文摘

Inflamm-aging表明慢性炎症状态产生的促炎细胞因子和介质如il - 6的分泌增加的老年人。我们的原则的目标是识别细胞类型,影响衰老小鼠模型中il - 6的分泌有关。我们比较脾细胞il - 6生产年轻和老年小鼠和孤立的几种类型的细胞脾和il - 6 mRNA表达和蛋白的生产调查。培养基质细胞中il - 6蛋白产品老化小鼠脾脏明显高相比,年轻的老鼠在LPS刺激。il - 6 mRNA表达水平的新孤立的基质细胞从老鼠岁高相比,年轻的老鼠。此外,基质细胞高表达il - 6的年长老鼠mRNA LPS后注入体内。这些结果表明,基质细胞中发挥作用产生il - 6在老年小鼠和暗示他们有助于老年人的慢性炎症状态。

1。介绍

老年人显示差异的能力抵抗疾病或损伤与年轻人和成年人相比,和一些明显的特点是改变免疫反应和细胞功能的开发和维护(1- - - - - -3]。衰老过程引发了诸如此类的变化导致的免疫功能和抗感染免疫功能和炎症,特异表达的并发症和慢性病的发生3- - - - - -5]。

全身炎症反应综合征是引起外伤或感染的免疫反应特异表达通常保护性反应成为有害引发休克和器官障碍(3]。Inflamm-aging表明慢性炎症状态产生的促炎细胞因子的分泌增加和介质在老年人中6,7]。部分原因在于inflamm-aging,老年人易患自身免疫性疾病,细菌病原体和病毒暴露,和自身免疫性疾病的发生,传染性疾病和癌症增加老年人(8,9]。还的免疫改变很多,比如改变了细胞因子,可能会促进老年人过敏相关条件(10,11]。

促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子-α显著相关,il - 1和il - 6,与年龄有关的疾病和残疾,这些都是重要的因素在老年人(炎症反应12- - - - - -14]。特别是,il - 6被认为是一个可靠的老化参数(15]。岁il - 6基因敲除小鼠显示减少死亡率比野生型小鼠在注射LPS和anti-IL-6受体抗体是好配方对类风湿性关节炎(3]。il - 6在多个组织炎症刺激免疫过程中,生产和生产一些组织il - 6水平升高的年长老鼠相比,年轻的成年老鼠如肺、肾、骨骼肌,心脏,脂肪,和脾3,16]。在紧张或沮丧的条件下,il - 6水平增加(17]。此外,高水平的检测il - 6在疾病条件下包括自身免疫性疾病,如风湿性关节炎、动脉粥样硬化、糖尿病和预防儿童疾病(18,19]。这意味着il - 6可能扮演的角色,促进炎症的风险和死亡率。

il - 6主要是由细胞如巨噬细胞和树突细胞。在二级淋巴器官(SLOs),启动免疫反应,大量的造血细胞,包括巨噬细胞和树突细胞上面所提到的,相互作用[20.]。除了这些免疫细胞、基质细胞也存在于SLOs。基质细胞已被视为不明显影响细胞免疫反应但给淋巴器官的结构支撑;然而,在免疫内稳态基质细胞的功能和免疫反应已经开始出现(21]。

在这项研究中,我们的原则的目标是识别细胞类型是影响衰老小鼠模型中有关il - 6的分泌。为了回答这些问题,我们比较两年轻和老年小鼠脾细胞il - 6生产和孤立的从脾脏细胞类型,研究il - 6信使核糖核酸或蛋白表达。我们发现基质细胞表达il - 6高度与衰老检测不到发炎的迹象和炎症条件。

2。材料和方法

2.1。动物

C57BL / 6和雌性BALB / c小鼠从克丽获得日本(日本东京)。实验中使用的老鼠在2 - 4在11到18门莫莫为年轻老鼠和老鼠岁分别。所有程序都按照指南进行动物使用和保健东京大学的。

2.2。培养基

在RPMI 1640培养基培养细胞补充5% FCS, 100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素、谷酰胺3毫米和50μM 2-mercaptoethanol。

