文摘

生物标记物,包括细胞因子,可以帮助诊断,预后和治疗反应预测疾病大范围设置。因此,最近出现的蛋白质微阵列技术,这是能够量化的一系列炎症介质在大量样本的同时,已成为高度可取的。然而,商业系统的成本仍然有些高昂。这里我们展示开发、验证和实施内部微阵列平台使同时定量分析多种蛋白质生物标记物。内部微阵列系统的准确度和精密度进行了根据美国食品和药物管理局(FDA)药代动力学试验验证指南。测定落在这些限制除了观察细胞因子,如白介素- 10 (IL)。此外,细胞因子之间没有明显差异用我们的微阵列检测系统和“黄金标准”ELISA格式。至关重要的是,未来的生物标志物检测不需要局限于16细胞因子所示但是可以扩大。总之,我们详细定制蛋白质微阵列系统中,利用有效的ELISA试剂,可以准确、精确和可重复的多路复用生物指标量化,比得上商业ELISA,除此之外,允许定制类似的商业微阵列。

1。介绍

生物标记,或“生物标记”,是一个可以量化的特点,测量时,可能表明正常的生物过程,致病状态或药理反应治疗(1]。因此,生物标志物识别可以帮助诊断疾病,帮助疾病的预后和/或帮助预测治疗的结果。DNA、RNA、蛋白质、细胞因子和趋化因子都可以作为生物标记物,包括局部组织来源,周边血液和尿液(综述(2])。

细胞因子生物标志物扮演重要的角色在一个巨大范围内的疾病。这些包括但不限于干扰素-γ(IFN -γ)和干扰素-γ全身蛋白质10 (IP-10)结核分枝杆菌,它可以帮助诊断疾病,以及诱发的保护(3,4];在艾滋病毒感染CCL2,与病毒载量(5];肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α1)、白介素(IL)β心脏衰竭,il - 6,与更严重的疾病和不良结果(6,7];和肿瘤坏死因子-α和il - 6在重度抑郁症,这可怜的抗抑郁药物反应相关(8,9]。

酶联免疫吸附试验(ELISA)的传统方法是准确地量化细胞因子水平。这可以表现具有高敏感性和特异性。然而,它是有限的,一次只能测量一个细胞因子(10]。然而,蛋白质微阵列最近进化成为一种很有前途的工具,量化蛋白质在生物样品(11,12]。蛋白质微阵列,在许多方面,小型版本的夹心ELISA。量化微阵列通常涉及印刷捕捉丰富的细胞因子抗体在镀膜玻璃幻灯片和孵化血清样本。与夹心ELISA,目标特异性最大化通过使用成对的捕获和检测抗体,绑定到相同的抗原通过单独的抗原表位。与elisa相比,微阵列有能力同时评价多个细胞因子。他们需要样品数量小于elisa,更敏感,更大的动态范围(13]。这些因素使得微阵列更便宜的和潜在的有利的替代为大规模elisa检测已知的蛋白质(了14])。

为了利用微阵列技术,滑动面等因素;打印设置;印刷、洗、阻断缓冲区;必须优化和检测方法。此外,多路复用需要进一步优化以外,执行singleplex elisa和测试之间的大不同的捕获和检测抗体,记者,和抗原目标。这通常表现在棋盘或矩阵实验,每个组合测试的monoplex特异抗原加工对整个小组的捕获抗体和抗体检测。这之后,结果必须是可再生的和被验证既定的“黄金标准”,ELISA。目前没有指南蛋白质微阵列生物标志物分析发展,再现性标准,这项工作是基于美国食品和药物管理局(FDA)药代动力学试验验证指南。这些是80 - 120%的准确性和< 20%的变异系数(CV)精度(15]。

在这项研究中,目标是开发和验证一个微阵列平台同时量化16个血清生物标志物。生物标志物是eotaxin-1 eotaxin-2,干扰素-γ,il - 1βil - 10、il - 4、il - 6,引发,IL-17, IL-23, IP-10,单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1),晚期糖化终产物受体(愤怒),转化生长因子-β(TGF -β)、肿瘤坏死因子-α和血管内皮生长因子(VEGF)。直接比较的ELISA和蛋白质微阵列进行30日人类血清不可或缺的一部分微阵列技术的全面验证。

2。方法

2.1。血清样本

诺丁汉大学的医学院伦理委员会批准了这项研究协议和书面知情同意从30获得健康参与者进入研究之前。外周血海温真空采血管(10毫升)收集管(BD);血清分离和储存在−20°C。

