文摘
免疫现象在妊娠的胚胎植入前的时期却鲜为人知。我们的研究的目的是评估的能力脾的抗原呈递抗原递呈细胞(apc)来自孕妇和pseudopregnant老鼠在体外条件。因此,排序CD11c+树突状细胞和巨噬细胞F4/80+和CD11b+呈现卵白蛋白(OVA)与CD4 cocultured+T细胞来源于OT-II老鼠(C57BL6 / J-Tg (TcraTcrb) 1100 mjb / J)脾。细胞培养132小时后,淋巴细胞(ELISA-BrdU),扩散激活这些细胞(流式细胞术),细胞因子(ELISA)和costimulatory分子阻止对这些参数测量的影响。我们没有发现任何差异调节Th1 / Th2细胞因子的平衡。CD86似乎主要costimulatory分子参与增殖反应但主要costimulatory CD80分子影响细胞因子的分泌在怀孕的老鼠。总之,本研究表明,CD80和CD86 costimulatory调节OT-II CD4分子+T淋巴细胞增殖和细胞因子反应与抗原递呈细胞来源于cocultures孕妇和pseudopregnant老鼠。这些变化的影响仍不清楚。
1。介绍
成熟,宽容的孕产妇妊娠成功的免疫系统是决定性的。耐受性母亲对父亲的同种抗原免疫反应不仅在胎儿的存在,但也可能是几个重叠的生理机制的结果。大部分的免疫反应与怀孕相关的上下文中描述了mid-gestation,虽然在怀孕早期免疫机制的形成,特别是在胚胎植入前的时期,仍知之甚少。三个事件诱导免疫耐受对semiallogeneic孕体可能怀孕的胚胎植入前的时期发挥着至关重要的作用:(i)性激素的影响性周期(1- - - - - -6];(2)一个卵母细胞或胚胎的存在(7- - - - - -10];(3)和精子在女性生殖道的存在11- - - - - -18]。我们注意怀孕的这段时间,因为它似乎是重要的外围建立的宽容胎儿抗原没有障碍的有效anti-infectious防御的能力。因此,强大的抗原递呈细胞(apc)的活动可能是这些事件的关键。在之前的研究中我们发现,交配costimulatory CD40分子水平的变化,CD80和CD86和脾apc (CD11c MHC II级+,F4/80+,,植入前(19]。
反对当地响应,外围的意识怀孕早期可能是决定性的一代分裂宽容,认为怀孕期间运作的胎盘类哺乳动物(20.]。微分表达式costimulatory分子脾装甲运兵车的交配诉pseudopregnant老鼠被我们观察到主要是怀孕后3.5天。此外,我们发现costimulatory F4/80的潜力+巨噬细胞的表达水平来衡量costimulatory分子似乎更高的装甲运兵车与其他人群相比,我们研究了。在一个在活的有机体内实验,阻塞costimulatory抗体分子有ip交配后3.5天,细胞因子表达调制anti-CD40管理后,anti-CD80, anti-CD86 10.5天(19]。anti-CD40管理局(刺激抗体)和anti-CD86(抑制性抗体)减少怀孕的可能性,而阻断CD40分子导致增加Treg淋巴细胞浓度。我们假设的变化水平的CD80和CD86在胚胎植入前的期间怀孕的功能意义,直接与调节T细胞反应。因此,我们评估效能的抗原呈递脾装甲运兵车隔绝老鼠在怀孕的胚胎植入前的阶段。对于这个目标,树突细胞CD11c排序+和F4/80+和CD11b+巨噬细胞富含卵白蛋白(OVA)和CD4细胞培养+T细胞来源于OT-II老鼠(C57BL6 / J-Tg (TcraTcrb) 1100 mjb / J)脾。我们发现CD4扩散+T淋巴细胞完全取决于CD86在怀孕和pseudopregnant老鼠都可用性;然而,细胞因子在怀孕生产主要由CD80 costimulatory分子。
2。材料和方法
2.1。动物
成人(8-week-old)女C57BL / 6 j,男性DBA / 2 j,购买和雄性Balb / c小鼠菌株的实验医学中心,医科大学的比亚韦斯托克(波兰)。OT-II老鼠从查尔斯河实验室购买(法国)。动物们被安置在一个常数亮到暗比12:12小时在特定病原体免费(SPF)条件。描述程序都是当地伦理委员会批准的免疫学和研究所的实验疗法在弗罗茨瓦夫(批准号4/2009)。
2.2。交配和假孕的感应
发情周期阶段确定每天的细胞学(8:00-10:00点)阴道涂片。涂片是沾Cytocolor工具包(默克公司、德国),根据制造商的指示。发情期的雌性交配的雄性Balb / c或DBA / 2 j小鼠。女性对男性比例为1:1。交配行为的存在证实了阴道栓第二天早上(视为一天0.5)。因为阴道栓的存在不确认怀孕,这些动物被描述为交配。假孕的机械刺激引起的子宫颈癌,当雌性发情期。假孕的分析证实了阴道涂片在早上在刺激和连续几天前杀死。这控制一个重要的优势控制组成的循环产仔的老鼠,因为pseudopregnant老鼠一样的内分泌背景怀孕的女性。动物显示连续metestrus被公认为pseudopregnant显微图像。 At 3.5 days after mating, mice were euthanized by cervical dislocation.