2.3。孤立的细胞和细胞培养

从小鼠脾脏被切除,与1型胶原酶消化。红细胞裂解后,白细胞数。整个脾细胞被播种在96 - 200年孔板μL RPMI介质和孵化24小时37°C和5%的公司₂。巨噬细胞,CD11c⁺树突细胞和CD45⁻基质细胞被孤立的mac (Miltenyi生物技术,Bergisch-Gladbach,德国)。简而言之,细胞被孵化与anti-mouse F4/80, CD11b, CD11c和CD45⁻分别涂磁珠(Miltenyi生物技术),并选择mac分离列(Miltenyi生物技术)。巨噬细胞是由F4/80积极选择或CD11c消极的选择和CD11b积极的选择。CD11c树突状细胞分离⁺CD45细胞和间质细胞⁻细胞,分别。在某些实验中,CD45⁺细胞也被使用。mac纯化巨噬细胞、树突细胞或CD45⁺细胞被播种在96孔板(细胞/)在200年μL RPMI中有或没有有限合伙人和培养24小时。CD45的细胞⁻基质细胞培养在上面一样。由于脾CD45⁻基质细胞形成一个密集的网络和FRCs,一种基质细胞彼此连接在脾脏形成一个三维网,用于测量低浓度的细胞il - 6蛋白的生产与其他细胞类型(22,23]。

2.4。暴露在有限合伙人

急性炎症是引起腹腔注射来自大肠杆菌(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。有限合伙人是溶解在磷酸盐(PBS)和由ip剂量为3.3μ100年g / g体重μL在体内实验中。在控制老鼠,PBS注入。九十分钟有限合伙人注射后,老鼠牺牲和脾脏无菌移除。在体外实验中,有限合伙人溶解在蒸馏水稀释1μg / mL和10μg / mL RPMI媒介。细胞培养与LPS 24 h和文化上层清液受到ELISA。

2.5。测量的il - 6

il - 6水平文化上层的化验了酶联免疫吸附试验(ELISA)。细胞培养介质包含0、1或10μ克/毫升有限合伙人。上层清液收集后24 h, ELISA分析。

2.6。定量聚合酶链反应

总RNA分离纯化细胞由卡塔尔投资局碎纸机和RNeasy迷你包(试剂盒,日耳曼敦,医学博士,美国)和SV总RNA隔离系统(美国WI Promega,麦迪逊)器官。定量PCR反应进行SYBR绿色PCR反应混合液(试剂盒)。为每个样本被归一化GAPDH基因表达水平作为内部标准。正向和反向引物的序列如下:GAPDH (Gapdh),5′-TGTCCGTCGTGGATCTGAC-3′, 5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′;il - 6(白细胞介素6),5′-TGGAGTCACAGAAGGAGTGGCTAAG-3′, 5′-TCTGACCACAGTGAGGAATGTCAA-3′;IL-17A(Il17a)5′-GAAGCTCAGTGCCGCCA-3′, 5′-TTCATGTGGTGGTCCAGCTTT-3′;il - 1β(Il1b)5′-CAGGATGAGGACATGAGCAC-3′, 5′-CAGTTGTCTAATGGGAACGTCA-3′。

2.7。与流式细胞术分析细胞群

脾脏中恢复了年轻和老年小鼠脾细胞用于流式细胞术分析后红细胞溶解。细胞染色流式细胞术在4°C Fc-block一步后15分钟以下单克隆抗体:FITC-conjugated anti-CD11b, FITC-conjugated anti-CD4, FITC-conjugated anti-CD45, PE-conjugated anti-F4/80, PE-conjugated anti-gp38,生物素化的anti-CD31,和PE-conjugated anti-B220 20分钟。所有的数据进行了分析与FlowJo。

2.8。统计分析

学生的结果进行了比较t以及。的值P< 0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。岁的小鼠脾细胞il - 6生产更高而年轻的老鼠

