文摘
很少有人了解的免疫调节潜力从海洋微生物次级代谢产物分离。在目前的研究中,我们pyrenocine的特点是,它是由marine-derived真菌青霉菌paxilli马(G) K和具有抗炎活性。Pyrenocine得以抑制,预处理和后处理,LPS-induced激活的巨噬细胞通过抑制亚硝酸盐生产和炎症细胞因子和PGE2的合成。Pyrenocine也表现出抗炎作用于受体的表达直接关系到细胞迁移(Mac-1)以及costimulatory分子参与淋巴细胞激活(B7.1)。亚硝酸盐生产被pyrenocine抑制巨噬细胞刺激的CpG但不是聚我:C,这表明pyrenocine行为通过MyD88-dependent胞内信号通路。此外,pyrenocine也能够抑制NF相关基因的表达κ由有限合伙人B-mediated信号转导在巨噬细胞刺激。我们的结果表明,pyrenocine已约定的消炎和额外的实验是必要的来证实这一发现在活的有机体内模型。
1。介绍
宿主免疫系统是一个复杂的炎症反应刺激等微生物感染,内毒素曝光,烧伤和组织损伤。常驻巨噬细胞对侮辱的第一道防线,在炎症的发展扮演着重要角色1,2]。这些吞噬细胞有多种受体表面膜,称为模式识别受体(PRRs),促进互动与许多分子出现在病原体,称为pamp(其分子模式)。PRRs如通常(toll样受体)与pamp,存在于细菌、病毒、寄生虫和真菌,这些交互发挥关键作用的激活吞噬细胞。脂多糖(LPS),这是由革兰氏阴性细菌,结合TLR CD14 /枸杞多糖组成的复杂/ TLR [1,2),导致的一个复杂的生化级联激活促进MyD88的招聘,蛋白激酶的激活,如伊拉克的招聘的适配器蛋白质TRAF6和NF的后续活动κB和AP-1在细胞核3]。胞质我κB只有磷酸化后由脂多糖刺激(有限合伙人),导致我的离解κB复杂和NF的易位κB进入细胞核,允许与各种基因的启动子区域编码促炎介质(4]。激活这些基因导致炎性细胞因子的过度生产包括TNF -αinterleukin-1 (il - 1)、il - 6和其他炎症介质,如一氧化氮(NO)和脂质介质,所有这些有害的作用在急性和慢性炎性疾病如动脉粥样硬化、关节炎5]。特别是,前列腺素E2 (PGE2)是一个主要的炎性脂质中介参与慢性炎性疾病,如类风湿性关节炎的发病机制(6]。PGE2合成发生在有干扰细胞膜,从而增加细胞内钙和易位的胞质膜磷脂酶A2 (cPLA2)核,紧随其后的是花生四烯酸(AA)的释放从核的磷脂膜。发布AA可以转化成PGH2存在COX-1(一种既定的表达在不同的细胞类型)和cox - 2(一种诱导酶),然后通过各种前列腺素合成酶的作用产生不同类型的后卫。PGE2是一个关键的脂质介质合成由巨噬细胞和其他细胞类型的有限合伙人(7]。除了促进水肿,PGE2可以间接法合成的调节不同的细胞因子和趋化因子(8,9]。PGE2在炎症在网站的发展过程中发挥作用的组织损伤与EP1 / EP3因此交互的首要目标潜在的抗炎药治疗急性和慢性炎性疾病(10]。
海洋微生物是独一无二的生物来源的强有力地活性次级代谢产物,已被调查在过去20年里,目的是发现新的药物(11- - - - - -13]。海洋真菌被认为是特别丰富的代谢活性天然产物来源(12- - - - - -16]。最近,我们从marine-derived孤立pyrenocine真菌青霉菌paxilli马(G) K。Pyrenocine以前曾有报道称,一个是一个抗疟和活跃的细胞毒性剂KB, BC-1,维罗癌细胞(17]。然而,没有报告描述pyrenocine的免疫调节活性。
识别潜在的新的抗炎药物的重要性,本研究的目的是调查pyrenocine的预处理和后处理抗炎潜力,阐明真菌代谢物的可能机制,通过它可以作用于免疫细胞。
2。材料和方法
2.1。Pyrenocine的分离和鉴定