2.3。脾细胞的分离
刚获得术后脾脏称重和立即推行了40μ米筛获得单个细胞悬液。这些细胞被孵化为1分钟0.84%氯化铵溶液中红细胞溶解。接下来,白细胞悬浊液离心(400克,5分钟)和上层的被丢弃。移除碎片,这些细胞被洗两次杜尔贝科的PBS (21]。
2.4。磁性细胞分选
CD11c+,CD11b+,F4/80+被孤立的暂停总脾细胞在PBS补充2毫米EDTA (Sigma-Aldrich,波兹南,波兰)和0.5% BSA (Sigma-Aldrich)根据制造商的指示。我们使用磁铁、列和磁标记抗体从Miltenyi研究。对于F4/80+细胞进行间接染色anti-F4/80 FITC (eBioscience,维也纳,奥地利)和anti-FITC磁珠,而CD11c+和CD11b+直接细胞被标记。CD4+T细胞是孤立的负选择(non-CD4枯竭的工具包+细胞)。脾的装甲运兵车,我们CD11c排序+在一开始,下一个F4/80+细胞,CD11b+细胞。在所有情况下分类细胞的纯度为85%或更高,由流式细胞术。
2.5。T细胞/ APC Cocultures
排序CD11c+,F4/80+,CD11b+细胞悬浮在RPMI 1640 (Sigma-Aldrich), 10%胎牛血清(FCS,英杰公司),和L-glutamine-penicillin-streptomycin股票从Sigma-Aldrich 1: 100和丝裂霉素C处理15分钟(圣克鲁斯生物技术),在37°C。在PBS三重洗涤后,这些细胞被resuspended完全RPMI 1640补充10μM卵子(Sigma-Aldrich)。计算后,细胞被稀释浓度的6105和50μL的悬架是添加到96 - U-bottom培养板(正)。细胞治疗和抑制亚美尼亚仓鼠anti-mouse CD80(克隆16-10A1)和抑制鼠anti-mouse CD86抗体(克隆PO3.1;所有功能级抗体购自eBioscience)。控制细胞接受适当的同形像控制:老鼠IgG2a或亚美尼亚仓鼠免疫球蛋白(eBioscience、功能级免疫球蛋白)。30分钟后我们添加了OT-II CD4治疗抗体+T细胞(6103细胞每)。每个是100的总量μL和最终每个抗体的浓度5μ克/毫升。细胞培养6天,5%的公司2在37°C。APC: T细胞比例为5:1。这些细胞被cocultured 132小时。
2.6。BrdU扩散分析
某些cocultures注定扩散与比色测定BrdU扩散酶联免疫试剂盒(罗氏)。简单,细胞治疗与溴脱氧尿苷(BrdU)结束前12小时孵化。板材的离心后,球团矿干了15分钟用吹风机和固定/变性在室温下60分钟(RT),根据制造商的指示。接下来,盘子被封锁的30分钟2% BSA溶液和BrdU被检测到直接染色anti-BrdU-POD抗体(90分钟,RT)。三重洗涤后,三甲的酶促反应的底物进行了7分钟,阻碍与H2所以4。吸光度与波长λ= 450海里后15分钟内测量H2所以4加法。从程序上执行不同的板块和天,同形像控制细胞治疗被认为是作为参考测量和costimulatory分子封锁的结果是被描绘成比例的参考价值。
2.7。细胞因子ELISA
上层清液从cocultures储存在收集后−80°C。IFN-gamma、2、il - 4、il - 10、il - 12和测量及使用小鼠从eBioscience Ready-SET-Go包。短暂,配角96 - ELISA板在一夜之间被涂上一层特定抗体(4°C)和阻塞1小时,rt,接下来,上层清液稀释1:10和标准浓度的细胞因子(100μ信用证在4°C)在一夜之间被孵化,洗了三次,孵化与生物素化的具体检测抗体(60分钟,RT)。经过进一步三洗,我们添加了辣根peroxidase-conjugated抗生物素蛋白和孵化30分钟的盘子,RT,洗盘子下孵化了10分钟在黑暗中在RT三甲衬底和抑制50μL 1 M H2所以4。一个450年在15分钟内分光光度计测量协议端点。
