文摘
慢性炎症与各种慢性疾病包括免疫相关疾病,癌症,神经衰弱,血管疾病。环烯醚萜化合物有抗炎作用。然而他们的抗炎机制仍不清楚。在这里,我们报告scropolioside B,孤立从西藏医学(Scrophularia dentata罗伊尔Benth交货),阻断TNF的表达,il - 1, IL-32 NF -κB通路。Scropolioside B抑制NF -κB活动与IC剂量依赖性的方式50值为1.02μmol / L。然而,类似于catalpol scropolioside B,没有有效地抑制NF -κB的活动。有趣的是,scropolioside B和catalpol NLRP3的表达减少,心磷脂合成酶mRNA和蛋白水平。我们的研究结果表明,scropolioside B优越抑制表达,成熟,和il - 1的分泌β而catalpol。这些观察结果进一步对环烯醚萜苷的抗炎作用和突出scropolioside B作为一个潜在的药物治疗类风湿性关节炎和动脉粥样硬化。
1。介绍
急性炎症反应是至关重要的病原体的控制和组织修复,也可以引起严重的组织损伤。在慢性感染和与年龄有关的免疫失调、炎症过程可能诱发各种有害影响的有机体(1]。慢性炎症与慢性疾病包括癌症、神经衰弱,血管疾病(2- - - - - -4]。感染或细胞损伤引起的释放促炎细胞因子白介素- 1 (IL)等β和肿瘤坏死因子(TNF)α,这是宿主免疫反应的主要介质。炎性细胞因子的信号转导包括配体、受体,coreceptors,胞质及核信号机制。这些机制可以激活NF -κB,物,p38 MAPK、统计和PI3K信号通路(5]。另一方面,inflammasomes扮演着一个关键角色,炎症和免疫反应的调节生产促炎细胞因子(6]。研究表明,inflammasomes参与动脉粥样硬化(7),代谢综合征(8),2型糖尿病9),酒精性脂肪肝(10),粘膜免疫反应(11),类风湿性关节炎12),和痛风13]。nucleotide-binding域——(点头)像受体蛋白3 (NLRP3) inflammasome multiprotein复杂调节促炎细胞因子il - 1的成熟β和地震。它由nod样受体,NLRP3适配器蛋白质ASC(凋亡speck-like蛋白质包含caspase-1催化剂领域,卡),和caspase-1。在外源性和内源性刺激,NLRP3 inflammasome形式通过激活ASC和pro-caspase-1 NLRP3和招聘,导致caspase-1激活和随后pro-IL-1的处理β和pro-IL-18到他们的活动形式(14]。
环烯醚萜来自玄参科、茜草科、唇形科龙胆科、木犀科,等等;它主要来源于Scrophularial . (15]。环烯醚萜苷组成的一个大家庭的最有特色的双环单萜,具有广泛的药理特性,包括抗癌,抗炎,抗菌,抗菌活性16,17]。Scropolioside展出消炎对dth的不同实验模型。Scropolioside也抑制了前列腺素E2的生产,白三烯B4,一氧化氮,一些白介素但没有影响il - 10的生产。此外,它修改的表达一氧化氮synthase-2和cyclooxygenase-2以及NF -的激活κ巨噬细胞[264.7 B在生18]。Scropolioside D也拥有重要的治疗糖尿病药和抗炎活动(19]。然而,尽管scropolioside B表现出温和的抗菌活性与耐多药和耐甲氧西林菌株金黄色葡萄球菌(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)和面板快速增长的分枝杆菌的最低抑制浓度(MIC)值从32到128μ克/毫升(20.在TXB2-release[],它没有显著的影响21]。我们之前报道的不同抗炎作用的其他环烯醚萜苷组件(22,23]。Scrophularia dentata罗伊尔Benth交货。在西藏用于抗病毒和抗炎治疗。因此,在这项研究中,我们审查scropolioside B隔绝美国dentata罗伊尔Benth交货。我们确定scropolioside B展品抗炎效应,进一步分析其潜在的机制在人类单核细胞。
2。材料和方法
2.1。细胞培养和试剂
293年人类胚胎肾细胞(HEK293细胞)是购自雍正挖掘者产品公司(中国南京)和THP-1细胞来自中国科学院(中国上海)。100毫米上培养的细胞组织培养菜肴或100毫升玻璃瓶杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)含10%胎牛血清(美国表达载体Gibco) 37°C下湿润孵化器有限公司5%2和95%的空气。在实验过程中,细胞在24-well盘子镀或30 mm组织培养菜肴16和24小时。
2.2。提取和隔离Scropolioside B