检查老化效应对il - 6蛋白的生产水平在年轻和老年小鼠的脾脏体外,年轻和老年小鼠的脾细胞有或没有孵化有限合伙人24 h。孵化后,我们通过ELISA分析上层清液中il - 6蛋白浓度。上层清液中il - 6蛋白浓度增加依赖LPS浓度在两个年轻和老年小鼠脾细胞(图1(一))。在老年小鼠的脾细胞,刺激有限合伙人导致上层清液中il - 6蛋白upregulation,而在年轻小鼠脾细胞,虽然il - 6蛋白的浓度增加与LPS刺激时,这只是小幅增加。il - 6蛋白水平的差异之间的年轻和老年老鼠成为了LPS-concentration依赖的方式大大增强。类似的结果不仅对C57BL / 6小鼠还对BALB / c小鼠(数据未显示)。巨噬细胞是众所周知的重要细胞,产生的主要促炎细胞因子il - 6和TNF -等α(24]。衰老过程的影响分析脾巨噬细胞il - 6的分泌,从脾巨噬细胞使用两个不同的细胞标记。F4/80⁺细胞和CD11b⁺CD11c⁻细胞是由使用mac电脑。在这两种情况下,巨噬细胞产生更高水平的il - 6蛋白比年龄年轻小鼠组小鼠组LPS刺激后(数字1 (b)和1 (c))。也被称为树突细胞的il - 6 (25]。从年轻和老年小鼠树突状细胞分离和il - 6蛋白水平进行调查。树突细胞从老鼠岁组略高的il - 6产生蛋白质相比,年轻小鼠树突状细胞(图1 (d))。il - 6 mRNA的表达,然而,年轻和老年小鼠之间的差异可以忽略不计(数据没有显示)。我们的结果表明,老化过程不影响巨噬细胞和树突细胞il - 6分泌的功能。

3.2。基质细胞从老鼠产生更高水平的il - 6岁相比,从年轻的老鼠

识别与老化细胞产生il - 6蛋白高,我们接下来关注基质细胞。我们孤立CD45⁻基质细胞年轻和老年小鼠脾脏的mac。流式细胞仪分析细胞和人口特征作为CD45 > 98%⁻基质细胞。il - 6蛋白产量水平是高年龄小鼠相比,年轻的老鼠在所有测试LPS浓度(0,1,10μ米)(图2(一个))。CD45⁻从年轻小鼠基质细胞产生大量的il - 6蛋白低于老年小鼠和他们只显示适度调整il - 6蛋白的生产由LPS刺激。与年轻CD45⁻基质细胞,享年CD45⁻基质细胞产生了更高水平的il - 6蛋白甚至检测不到发炎的迹象,并通过与LPS刺激,il - 6生产进一步增加,生产明显高相比年轻的老鼠。然后,我们从新鲜孤立CD45提取RNA⁻基质细胞和mRNA水平进行调查。mRNA的表达il - 6在老年人CD45显著增加⁻基质细胞(图2 (b))。

3.3。脾细胞群的年轻和年长老鼠没有显示年龄相关性差异但脾CD45的⁻基质细胞显示不同的概要文件

脾细胞群可能会改变与衰老,细胞群的差异可能会影响整个生产的il - 6在年轻和老年小鼠的脾脏。从年龄小鼠脾脏的绝对细胞数量高于年轻的老鼠,这年轻的老鼠和老年小鼠是。分析人口的影响,我们表达F4/80细胞的比例⁺,CD11b⁺,CD11c⁺,CD4⁺,B220⁺、CD45⁻在年轻和老年小鼠脾脏通过执行流仪分析。人口老化过程不明显影响细胞在脾脏和建议的差异之间的脾细胞il - 6生产年轻和老年小鼠的差异不是由于每个单元的人口比例(表1)。流式细胞术分析分析CD45内部的人口分布⁻基质细胞(图3)。年轻和年长老鼠的区别在BEC CD45人口⁻基质细胞。CD45⁻岁的基质细胞的小鼠显示高人口BEC和低DNC人口。

3.4。il - 6的分泌CD45⁻基质细胞但不是CD45⁺增强了细胞衰老

做进一步调查是否增强il - 6分泌老年小鼠的脾细胞il - 6的结果年龄CD45的生产⁻基质细胞,我们培养CD45⁻基质细胞和CD45⁺细胞老化,年轻的老鼠和这些细胞被激活与LPS 24 h。CD45的⁻基质细胞和CD45的⁺细胞从年轻和老年小鼠分别孵化和我们确认CD45⁻基质细胞分泌的年长老鼠几乎相同数量的il - 6蛋白CD45的数量十倍⁺细胞(图4)。当CD45⁺细胞被孵化,CD45⁺细胞明显高于年轻老鼠分泌il - 6蛋白比老的老鼠。结果表明,较高的il - 6生产从老年小鼠的脾细胞相比,年轻的老鼠是由于增强生产基质细胞的il - 6岁老鼠。