2.8。流式细胞术
细胞标记抗体和同形像控制都是购自eBioscience(美国),在PBS稀释2%正常小鼠血清(Sigma-Aldrich)。132小时coculture孵化后,细胞染色总量的50μL anti-CD4-FITC(克隆RM4-5,最终浓度1.2μg / mL)和anti-CD25-PE(克隆PC61.5, 0.24μg / mL)或同形像控制在同一浓度作为特定的抗体。在4°C 45分钟的孵化后,这些细胞被洗两次PBS缓冲甲醛,然后固定在1%。样本获得的FACSCalibur II血细胞计数器(Becton, Dickinson和公司)。我们进行了流式细胞仪分析来确定激活(CD4细胞总数的比率+CD25+未激活的T细胞(CD4)+CD25−)细胞。
2.9。统计数据
所有统计计算进行Statistica 7 (StatSoft)。数据分布的形状与夏皮罗的测试和分析评估quantile-normal情节。方差齐性检验与列文的测试。学生的- - - - - -测试(参数)或Wilcoxon(非参数)测试的基础上进行数据分布形状。
3所示。结果
3.1。OT-II CD4扩散+T细胞取决于CD86的可用性
评估的参与CD80和CD86分子活化的T细胞,我们丰富了小鼠脾装甲运兵车人口:巨噬细胞(F4/80+或CD11b+细胞和树突细胞(CD11c+细胞)。获得的细胞从pseudopregnant老鼠(控制)和动物交配(实验组)。接下来,装甲运兵车装有卵子和暴露于OVA-specific OT-II CD4细胞+T细胞。此外,cocultures治疗anti-CD80和anti-CD86阻断免疫球蛋白抗体或相关控制。6天后我们完成了测试核扩散和CD25表达T细胞激活的标志。扩散试验表明,在大多数情况下,治疗costimulatory分子与特定的抗体导致小鼠交配和pseudopregnant类似的效果。的封锁CD80显著增加T细胞的增殖F4/80的存在+细胞获得pseudopregnant动物(;图1(一))。尽管CD11b的能力+细胞引起T细胞增殖似乎相似,这个观察由于更高的差异不显著。微不足道的增加扩散anti-CD80治疗后也观察到的相同数量的装甲运兵车在怀孕。CD80分子封锁似乎完全不影响OT-II T细胞增殖与树突细胞在文化。另一方面,CD86的封锁导致这些细胞的增殖率下降与所有类型的文化研究装甲运兵车在怀孕(对于CD11c+细胞;对于F4/80+细胞;对于CD11b+cocultures)和假孕(,,职责。)(图1(一))。此外,我们进行了流式细胞仪分析来确定激活(CD25总数的比率+)和未激活的(CD25−)CD4+T细胞。代表流式细胞术dot-plots图所示2。CD25的比例的变化+/ CD25−T细胞数量与扩散收敛测试对F4/80 CD86的封锁+(在怀孕;在假孕)和CD11b+巨噬细胞(和、职责)。然而,CD11c待遇+/ T细胞cocultures anti-CD80 CD25下降导致+/ CD25−比(对于怀孕和假孕)(图1 (b))。值得注意的是,增生性反应没有影响在这些条件下(图1(一))。
(一)
(b)
3.2。细胞因子的资料不同Anticostimulatory分子的存在在体外
