁移导致正常发育和分化。近年来,证据表明,细胞外核苷酸可以调节的运动“专业吞噬细胞”(巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和小胶质细胞)和其他细胞类型(如成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞和角化细胞)(43]。从功能的角度来看,我们的数据表明,铂族元素₂抑制P2Y-dependent细胞迁移,无论化学引诱物。这些观察与小泉等人在协议和其他作者描述的P2Y2, 4、6受体参与趋化现象的行为(44]。这样,最近的研究关注的是基质细胞,巨噬细胞和成纤维细胞等,扮演一个角色的炎性病变。在这里,我们描述一个cross-regulation铂族元素之间₂和P2Y信号独立的PG mef受体。这种机制类似于被Traves et al。20.),这表明巨噬细胞和成纤维细胞导致炎症反应的调节和修复组织损伤通过对齐机制涉及P2Y信号(35,36]。总的来说,研究表明,针对基质微环境可能是一个重要的战略为未来抗炎治疗。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

玛丽亚Pimentel-Santillana和Paqui g . Traves贡献了同样的工作。

确认

这项工作是bfu2011赠款支持- 24760和从MINECO bfu2011 - 24743,从马德里Comunidad S2010 / bmd - 2378,红德Investigacion心血管,里克,RD12/0042/0019, Fundacion Marcelino波坦(Maria Teresa Miras-Portugal)。里克和Ciberehd由de Salud卡洛斯三世的网页。

补充材料