2.2。微阵列的协议

DuoSet配对抗体试剂盒(研发系统、明尼阿波利斯、MN)被用于16细胞因子的检测:eotaxin-1 eotaxin-2,干扰素γ,il - 1βil - 10、il - 4、il - 6,引发,IL-17, IL-23, IP-10 MCP-1,愤怒,TGF -β肿瘤坏死因子-α和VEGF。每个捕获抗体稀释到100μPBS-Trehalose g / mL(杜尔贝科的磷酸缓冲盐含有50 mM D -(+)海藻糖)被加载到一个384孔板(Genetix)和打印在四组一式三份点16×16数组格式到poly-l-lysine-coated载玻片(英国Thermofisher)使用生物机器人微型智能电网" II数组(微型智能电网")和硅触针(平行合成技术,美国)。在印刷过程中,数组室设置为20°C,湿度60%和光斑直径是315年μm。打印幻灯片在一夜之间被放在数组,湿度关掉,第二天处理。这里给出参数的优化协议从Selvarajah, 201316]。

与PBS-BSA幻灯片被封锁(PBS包含3% BSA;σ)一小时,洗了三次PBS-Tween (PBs包含0.05% Tween-20)洗缓冲区。鸡尾酒的重组蛋白标准准备包含每一个细胞因子在最大推荐浓度标准曲线生成,按照生产厂家的说明书(研发系统、明尼阿波利斯、MN)。标准的鸡尾酒是稀释的双重跨越八个稀释和50μL添加到每个块45分钟。幻灯片是洗如上所述,50μL适当稀释鸡尾酒的生物素化的检测抗体,每个制造商推荐的浓度,添加到每个块45分钟。另一个洗后,50μL 1: 1000稀释streptavidin-HRP (Opti-4CN放大设备,# 170 - 8238 Bio-Rad,美国)被添加到每个块和幻灯片存储在黑暗中15分钟。进一步洗涤后,50μL (Bio-Rad扩增试剂(酒吧,Opti-4CN放大工具包)添加到每个块和幻灯片被存储在黑暗中10分钟。幻灯片与PBS渐变洗了三次含有20% DMSO (v / v)和三次洗缓冲区。在这之后,50μL 1: 1000稀释streptavidin-conjugated Cy5(最终浓度0.2μg / mL洗缓冲:# 19 - 4317 E-Biosciences,英国)被添加到每个块和幻灯片被存储在黑暗中15分钟。最后一个洗后,幻灯片被离心分离在超纯水冲洗并晾干。幻灯片在635 nm扫描和数据分析使用GenePix Pro软件(轴突GenePix)。短暂,当地背景中值减去从每个位置的平均荧光和修正后的荧光被用来计算平均荧光信号的标准差。除非另有规定,所有在室温下孵化的步骤进行。每个生物标志物的实验至少重复两次。

确定微阵列技术的准确性,两个在实验进行的16个生物标记三个浓度(22 pg / mL, 188 pg / mL,和750 pg / mL)。在第一个实验中,重组蛋白标准为每个16生物标志物在上述浓度上升到PBS,而在第二个实验中,血清生物标记被上升到健康的捐赠者,确定如果血清蛋白质分析系统上的任何不利影响。精度(%)计算是基于观察到浓度来衡量预期的浓度。

确定精度的微阵列平台内部和interassay比较进行所有16个血清生物标志物的30名健康志愿者。Intra-assay比较进行16次相同的载玻片,虽然interassay比较进行不同幻灯片在一段时间内的连续三天。复制的均值和标准差被用来计算变异系数(CV)的微阵列方法。低收入的可变性之间的显著差异,中期,和丰富的细胞因子测定利用克鲁斯卡尔-沃利斯检验和事后邓恩的多重比较检验。

2.3。ELISA协议

elisa进行使用研发系统DuoSet配对抗体试剂盒(按照微阵列工作)根据制造商的指示。简单地说,盘子被涂上一层1 - 4μ克/毫升的捕获抗体和存储。盘子洗了三次有0.05% PBS-Tween(σ)和阻塞与试剂稀释剂(1% BSA在PBS)一小时。上面三个洗后,标准(准备在双重的稀释剂稀释剂,根据设备指令)增加了100μL /复制和板是孵化了两个小时。板洗净,与100年孵化μL适当稀释的生物素化的检测抗体/延长两个小时。洗后如上所述,100年μL稀释streptavidin-HRP被添加到每个存储板,在黑暗中30分钟。最后一个洗后,使用酶底物过氧化物酶色原板的开发。30分钟的孵化后,通过添加50反应停止μL 0.18 H₂所以₄每口井和吸光度在450海里。孵化项目的步骤都是在室温下进行。