接下来,在上层清液从上述cocultures我们评估水平的干扰素-γ2、il - 4、il - 10、il - 12和TGF -β通过ELISA(图3)。干扰素-的浓度γ显著改变了只有在cocultures F4/80 OVA-specific T细胞+巨噬细胞(anti-CD80和anti-CD86治疗;图3(一个))隔绝pseudopregnant但不是交配的动物。- 2水平下调后堵塞CD80 F4/80+细胞分离交配(;图3 (b))和pseudopregnant (;图3(一个)老鼠)。在假孕我们也观察到- 2水平的降低文化包含CD86-blocked CD11b+细胞(;图3(一个))。只在anti-CD80-treated细胞il - 4浓度的影响。封锁的CD80 B6小鼠导致cocultures减少il - 4浓度与所有研究装甲运兵车人口(对于CD11c+细胞,对于F4/80+巨噬细胞,对于CD11b+细胞;图3(一个)我们观察到的),但在交配雌性显著减少F4/80的存在+(;图3 (b))在对比pseudopregnant mice-an CD11b cocultures增加+细胞(;图3 (b))。我们观察到降低il - 10浓度CD11c的存在+细胞在pseudopregnant和怀孕的老鼠(和、职责)。pseudopregnant和怀孕的老鼠与减少il - 10浓度与CD80-blocked cocultures F4/80+细胞(;图3 (b))和减少细胞因子水平与CD86-blocked cocultures CD11c+细胞(;图3(一个))。在il - 12的情况下,集中表达下调与CD11c cocultures+B6动物的细胞治疗anti-CD80 Ab ()和anti-CD86 Ab ()(图1(一))。il - 12水平是影响CD80的封锁所有研究APC人群隔绝怀孕的老鼠(对于CD11c+细胞;对于F4/80+细胞;对于CD11b+cocultures;图3 (b))。TGF -β浓度降低后的封锁刺激T细胞与F4/80 (anti-CD80 Ab)+细胞与控制(;图3(一个))和实验小鼠(;图3 (b))。然而,在动物交配但不是pseudopregnant anti-CD80 Ab治疗导致CD11c的浓度下降+细胞()。增加anti-CD86 Ab cocultures促使降低F4/80的水平+()(图3 (b))。日积月累,这些结果导致观察到主要costimulatory CD80分子影响怀孕的老鼠(表中分泌的细胞因子1)。
(一)
(b)
4所示。讨论
我们的研究对CD4+T淋巴细胞和细胞因子的分泌在活的有机体内(19),在体外条件突出CD80和CD86分子的截然不同的作用。数据涉及其他实验模型,如人类正常的怀孕和流产,实验性自身免疫性脑脊髓炎(运算单元),或利什曼病的小鼠模型,也表明微分这些costimulatory分子的行动。很明显,这些costimulatory分子参与细胞因子的调节生产。然而,每个人都可能参与细胞因子合成的规定不同。例如,CD86的信使rna表达水平,但不是CD80呈正相关,在人工流产(Th1细胞因子的水平22]。封锁模型的实验性自身免疫性脑脊髓炎CD80和CD86有不同的影响:封锁CD80与其配体相互作用导致生产Th2细胞因子和停止疾病的症状,尽管CD86屏蔽不良反应(23]。在利什曼病的小鼠模型的封锁CD86导致抑制Th1-type Th2细胞因子分泌和增强的免疫反应,而封锁CD80产生相反的效果24]。另一方面,在体外实验Th1 / Th2机制并不严格与CD80和CD86的存在。coculture实验数据的抗原T细胞与装甲运兵车CD80 KO隔绝或CD86 KO小鼠表明CD86,在较小程度上,CD80参与监管的干扰素-γ和il - 4生产,但没有优惠支持Th1、Th2反应(25]。相似之处CD80和CD86行动的范围下Th1 / Th2平衡被证明在其他实验模型,例如,在人类PBMCs或小鼠CD4细胞+T淋巴细胞培养在在体外条件(26- - - - - -28]。此外,细胞因子生产的结果依赖于其他因素,如抗原密度和启动/引发刺激。例如,如果CD4+较低的T细胞识别抗原亲和力/贪欲,他们致力于Th2细胞;否则,他们被重定向到Th1发展(29日]。此外,CD80和CD86可以不同的作用在启动或引发刺激,因为之前在体外研究表明,封锁CD86影响il - 4的生产,但CD80封锁有影响后才引发刺激,与il - 4和干扰素-γ(30.]。在怀孕,封锁CD80和CD86分子在小鼠早期妊娠abortion-prone (CBA / JxDBA / 2)增加产量的Th2细胞因子和频率Treg细胞,减少胎儿吸收(31日,32]。