Pyrenocine以前获得的增长marine-derived真菌的培养基p . paxilli马(G) K,这是孤立的海绵Mycale angulosa(18]。简单地说,p . paxilli马(G) K在500毫升Schott烧瓶内接种,每箱装200毫升2%的麦芽提取介质。真菌生长发生用颤抖(100 rpm)七天25°C。最后的增长时期,200毫升的乙酸乙酯(层)被添加到每个瓶。文化媒体混合物含有菌丝和层被摇晃在100 rpm 24小时25°C。然后,通过c盐混合物被过滤。层分数被液-液分离的分区。蒸发层分数产生了400毫克的提取、分离的色谱法在cyanopropyl-bonded硅胶盒(2 g;洗脱液:100% CH2Cl2甲醇层,100%,100%)。CH的2Cl2分数(130毫克)使用一个C是由高效液相色谱分离18反相柱Inertsil ODS-3 (mm;5μ米)的梯度1:1甲醇:MeCN在H2O + 0.1%甲酸(流量:1.0毫升/分钟;检测方法:紫外吸收254海里)。Pyrenocine(42.7毫克)被确定通过分析光谱数据和比较文学中的数据(18]。
2.2。细胞系的维护
生264.7细胞系,用于所有在体外实验中,从里约热内卢细胞获得银行(BCRJ / UFRJ)。生264.7细胞系小鼠白血病monocyte-macrophage细胞系。细胞毒性检测和抗炎活性测定,细胞解冻和扩展到细胞在DMEM培养瓶含有10%的边后卫(胎牛血清)和庆大霉素(1:1000)在37°C在孵化器湿润大气含5%股份有限公司2后,美国类型文化收集(写明ATCC)的指导方针。
2.3。细胞刺激:预处理和后处理协议、细胞毒性检测和细胞死亡
264.7原始细胞()分布在96 -孔板和用于预处理和后处理分析。冻干pyrenocine重组在DMSO溶液,然后在DMEM-I培养基稀释。预处理协议:pyrenocine(3.75至0.11μ米)添加到细胞培养2 h,并与LPS刺激,CpG或聚我:C (1μg / mL) 18 h在37°C。治疗后的协议:细胞与LPS孵化,CpG或聚我:C (1μg / mL) 2 h,然后pyrenocine被加入到细胞培养(3.75至0.11μ米)18 h在37°C。上层清液的收集和储存在−80°C直到可溶性介质进行量化。
细胞毒性是评估通过MTT和Alamar蓝试验和细胞死亡膜联蛋白V /π(BD生物科学)制造商的建议。
2.4。量化的亚硝酸盐
亚硝酸盐水平文化上层清液样本测量与格里斯试剂如前所述[19]。样品的吸光度测量的标540纳米过滤器(Biotek、模型960)。
2.5。细胞因子的量化和PGE2的水平
巨噬细胞细胞因子生产的量化与文化上层清液使用ELISA读者。水平的il - 1β、il - 6、il - 10、il - 12和TNF -α确定使用特定抗体(纯化和生物素化的)和重组细胞因子标准后,制造商的指令(Opteia B & D系统,MN和PharMingen,圣地亚哥,CA)。PGE2以文化上层清液使用PGE2的环评工具包单克隆抗体根据制造商的指示(开曼化学公司)。
2.6。流式细胞术
表面受体的表达(CD11b / CD18 B7.1、B7.2)测定治疗后264.7原始细胞与pyrenocine使用预处理和后处理过程如前所述。所有样品进行了分析使用FACSCanto流式细胞分析仪(Becton Dickinson和圣何塞,CA)和流式细胞仪天后软件。
2.7。RNA分离和定量rt - pcr
总RNA提取和纯化使用硅基自旋列(试剂盒RNeasy迷你工具包)后,制造商的指示。孤立的总RNA (5μg)是使用高容量reverse-transcribed cDNA逆转录工具包(猫。应用生物系统公司号码:4391526)。实时定量PCR(存在)进行实时PCR应用生物系统公司7500设备。选择目标基因测定以96 - (TaqMan表达板,自定义)TaqMan NFκB信号目标PCR定制阵列板(应用生物系统公司)按照制造商的协议。结果数据从三个独立样本分析的基础上统计分析和②相对量化的方法来演示的基因表达的变化20.使用参考内源性基因)Gapdh正常化。使用双尾学生的统计显著性计算以及。小于0.05的值被认为是重要的。
2.8。统计分析