核磁共振光谱获得使用力量am - 400光谱仪。质和HR-ESI-MS使用《时尚先生》获得3000 + Q-TOF-Ultima质谱仪,分别。硅胶(200目- 300目;青岛海洋化工有限公司、有限公司、青岛,中国),C18反相硅胶(150 - 200目;富士Silysia化学有限公司、爱知、日本),MCI凝胶(CHP20P, 75μm - 150μm;日本东京三菱化学工业有限公司),和交联葡聚糖凝胶LH-20(法玛西亚生物技术AB,乌普萨拉,瑞典)被用于柱层析(CC)。
植物材料。整个植物美国dentata罗伊尔Benth交货。收集从拉萨,西藏,中国,2010年10月。教授发现的植物是织里赵(学院制药、上海中医药大学)。凭证标本(CX2010)沉积的植物标本的中药化学、药学学院上海中医药大学(上海,中国)。
2.3。荧光素酶检测
测定NF -κB子活动,THP-1细胞瞬变与荧光素酶报告基因转染。pNF——虽然κ从Stratagene B-TA-Luc购买(美国)。细胞转染前镀一天,细胞将大约80%汇合的转染。在转染,DNA被稀释2μ每100克μL的无血清培养基,适量的FUGENE高清转染试剂(美国Promega)添加到实现适当的试剂比DNA。混合物是孵化0-15分钟,100年μL是添加到每个转染。细胞转染前5小时变化的新媒体。转染后一个小时,TNF -α被加入到细胞16 - 20个小时。荧光素酶活性测定细胞内溶菌产物使用Promega荧光素酶检测系统根据制造商的指示(美国Promega)。
2.4。实时定量PCR(存在)
总RNA提取使用试剂盒(美国生命科技,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指示。实时PCR扩增和检测进行了使用SYBR绿色qPCR SuperMix-UDG与火箭(生命技术)荧光热循环(StepOne实时PCR系统,生活技术)根据制造商的协议。基因表达规范化使用GAPDH基因作为参考。ΔΔCt后相对mRNA表达水平计算方法用以下引物:GAPDH, il - 1β肿瘤坏死因子-α,IL-32β,IL-32γ、CLS1 NLRP3表1。所有测定的线性范围内进行了放大和规范化各自GAPDH水平使用SPSS 18.0版(SPSS研究所有限公司、芝加哥、IL,美国)。
2.5。免疫印迹
治疗后,细胞被离心机和细胞溶解在卫/ NP-40裂解缓冲Triton x - 100年含0.5%,0.5%诺乃清洁剂p 40, 10更易L三pH值7.5,2.5 L更易与氯化钾,150更易与L氯化钠,更易与Lβ甘油磷酸盐、50 L更易与氟化钠和1更易/ L,用JY92-2D超声均质器(宁波Scientz生物技术有限公司,浙江,中国),然后离心10分钟10000 g。分析了上层清液的蛋白质浓度使用分析工具(Bio-Rad、大力神、钙、美国),和等量的蛋白质(30μg /样本)被sds - page分离,在硝化纤维膜涂抹笼罩在中国,上海,中国。这些墨迹被封锁在一夜之间有5%的脱脂奶粉140年缓冲区包含更易与L氯化钠,20更易/ L Tris-HCl pH值7.5,和0.1% Tween-20孵化与以下主要抗体:NLRP3兔子马伯(细胞信号技术,贝弗利,妈,美国),il - 1β鼠单克隆(圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX,美国),和HRP-conjugated单克隆鼠标Anti-GAPDH(康晨生物科技、上海、中国)孵化在4°C温柔颤抖,过夜。二次抗体与辣根过氧化物酶共轭。高性能膜被暴露在放射自显影法电影(日本东京富士胶片Corp .)和可视化使用ECL止动剂西方化学发光合衬底(WBKLS0500)(美国微孔)。定量分析是由数量一个软件。免疫印迹实验进行了一式三份。
2.6。ELISA
从控制和治疗细胞培养基是收集,离心机,并存储在−80°C到测试。il - 1β测量使用Abcam人类酶联免疫试剂盒(Abcam,剑桥,英国)根据制造商的指示。标准或样本添加到每个和孵化为2.5 h在室温下。准备的生物素抗体被添加到每个好,其次是在室温下孵化1 h。链霉亲和素的解决方案是添加在室温下和孵化了45分钟。最后,三甲一步发展的解决方案是添加到每个好,在室温下孵化30分钟。停止的解决方案被添加到每个好,立即在450海里。
2.7。分析日期
每个实验进行了至少3次。的结果意味着±均值的标准误差(SD)。所有数据使用SPSS软件,分析了单向方差分析是用来确定差异的统计学意义。差异具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。阻断il - 1β和肿瘤坏死因子-α表达式由Scropolioside B