在我们的在体外实验中我们观察到从CD4细胞因子的生产+OT-II T细胞后与脾装甲运兵车cocultured封锁CD80和CD86 Th1、Th2没有特别相关资料(表1)。然而,我们可以得出其他结论。首先,封锁的影响costimulatory分子与特定的Ab程控依赖。研究人群的脾装甲运兵车,阻塞主要F4/80 costimulatory分子的影响+细胞,而CD11c+和CD11b+细胞有针对性的程度不一样。在之前的研究中我们观察到,在一天胚胎3.5所有研究costimulatory分子(CD40、CD80和CD86)是调节F4/80表面+细胞,与CD11c人口+和CD11b+,观察到的增加表达的分子甚至没有(19]。因此,我们可以推测,F4/80+巨噬细胞可能是主要的小鼠脾细胞群装甲运兵车影响这些细胞在妊娠的胚胎植入前的时期,主要是与免疫反应的调节。其次,在怀孕最变化引起的封锁CD80和导致减少Th1、Th2细胞因子的分泌。只有及生产两costimulatory分子被封锁了。然而,细胞因子的增加生产(IL4和il - 12)也观察到,只有在CD11b+细胞。在假孕,costimulatory分子参与细胞因子的生产监管。第三,在怀孕的老鼠干扰素-γ生产并不是依赖costimulatory分子的可用性。此外,T细胞的增殖后减少的封锁CD86在怀孕和pseudopregnant老鼠而CD80封锁除了F4/80增生性反应没有影响+巨噬细胞刺激细胞群pseudopregnant老鼠,导致增加扩散。此外,CD25的变化比率+对CD25−T细胞与BrdU化验的结果是收敛的;对F4/80 CD86封锁+和CD11b+巨噬细胞抑制增殖和活化T细胞的生成。由于这种效应是不可见的与DCs cocultures的T细胞,这种观察表明CD86可能调节激活T细胞与巨噬细胞在他们交互。另一方面,anti-CD80治疗的效果有限的频率激活T细胞只有在DCs的存在,但不是巨噬细胞。然而,在这种情况下,扩散的强度没有影响,而研究细胞因子的浓度明显受到CD80封锁。因此,CD86似乎主要costimulatory分子参与增殖反应在怀孕和pseudopregnant老鼠,而CD80从事刺激细胞因子的生产,尤其是在怀孕的小鼠组(表1)。然而,在我们先前的论文表明,脾装甲运兵车怀孕的胚胎植入前的期间明显上调CD86, CD80表达一定程度上改变时(19]。因此,我们当前的观测表明封锁CD80减少细胞因子合成可以无关紧要在活的有机体内模型和需要更多的详细的分析。不过,CD86封锁的影响与我们以前的研究是一致的。我们假定CD86表达的调节巨噬细胞可能是一个重要的机制优化宽容的免疫反应在怀孕的早期阶段。
5。结论
总之,本研究表明,CD80和CD86 costimulatory不同调节OT-II CD4分子+T淋巴细胞增殖和细胞因子反应与抗原递呈细胞来源于cocultures孕妇和pseudopregnant老鼠。T细胞扩散取决于CD86分子的可用性,但CD80分子参与细胞因子分泌的调节怀孕的老鼠。看来CD80表型不促进细胞因子在怀孕生产。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突的报告。
作者的贡献
知识和技术的贡献和安娜Tomasz Maj Slawek研究都是平等的。
承认
这项工作是支持的波兰高等教育科技部,批准号474 / N-COST / 2009/0相关成本行动FA0702“孕产妇与配子和胚胎。”