3所示。结果

3.1。芯片验证

微阵列技术的开发,使量化16细胞因子在人类血清生物标志物。进行了一系列的验证测试,以确保这种方法的重现性和准确性。在第一个实例中,PBS(代表愤怒的数据如图1(一))和血清VEGF如图(代表数据1 (b))飙升了三个已知浓度的蛋白质:22个pg / mL, 188 pg / mL, 750 pg / mL。pre - post-serum峰值蛋白质浓度量化使用标准曲线具体每个生物标志物(图1 (b))。血清样本的选择在等离子体,由于持续降低血清背景信号,相对于等离子体对这些微阵列(数据没有显示)。BSA是我们首选阻断缓冲区实验;1%我挡(纯化酪蛋白)执行同样(结果未显示),但是由于成本和减轻BSA优先的准备。

微阵列实验的准确性和精度值被计算出这些数据(图2)。postspike观察值16生物标志物和期望值(虚线)的生物标记所示数据2(一个)和2 (b)。但高浓度的两个峰值(750 pg / mL)在10%的预期值,而所有的中期和低浓度峰值(22 pg / mL - 188 pg / mL)都在这个范围的PBS(图2(一个))。同样的观察血清(图2 (b))。观察到的意思是蛋白值精度的可接受的标准内(80 - 120%),绝大多数的细胞因子三个峰值浓度(数字2 (c)和2 (d))。可接受的精度水平的也是如此(< 20%的简历,数字2 (e)和2 (f))。

3.2。微阵列检测和量化的极限

的极限灵敏度的分析测定使用的下限检测(LOD)和量化的上下极限(LLOQ ULOQ, resp。) [17]。检测下限(LOD)是给一个信号所需的生物标志物的浓度等于背景(空白)+三倍标准差的空白;量化的下限(LLOQ)是LOD或水平的两倍的简历低于20%,哪个是最高的。的下限检测和量化的微阵列分析如表所示1。16个生物标记研究,LOD值范围从0.284到1.9 pg / mL和LLOQ值范围从1.5到5.9 pg / mL。量化的上限(ULOQ)的计算精度不超过15%的简历和精度预计在15%的浓度(18]这范围从750到1900 pg / mL的16个生物标志物检测(数据未显示)。

3.3。芯片内部,Interassay精度

微阵列内部interassay可变性,使用30健康志愿者的血清,如图3。三套两张幻灯片,每张幻灯片包含16个数组,用于内部和interassay变异测试。相同的样本用于每组两张幻灯片,在三个独立的时间点。16 intra-assay变异的情况下,13生物标志物在可接受范围内的精度(CV < 20%)。当看着interassay变异,16中11生物标记是在可接受的范围内(图3(一个))。

细胞因子生物标记被分为三组,根据血清丰富,每个分析分别为内部和interassay精度(数字3 (b)和3 (c)、职责)。Low-abundance细胞因子被定义为那些血清浓度≤50 pg / mL, il - 1βil - 10、il - 4、il - 6,引发,TNF -α;mid-abundance细胞因子,其血清浓度的51 - 199 pg / mL, eotaxin-1 IL-17,干扰素γ、MCP-1 TGF -β和VEGF;和丰富的细胞因子(血清浓度≥200 pg / mL) eotaxin-2, IL-23, IP-10和愤怒。精度值5 6 mid-abundance细胞因子和所有四个丰富的细胞因子在可接受的水平的精度对内部和interassay变异。当看着low-abundance细胞因子,然而,intra-assay中等精度值变化是可以接受的极限精度,与3细胞因子在可接受的限度。至于interassay变化,只有一个可接受的水平内的细胞因子是精度和这些low-abundance细胞因子的中值是可接受范围外的精度。

3.4。微阵列之间的相关性和ELISA检测细胞因子水平

16细胞因子生物标志物的血清水平量化来自30个健康人使用ELISA和内部微阵列系统;并使用成对的两种检测方法进行了比较测试(图4代表在Bland-Altman地块(图)、有视觉冲击效果5)。没有显著差异水平的细胞因子检测到两个化验,对于任何16细胞因子(值从0.3404到0.997不等)。这突出了两种检测方法之间的协议;一致,要么技术是可以忽略不计的倾向(图5)。此外,少的细胞因子,如il - 1β,微阵列平台比ELISA似乎更敏感。