因为scropolioside B包含catalpol结构和两种糖类(图1(一)),我们比较和测试的抗炎功能scropolioside B和catalpol THP-1细胞。il - 1的表达β和肿瘤坏死因子-α显著诱导脂多糖(LPS)和棕榈酸(PA)、游离脂肪酸和潜在的促炎介质,而control-treated THP-1细胞(图1)。这表明,细胞接触有限合伙人或PA诱导的分泌各种细胞因子导致的起始和放大炎症。调查scropolioside B的抗炎效果,我们preincubated THP-1细胞的化合物1 h和随后刺激细胞与有限合伙人或PA。我们发现scropolioside il - 1 B明显阻塞增加β和肿瘤坏死因子-α水平由有限合伙人或PA(图1)。然而,在50的浓度μmol / L, catalpol没有有效地阻止il - 1的表达β和肿瘤坏死因子-α,尽管这些抗炎作用的报道(24,25]。这些观察表明,scropolioside B catalpol相比具有更强的抗炎活性。
(一)
(b)
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3.2。抑制核转录因子κB Scropolioside活化的B
NF -κB是一个重要的转录因子参与生产的一些细胞因子,调节炎性反应。调查的整体抗炎活动scropolioside B,我们用荧光素酶报告实验确定核转录因子(NF -κBκB)活动。在HEK293细胞转移的NF -κB或控制质粒,细胞治疗有或没有scropolioside B 1 h,然后刺激TNF - 100 ng / mLα。荧光素酶活性的增加是观察与TNF -刺激后α,这表明NF -κB是激活TNF -α(图2(一个))。预处理与scropolioside B (0.08 -50μmol / L)抑制肿瘤坏死因子-α全身的NF -κB浓度的方式激活。此外,scropolioside B表现出一个值为1.02μmol / L(图2 (b))。这些结果表明,scropolioside B-mediated抑制炎性细胞因子诱导的抑制NF -κB。
(一)
(b)
3.3。Scropolioside B减少IL-32表达式
IL-32促炎细胞因子参与几种疾病,包括感染、慢性炎症和癌症。肿瘤坏死因子-α或有限合伙人是已知的抗病诱导剂IL-32 IL-32-dependent il - 1的影响β在内皮细胞功能26]。我们下一个决心的抑制性影响scropolioside B IL-32表达式。预处理scropolioside B显著减少IL-32的信使rna表达水平增加β和IL-32γ引起LPS刺激(数字3(一个)和3 (b)),类似于il - 1β和肿瘤坏死因子-α表达模式,在LPS-induced THP-1细胞。
(一)
(b)
3.4。Scropolioside B减少NLRP3的表情
Inflammasomes规范成熟的il - 1β地震和pyroptosis。NLRP3属于inflammasomes构成复合ASC和caspase-1促进il - 1的成熟β(27]。观察是否炎症因素诱发NLRP3表达式,我们与LPS刺激THP-1细胞24 h。我们观察到,有限合伙人调节NLRP3信使rna和蛋白质(数字4(一),4 (c),4 (d))。同样,有限合伙人也显著增强mRNA的表达心磷脂合成酶1 (CLS1)(图4 (b)),线粒体酶催化双磷脂酰甘油合成所需inflammasome NLRP3活动(28]。如数据所示4(一)- - - - - -4 (d),与scropolioside B预处理抑制NLRP3 mRNA和蛋白的表达,以及CLS1 mRNA。我们还发现catalpol scropolioside B(数字一样同样有效4(一)- - - - - -4 (d)),这表明这种抑制作用可能来自同一catalpol结构(图6)。
(一)
(b)
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(d)
3.5。Scropolioside B减少Pro-IL-1的表情β和il - 1β
全面评估scropolioside B和catalpol的抑制作用,我们进行了进一步的研究pro-IL-1 scropolioside B对蛋白表达的影响β和il - 1β。如数据所示5(一个)- - - - - -5 (d),与scropolioside B预处理抑制pro-IL-1的表达式β和il - 1β蛋白质。pro-IL-1的抑制β比il - 1β。Catalpol并不抑制pro-IL-1的蛋白表达β和il - 1β。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