结果提出了均值±SEM的至少三个不同的实验一式四份(PGE2、亚硝酸盐、细胞因子)。与GraphPad棱镜Instat-4进行了统计分析。三个或三个以上实验组之间比较,方差分析应用Bonferroni多个对比测试。rt - pcr计算使用双尾学生的统计意义测试。结果被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。Pyrenocine对细胞生存能力和抑制效果
Pyrenocine(图1)被隔离和标识如前所述18]。pyrenocine生264.7中细胞的细胞毒性评价的使用预处理和后处理协议有限合伙人。我们的研究结果表明,无论协议的使用,治疗pyrenocine浓度低于3.75μ导致100%的细胞生存能力。细胞治疗pyrenocine在7.5μM显示适度减少细胞生存能力(< 3%)(数据未显示)。最小化任何假阴性的结果由于细胞死亡而不是pyrenocine的抗炎作用,我们使用的浓度pyrenocine导致100%的细胞生存能力在随后的化验。pyrenocine 264.7在原始细胞的细胞毒性也评估了Alamar蓝试验(补充数据,图)通过膜联蛋白和细胞死亡/ Propidium碘(补充数据,图在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2014/767061)。我们在化验证明pyrenocine独自不诱导细胞死亡和通过其他方法确认pyrenocine用于所有实验的浓度低或任何细胞毒性。
随后,我们评估抗炎的潜在pyrenocine通过测量一氧化氮(NO)的生产。刺激巨噬细胞与LPS诱导高水平的生产相比,如果细胞。使用协议、预处理和后处理,我们证实pyrenocine能够抑制的合成没有浓度的方式相比,巨噬细胞刺激有限合伙人(图2)。pyrenocine上没有合成的抗炎作用明显甚至在低浓度和后处理协议(图更明显2)。治疗pyrenocine独自没有刺激影响原始264.7细胞;没有生产的数量是一样的未经处理的细胞(数据未显示)。
(一)
(b)
3.2。Pyrenocine可以抑制肿瘤坏死因子-α生产的巨噬细胞
接下来,我们评估是否pyrenocine也能够调节细胞因子的生产使用的实验方法。如图3,巨噬细胞分泌高水平的肿瘤坏死因子-α如果细胞相比,有限合伙人的存在(图3)。LPS-induced这些炎性细胞因子的合成被抑制pyrenocine一分之一浓度的方式与预处理和后处理协议。肿瘤坏死因子- pyrenocine的抑制效应α合成预处理过程时更明显(图3)。然而,治疗与pyrenocine巨噬细胞在有限合伙人不调节其他炎性细胞因子的合成,包括il - 1β、il - 6和il - 12,低影响il - 10的合成(数据没有显示)。
(一)
(b)
3.3。Pyrenocine抑制PGE2合成
巨噬细胞的刺激与LPS诱导合成的脂质介质如PGE2,一个主要的脂质炎性介质参与慢性炎性疾病,如类风湿性关节炎的发病机制(6]。因此,除了检查炎性细胞因子和不,我们评估的能力pyrenocine PGE2的表情合成的调节巨噬细胞与LPS刺激。如图4,LPS刺激诱导的合成高浓度的PGE2相比,如果细胞。治疗pyrenocine使用预处理过程抑制PGE2的合成大约30 - 50%相比,有限合伙人(图4(一)),并在更高浓度的pyrenocine后处理(图4 (b))。
(一)
(b)
3.4。抑制细胞表面受体参与细胞粘附和激活通过Pyrenocine
在炎症过程中,表面分子如Mac-1 (CD11b / CD18)及B7.1、B7.2仍旧扮演了一个重要的角色在迁移和活化的巨噬细胞21,22]。我们下一个评估是否pyrenocine能够调节分子的表达在巨噬细胞在炎症刺激(有限合伙人)。LPS刺激增加Mac-1的表达和B7.1相比,如果细胞(图5)。治疗巨噬细胞与pyrenocine与预处理和后处理程序减少B7.1和Mac-1在细胞表面的平均荧光强度(MIF)相比,巨噬细胞与LPS刺激。如图5(一个),预处理协议pyrenocine抑制Mac-1的表达水平相似,如果细胞(没有有限合伙人)。然而,pyrenocine治疗在有限合伙人的存在导致只有适度抑制B7.2巨噬细胞表面的表达(数据没有显示)。
(一)
(b)
3.5。的抑制效果依赖于MyD88 Pyrenocine