4所示。讨论

生物标记物可以在疾病的诊断是非常有益的,有助于疾病的预后和/或帮助预测治疗的结果。因此,努力识别和量化生物标志物近年来大幅增加。然而,进入商业蛋白质微阵列平台是昂贵的和使他们难以实现对大多数(19]。进一步增加的问题是缺乏全面指南蛋白质微阵列生物标记验证研究。在这项研究中,我们验证了内部夹层对药代动力学分析微阵列根据FDA指南。

微阵列恢复测试,执行PBS和人类的血清,显示细胞因子检测的准确性和精度值在可接受的范围内:80 - 120%的准确率,CV < 20%的精度。这是按照出版文献[20.- - - - - -24]。此外,微阵列内部和interassay精度值被认为接受十之八九中期和丰富的细胞因子,第十是边缘的可接受性。正如所预期的那样,有一个更大级别的interassay变异而low-abundance intra-assay变化和细胞因子,如il - 10,而中期和丰富的细胞因子。

量化的限制被定义为最低和最高的点在一个能被探测到的分析和量化的一个可接受的水平的准确度和精密度。微阵列平台被证明是在灵敏度和优越的优势最低检测浓度的细胞因子(25,26]。在这里显示的LOD很低(小于1 pg / mL的大部分研究细胞因子),通常是不选为极限测量生物样品中的蛋白质,作为在这个浓度有更高程度的样本之间的差异,因此LLOQ优先当使用微阵列技术作为分析物浓度最低,可以量化一个可接受的水平的准确性和精度。

果断,没有发现显著差异之间血清细胞因子水平检测到微阵列和ELISA分析的“黄金标准”(27,28),显示两种技术可比。然而,对于一些low-abundance生物标记,如il - 1β和il - 6,有更少的技术之间的协议。有趣的是,这可能是由于更大的敏感性微阵列检测格式(26,29日];微阵列测量荧光检测的范围许多10000年代的荧光任意单位,而离散0到3光密度规模elisa。

我们的一个目标是在这个工作是产生一个具有成本效益的方法来支持多个细胞因子/趋化因子对大量样本化验。有鉴于此,我们估计的执行成本相当于16个细胞因子在多个样本化验,如果充分利用试剂的商业工具,和包括盘子的数量/幻灯片和相关辅助试剂,但不是吸管技巧或技术。基于这一点,我们估计研发Duoset工具将允许为每个细胞因子测试的712个样本,一式两份,要求240、96孔板和成本约£0.63每细胞因子样(£10每样16细胞因子)。

基于类似的最佳使用相同的ELISA试剂盒,我们的系统将允许2872个样本的测试,4为每个细胞因子/技术复制数组。包括幻灯片、放大和荧光染料成本等同于£0.18细胞因子测试,每个样本或£2.88。这71%储蓄有添加复制技术,改进质量控制基于数组内的位置形态分析,并降低后勤问题由于减少了所需的板块“等效”化验数量(约1∖10 ELISA板的数量是必需的)。

最接近等价商业细胞因子数组是一个96孔板数组从Quantsys(测试16细胞因子),售价£11.45示例中,每个细胞因子检测或£0.71。再一次我们的系统节省了75%。

5。结论

总之,进行了一系列的实验来测试性能的内部微阵列系统的精度,精度和重现性。我们已经表明,11的16细胞因子生物标志物检测符合FDA指南分析方法验证。然而,我们看到的损失精度在ra的蛋白质的最低浓度。这凸显了要求更详细的指导方针在可接受的水平的准确度和精密度,特别是关于生物标志物检测,标准化在研究机构(30.,31日]。这显然微阵列系统提供大范围使用微阵列生物标志物的检测。这里的内部芯片协议建立了相对轻松地同时支持多个生物标志物进行量化,使用一个更小的样本体积和比ELISA更敏感,并有较低的运行成本。重要的是,检测并不局限于16日生物标记所示,但可以扩展的要求。

缩写

BSA:	牛血清白蛋白
简历:	变异系数
ELISA:	酶联免疫吸附试验
食品药品监督管理局:	食品和药物管理局
合:	辣根过氧化物酶
干扰素-γ:	移行细胞
IL:	白介素
IP-10:	Interferon-gamma-induced protein-10
LLOQ:	下限的量化
LOD:	降低检测极限
MCP-1:	单核细胞趋化蛋白1
PBS:	磷酸缓冲盐
愤怒:	对晚期糖化终产物受体
TGF -β:	转化生长因子
肿瘤坏死因子-α:	肿瘤坏死因子-α
ULOQ:	上限的量化
VEGF:	血管内皮生长因子。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者要感谢研究护士莎拉Lenney他获得的样本研究。这项工作是支持的诺丁汉呼吸生物医学研究单位和琼斯1986年慈善信托基金。