3.5。脾基质细胞il - 6表达升高的LPS刺激后的年长老鼠体内

调查与年龄相关的超表达的il - 6在体内LPS刺激后,小鼠腹腔注射LPS,和脾细胞il - 6 mRNA表达是评估。LPS刺激后我们发现体内,享年小鼠脾脏表达的il - 6水平明显高于mRNA(图5)。为了进一步阐明是否CD45⁻基质细胞脾表现出与年龄相关的差异后il - 6 mRNA水平有限合伙人管理体内,脾脏都从年轻和老年小鼠血浆内毒素注射后,和基质细胞被孤立。正如所料,CD45⁻基质细胞的表达明显高于il - 6的年长老鼠mRNA在LPS刺激体内(图5)。因为据报道,IL-17可以增强在音乐会多发地细胞中il - 6、il - 6生产我们还研究了IL-17 mRNA的表达16]。结果表明,IL-17 mRNA表达也明显高于老年小鼠的脾细胞相比,年轻的老鼠(图5)。此外,据报道,il - 1β也可以产生更高层次的il - 6 mRNA (26];我们研究了il - 1β信使rna表达。结果表明,il - 1β信使rna表达也明显高于老年小鼠的脾细胞相比,年轻的老鼠(图5)。

4所示。讨论

在这项研究中,我们调查了衰老过程对il - 6分泌的影响,促炎细胞因子,在几种类型的细胞脾岁年轻的老鼠。在自身免疫性疾病、不平衡和失调的促炎细胞因子被认为发挥关键作用发展自身免疫(27]。升高患者il - 6显示更高的死亡率和器官衰竭和anti-IL-6受体抗体被认为是有效治疗风湿性关节炎的药物,Castleman的疾病28]。这意味着il - 6是自身免疫性疾病的一个关键因素,特别是在类风湿性关节炎(29日- - - - - -31日]。有许多的研究分析对老年小鼠和细胞因子分泌的与年龄相关的缺陷显示促炎细胞因子的变化(7]。老老鼠已经被证明表达的il - 6水平增加,包括有限合伙人治疗后血清il - 6水平,和我们目前研究的结果符合这些报告(3,32- - - - - -34]。

在类风湿性关节炎,它提出了细菌感染可能会扮演重要的角色,所以在细菌刺激促炎细胞因子的表达可能也很重要(35]。在这项研究中,我们观察到,在LPS刺激,老年小鼠的脾细胞il - 6分泌比那些年轻的老鼠。

有许多类型的细胞在脾脏包括巨噬细胞、树突细胞和其他免疫和多发地细胞。我们从脾和几种类型的细胞分离培养这些细胞有或没有LPS识别细胞在生产中扮演角色的il - 6检测不到发炎与炎症和老化迹象环境与年轻和年长老鼠。虽然巨噬细胞产生il - 6在感染性炎症反应的早期阶段36),我们发现衰老过程不影响这些细胞的il - 6生产。同样,从年轻和老年小鼠树突状细胞几乎类似分泌il - 6的能力。相反,我们发现,il - 6 CD45的生产⁻基质细胞在老年小鼠大大增加。我们分开CD45⁻从年轻和老年小鼠脾脏和基质细胞培养这些细胞有或没有有限合伙人24 h。我们的研究结果表明,CD45⁻基质细胞il - 6产生的强烈的年长老鼠甚至检测不到发炎的迹象的情况下,和il - 6蛋白产量增加在LPS刺激(图2)。此外,il - 6在新鲜分离CD45 mRNA表达高度⁻基质细胞从老鼠岁年轻的老鼠相比,它暗指CD45的功能⁻基质细胞分泌il - 6的变化与衰老。进一步调查CD45的效果⁻基质对LPS刺激脾细胞il - 6蛋白的生产,我们培养CD45⁺细胞和CD45⁻基质细胞在LPS刺激条件下24 h,分别。CD45⁺细胞年轻老鼠高分泌il - 6蛋白与老年小鼠相比,表明CD45⁺细胞不会扮演一个角色在增加生产的il - 6与衰老。这表明尽管以外的造血细胞树突细胞产生il - 6的水平生产年轻和老年小鼠没有差异,这些细胞没有影响il - 6分泌。尽管T细胞的比例子集可能改变了与衰老,我们考虑到il - 6的影响生产应该是最小的。CD45⁻基质细胞分泌的年长老鼠几乎相同数量的il - 6与CD45蛋白质⁺细胞与CD45的十分之一⁺细胞和CD45⁻老老鼠的基质细胞显示il - 6蛋白产量高出三倍比年轻的老鼠。这些结果表明,CD45⁻基质细胞增加il - 6蛋白的生产是至关重要的在LPS刺激后衰老过程。CD45⁻细胞群可以区分为四组根据表达CD31和Gp38在细胞表面,bec(血内皮细胞,CD31⁺Gp38⁻),FRCs(成纤维细胞的网状细胞CD31⁻Gp38⁺CD31), LEC(淋巴内皮细胞⁺Gp38⁺),双重否定的数量(20.]。这些CD45的子集的分布⁻基质细胞改变了衰老(图3)。CD45的BEC人口的增长⁻岁的基质细胞的老鼠。尽管CD45的比率⁻基质细胞没有差别,CD45的成分⁻基质细胞改变了衰老。这意味着改变CD45的分布⁻基质细胞老化,特别是bec的人口增加,可能导致增加il - 6生产。