有限合伙人与CD14 / LBP / TLR4复杂,导致内MyDd88-dependent和MyDd88-independent通路的激活一个复杂的生化级联(1,2]。评估是否通过MyDd88-dependent pyrenocine发挥其抗炎作用和MyDd88-independent通路,我们刺激巨噬细胞与两个受体激动剂:TLR3配体(多聚肌苷酸)和TLR9识别配位体(CpG-ODNs)。多聚肌苷酸促进TLR3激活通过MyD88-independent通路(通过TRIF适配器分子),虽然绑定CpG TLR9识别诱发MyD88-dependent激活。然后,我们评估是否pyrenocine发挥其抗炎作用MyD88-independent或MyD88-dependent通路使用这两种受体激动剂(多聚肌苷酸和CpG-ODNs)工具来显示它。的CpG,预处理和后处理与巨噬细胞抑制的合成没有pyrenocine浓度的方式与CpG相比单独治疗(数字6(一)和6 (b))。然而,在这两种预处理和后处理的协议,pyrenocine无法抑制不合成与保利巨噬细胞刺激时我:C(数字6 (c)和6 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.6。影响Pyrenocine NF -κB-Dependent基因表达
我们评估43基因的表达,包括细胞因子,趋化因子,或其受体和组件的免疫反应,激活的NF -κ在巨噬细胞治疗后B信号高浓度pyrenocine使用预处理和后处理协议,在有限合伙人的存在。基因表达被认为是表达下调时相对量化(RQ)小于0.6和调节RQ超过1.4时相比LPS组没有pyrenocine a中移动时被认为是不变的值在0.6和1.4之间。对于大多数的基因测试,没有明显(值≤0.05)差异mRNA水平(数据未显示)。然而,促炎细胞因子的mRNA水平肿瘤坏死因子显著降低(图的预处理过程7)。Pyrenocine也可以起到抗炎作用减少特定mRNA的因素,如处于受控,Ccl2, Bcl2 Icam1 ptg,和Tlr2(图的预处理过程7),以及Icam1和Il1r在后处理过程(图8)。此外,pyrenocine增加抗炎细胞因子的mRNA水平Il10预处理和后处理协议(数字7和8)。一些基因没有放大(数据未显示),等Vcam1 Il12a,和Ccl20,表明RAW264.7细胞巨噬细胞无法抄写这些基因对有限合伙人的回应。相反,有些促炎基因调节与治疗后治疗,等Nos2 Il1a, Cd40和Il12b,但不是与预处理治疗,表明预处理过程能够表达下调炎性基因在应对有限合伙人(数据7和8)。
4所示。讨论
虽然海洋微生物是目前被认为是有效的活性次生代谢产物的主要天然来源,很少天然产品,已经从海洋微生物中分离出具有抗炎活性。例子包括salinamides A和B, depsipeptides海洋链霉菌产生的(23];cyclomarins,环肽也由海洋链霉菌(24];lobophorins A和B,这是复杂的大环内酯类从海洋放线菌分离的文化(25];mangicols A和B,从海洋真菌sesterterpenes孤立镰刀菌素heterosporum(26];mycoepoxidiene,由属的一种真菌Diaporthe(27]。从marine-derived Penstyrylpyrone、孤立青霉菌sp,发现抑制合成不,PGE2, il - 1β和肿瘤坏死因子-α在腹膜巨噬细胞刺激有限合伙人(28]。微生物发酵是一个持续的过程,寻找新的抗炎药物由海洋微生物是一个有吸引力的策略来促进生物活性化合物的生产。
评估一个特定的化合物的抗炎,有必要选择一个可靠的方法。我们的模型在体外研究,特别是利用巨噬细胞与炎症剂LPS刺激,使我们能够评估免疫调节化合物的影响可溶性炎症信号代理和细胞表面受体以及阐明作用机制来识别潜在的新炎症性目标。我们的方法的基本原理是基于巨噬细胞,是居民体内细胞,分布在不同的组织,在炎症过程中扮演着重要角色,多种细胞表面受体,允许强大的交互pamp,病原体存在的表面,以及抑制(有关分子模式分子)发布的细胞坏死。这里描述的结果证明pyrenocine,在液体培养基中产生的次级代谢物marine-derived真菌青霉菌paxilli马(G) K,施加强有力的预处理和后处理抗炎作用细胞的先天免疫反应。