从Scropolioside B美国dentata罗伊尔Benth交货。有退热的解毒效果。它用于西藏医学,如天花、麻疹、其他感染性发烧,和炎性疾病。在这项研究中,我们证明了scropolioside B,一个包含catalpol环烯醚萜苷和两个糖类,是比catalpol更有效抑制il - 1的表达β和肿瘤坏死因子-α在THP-1细胞激活有限合伙人或棕榈酸(图1)。我们的研究结果表明,scropolioside B的抗炎活性高于catalpol,尽管一些研究报道,catalpol确实证明抗炎作用在高剂量通过抑制cox - 2活性,TNF -α形成、单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1)和一氧化氮产量(24,25]。如图2,scropolioside B的抗炎作用是通过阻断NF -介导的κB活动(图2)。il - 1β参与发病的急性局部或全身性炎症,导致各种慢性非传染性的疾病,包括缺血性损伤、动脉粥样硬化、2型糖尿病和关节炎。内源性代谢物,如氧化脂肪酸,高葡萄糖、尿酸晶体,激活补体,坏死细胞,细胞因子,可以刺激不活跃的il - 1的合成βinflammasome前体,等待处理的复杂被激活(29日]。
Inflammasomes规范成熟的il - 1β、地震和pyroptosis和识别微生物产品或受损细胞释放的内源性分子(27]。Inflammasomes蛋白质有几个成员,包括NLRP1 NLRP3, NLRC4, AIM2, NRP6 [6]。我们的研究结果表明,scropolioside B可以抑制信使rna和蛋白质的表达inflammasome NLRP3和防止il - 1的分泌β(图4)。有趣的是,catalpol NLRP3表达上也有类似的抑制作用比scropolioside B,这表明scropolioside B和catalpol抑制il - 1β通过不同的机制和NLRP3表达。Scropolioside B和catalpol也块CLS1的表达,这是一种酶线粒体心磷脂合成的最后一步催化转移phosphatidylglycerol磷脂酰甘油二酯残留。艾耶et al。28)报道,线粒体心磷脂和活性氧物种需要inflammasome NLRP3活动。心磷脂可以直接绑定到NLRP3和沉默的心磷脂合成抑制inflammasome NLRP3激活(28]。基于这些观察,我们认为scropolioside NF - B不仅块κB通路,还可以抑制NLRP3 CLS1, il - 1β表达式。然而,catalpol只是防止NLRP3和CLS1(图的表达5)。
我们的研究结果还表明,scropolioside B,但不是catalpol IL-32阻塞β/γ表达式(图3)。几项研究已经表明,IL-32风湿性关节炎的重要的促炎细胞因子,增强il - 6和引发生产呈synoviocytes [30.- - - - - -32]。一些研究还表明,IL-32与慢性病毒性肝炎的肝纤维化密切相关33,34]。此外,与主要血液单核细胞相比,il - 1β肿瘤坏死因子-α或有限合伙人可以刺激高水平的IL-32通过我表达κB激酶-β/ NF -κB和ERK途径在人类脐静脉内皮细胞,主动脉macrovascular内皮细胞,心脏和肺微血管内皮细胞(26]。相反,IL-32也刺激il - 1α,il - 1β、il - 6、TNF -α和趋化因子通过NF -κB, p38 MAPK和AP-1激活(26,35]。IL-32促进血管生成传播血管炎症和加剧脓毒症小鼠模型(36,37]。最近的研究表明,动脉粥样硬化可能与IL-32生产(38]。
总之,scropolioside B显著降低il - 1的表达和分泌β、IL-32和TNF -α。我们表明,这是由调制NF -κB、NLRP3 CLS1水平。还需要更多的研究来进一步阐明scropolioside和catalpol调节炎症的其他目标。这项研究的结果加强之前了解环烯醚萜苷的抗炎作用和突出scropolioside B作为潜在的药物用于治疗风湿性关节炎和动脉粥样硬化疾病。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
天天朱和张Liuqiang同样这项工作。
确认
这项工作是支持由国家科技重大项目,中国科技部(2009 zx09311 - 003),中国国家自然科学基金(81173518,81173518),085年上海高等教育内涵建设项目(085 zy1202),和培训青年教师资助计划在上海大学(没有。ZZszy13057)。