il - 6主要是由NF -κB (4]。我们研究了NF -κB p65激活免疫印迹用核蛋白质年轻和老年小鼠的脾细胞。NF -κB p65核提取物中的蛋白质含量高的年长老鼠相比,年轻的老鼠(数据未显示)。这意味着,通过激活NF -κB p65, il - 6诱导和结果在一个特征在老年小鼠促炎的形象。从基质细胞il - 6分泌的分子机制还不明确,但这将需要一个新方法,将是未来研究的主题。

最近的数据表明,IL-17刺激基质细胞诱导产生炎症介质如il - 6与il - 6,这表明一个IL-17-mediated il - 6放大系统(16,37,38]。的存在下IL-17多发地细胞,包括成纤维细胞可以分泌大量的细胞因子增加感染的反应。IL-17单独治疗,然而,是一个可怜的刺激这些细胞的基因表达。然而,如果IL-17配合与其他细胞因子,特别是TNF -α和il - 6,协同响应会发生,因此它可能被视为一个潜在的机制,能显著增加小鼠il - 6岁产量由IL-17 IL-17A-triggered正反馈循环和il - 6 (39]。我们调查了il - 6和IL-17A mRNA的年轻和老年小鼠脾脏1.5 h有限合伙人注入体内后,我们的结果表明,老年小鼠的脾细胞高表达il - 6和IL-17A mRNA比年轻小鼠脾脏。同时,我们确认CD45⁻从年龄小鼠基质细胞表达il - 6 mRNA 1.5 h有限合伙人注射后5倍高于从年轻的老鼠。我们的研究结果暗示高度由基质细胞产生il - 6和IL-17A触发il - 6的年长老鼠放大器,它导致增加il - 6在老年小鼠脾脏生产。据报道,il - 1β生产LPS-injected老鼠刺激心肌细胞产生il - 6 (26]。我们还发现,il - 1的表达β高在老年小鼠的脾细胞相比,年轻的老鼠注射LPS后。另一个可能性可能是il - 1β产生在LPS刺激提高老年小鼠il - 6分泌。

我们的观察,在脾CD45 il - 6表达增加⁻岁的基质细胞的小鼠显示一般病因机制的中老年人慢性炎症条件,称为inflamm-aging。这种免疫功能改变可能影响发展的疾病,易受感染,过敏和条件相关的老人。在我们的体内和体外结果,基质细胞发挥作用造成差异的il - 6生产之间的年轻和老年老鼠。这些结果建议增加自身免疫性疾病的风险随着年龄的增长,特别是诱导il - 6,部分原因是由基质细胞升高il - 6生产。进一步的研究需要明确的机制与提升在基质细胞分泌il - 6的年龄。,为了更好地理解与年龄相关的基质细胞il - 6生产,进一步研究对每个子集的基质细胞分泌il - 6可能是必要的。

5。结论

总之,我们的结果表明,在小鼠脾脏,il - 6的生产是由基质细胞衰老和il - 6生产发挥了重要作用的增强。我们的研究结果建议的可能性,增强生产等促炎细胞因子il - 6的基质细胞炎性疾病的可能是一个原因。

缩写

SLO:

二级淋巴器官。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢Ryutaro Kotaki技术援助。这项工作是支持的科研补助金(S) 23228003从日本促进社会科学(jsp)。