的抗炎活性pyrenocine最初评估能力调节一氧化氮产量。治疗巨噬细胞与pyrenocine使用预处理和后处理过程存在的炎症刺激有限合伙人为强浓度抑制没有生产。激活巨噬细胞存在于受伤组织和炎症介质的主要生产商如促炎细胞因子和脂质介质,已与急性和慢性炎性疾病的恶化和发病机理(29日]。各种甾体和非甾体类药物(NSAIS)机制的行动,包括抑制促炎细胞因子和趋化因子的生产,包括TNF -α,il - 1、il - 6和引发以及没有合成的抑制(30.]。地塞米松与强有力的抗炎作用,合成糖皮质激素作为一线治疗炎症性疾病,如急性肺损伤、哮喘、风湿性关节炎(31日]。除了调节炎性细胞因子,有些药物能增加抗炎细胞因子的合成如il - 10,这是一种细胞因子间接调解的合成抗炎介质的能力,包括各种表面受体(32]。地塞米松旁边,从植物化合物,如乌索酸,有强大的抗炎效应促进巨噬细胞的抑制TNF -α从巨噬细胞il - 1、il - 6在有限合伙人以及costimulatory分子(CD80和CD86)在B细胞和T细胞增殖。乌索酸介导的抑制效果,至少在淋巴细胞,核易位的抑制NF -κB、NF-AT AP-1易位到细胞核。(33]。这里给出的结果表明,pyrenocine已经预处理和后处理对肿瘤坏死因子的合成——抗炎的影响α和PGE2的巨噬细胞与LPS刺激。治疗pyrenocine没有诱导增加il - 10版本,不管所使用的浓度和协议。虽然pyrenocine没有诱导il - 10的合成存在显著差异,预处理和后处理过程的有限合伙人增加的mRNA表达il - 10。这些结果表明,il - 10 mRNA表达的动力学和蛋白质生产可以解释这些矛盾的结果。
炎症细胞受伤组织的招聘是由化学引诱物和adhesion-promoting代理等整合蛋白(CD11b / CD18), selectins (L-selectin)和趋化因子(34]。促炎的招聘和激活巨噬细胞促进中性粒细胞通过释放细胞因子和趋化因子和表面分子的表达,如selectins和整合蛋白以及随后的适应性免疫反应细胞的招募。溶性炎症介质或刺激等也可以调节树突细胞costimulatory分子的表达B7.1、B7.2等,这对T细胞活化是必不可少的。Mac-1巨噬细胞上的表达很重要,不仅对于细胞单核细胞的招聘,信息接触,和激活,也为微生物吞噬作用[35]。我们的研究结果表明,预处理和后处理过程pyrenocine表面受体的表达促进了减少Mac-1 B7.1但只引起轻微降低B7.2表达式。也因此,pyrenocine抑制细胞因子合成和抑制表面受体的表达参与了细胞招聘和白细胞的激活。此外,pyrenocine抑制巨噬细胞介质,减少炎症细胞的招募受伤的组织,从而导致慢性疾病。
炎性巨噬细胞产生的可溶性介质提供了微环境所必需的招募中性粒细胞等炎症细胞,巨噬细胞,autoreactive T淋巴细胞。大量的没有和前列腺素E2 (PGE2)在炎症过程中产生伊诺和环氧酶2 (cox - 2)36]。Pyrenocine与预处理能够抑制PGE2合成协议只是温和抑制合成与后处理方法。同样的,页面表,一个主要的酶参与PGE2的合成,也抑制巨噬细胞治疗时pyrenocine使用预处理协议但不治疗后的协议。
评估分子机制参与pyrenocine抗炎行动,巨噬细胞被刺激,TLR3受体激动剂(多聚肌苷酸)和TLR9识别受体激动剂(CpG-ODNs)评价MyD88-independent MyD88-dependent信号通路,分别。由于没有抑制亚硝酸盐生产TLR3 /聚我:C,我们推测pyrenocine的抑制效应在巨噬细胞可能由MyD88-dependent途径。看来pyrenocine是选择性的抑制效应,因为它能够抑制特定生化级联,促进特定炎症刺激的抑制行为。当我们分析的影响pyrenocine NF的调制κB-dependent基因表达,我们观察到pyrenocine促进了基因的抑制等处于Ccl2, Icam1,Tlr2预处理程序和Icam1和Il1r除了抑制与后处理过程肿瘤坏死因子和ptg信使rna表达。相反地,pyrenocine增加抗炎细胞因子mRNA的表达il - 10治疗前和治疗后。我们的研究结果表明,pyrenocine downmodulate额外基因的表达可以参与炎症细胞的趋化性(处于受控,Ccl2)和一个整合素参与招聘和细胞激活(Icam)。
在一起,我们的研究表明,pyrenocine具有潜在的抗炎效应细胞的先天免疫反应;然而,潜在的预防性和治疗性应用pyrenocine需要评估在活的有机体内炎症小鼠模型。
5。结论
最后,我们证明了pyrenocine, marine-derived真菌的培养基中产生青霉菌paxilli马(G) K,促进免疫抑制效应通过抑制促炎介质(TNF -α和PGE2)和分子的表达参与了细胞迁移(Mac-1)和T细胞激活(B7.1)。我们的研究结果表明,pyrenocine抑制巨噬细胞激活,可能通过干扰MyD88-dependent途径而不是通过TRIF信号通路。Pyrenocine是能够抑制NF相关基因的表达κB激活巨噬细胞与LPS刺激。我们的发现表明pyrenocine新颖化合物与免疫抑制特性。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
人工智能Medeiros和n n Dejani参与研究设计。n . n . Dejani t·r·托莱多l . g . s . Monnazzi和m . h . Kossuga进行实验。r·g·s·Berlinck促成了新试剂或分析工具。l . g . s . Monnazzi n . n . Dejani t·r·托莱多r . g . s . Berlinck l . d . Sette和人工智能Medeiros进行数据分析。r·g·s·Berlinck、人工智能Medeiros和l . d . Sette或导致写作的文章中写道。t·r·托莱多和n . n . Dejani同样导致了这项工作。
确认
这项工作是企业管理学院德基金会支持的“尽管做Estado de圣保罗,巴西(FAPESP 2010/50190-2必须占州政府);慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府、巴西(CNPq 302097/2010-4);和Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量比(CAPES-PROEX)。米里亚姆·h·Kossuga谢谢FAPESP,必须占州政府博士后奖学金(2008/00331-9)。资助机构没有参与研究设计、数据收集、分析;决定发表;或论文的准备。
补充材料
补充图1:细胞生存能力分析。在18 h (A)治疗与pyrenocine(3.75 - -0.11µM)没有有限合伙人。(B)预处理过程:细胞与不同浓度的pyrenocine预处理(3.75 - -0.11µM) 2 h,然后用LPS刺激(1µg /毫升)在18 h。(C)后处理过程:细胞与LPS刺激(1µg /毫升)2 h,然后添加pyrenocine期间(3.75 - -0.11µM) 18 h。治疗后,Alamar蓝色试剂添加在同一时间点与LPS及18 h后吸光度是阅读在570 nm,分光光度计使用600 nm作为参考波长600 nm的值(归一化)。
补充图1 b。细胞死亡pyrenocine AnexinV /π。细胞治疗在18 h pyrenocine(3.75 - -0.94µM)没有有限合伙人。预处理过程:细胞与不同浓度的pyrenocine预处理(3.75 - -0.94µM) 2 h,然后孵化期间与有限合伙人(1µg /毫升)18 h。后治疗过程:细胞与LPS刺激(1µg /毫升)期间为2 h,然后添加pyrenocine 18 h(3.75 - -0.94µM)。控制:细胞治疗(没有pyrenocine或有限合伙人)。治疗后细胞收获,彩色膜联蛋白V / PI和FACSCanto机器上获得与FCS表达和分析软件。