文摘
背景。暴发性细胞因子受体信号的变化可能引发严重多发性创伤后病理改变。本研究的目的是评估创伤后先天免疫系统的失衡与一个特殊的关注统计/ soc家庭。方法。包括20 polytraumatized患者。血液样本被吸引0 h - 72 h后创伤;信使rna il - 10的表达谱,统计3,soc 1, soc 3被qPCR量化。结果。il - 10在创伤后早期mRNA表达显著增加。统计3 mRNA表达表现出显著的最大创伤后6 h。soc 1水平明显降低创伤后6 h - 72 h。soc 3水平明显高于nonsurvivors创伤后6 h。结论。我们提出一个串行顺序调查人类嗜中性粒细胞的il - 10的主要外伤病人评估mRNA表达谱,统计3,soc 1, soc 3。Posttraumatically,免疫紊乱是伴随着il - 10和统计3 mRNA表达显著增加,而soc 1 mRNA水平下降后受伤。我们可以证明死亡后创伤与更高的soc 3 mRNA水平已经在创伤后6 h。支持我们的研究结果,进一步的调查评估蛋白质水平的统计/ soc家庭的创伤后免疫失衡。
1。介绍
严重多发伤的免疫反应对人类健康仍然是一个严峻的挑战。创伤性损伤已经知道在免疫功能产生实质性的变化,该化合物的促炎称为激活全身炎症反应综合征(SIRS)导致免疫抑制和抗炎反应称为补偿抗炎反应综合征(汽车)。在多个创伤,这两种症状同时发生,这是最近描述为混合对手反应综合征(火星)1]。这通常cell-regulated先天免疫系统的严重失衡导致创伤后多器官功能障碍,甚至多器官功能衰竭。细胞分数的50 - 60%的白细胞,多形核白细胞内已被证明是关键效应细胞天生的炎症免疫反应(2]。典型,严重创伤导致立即hyperinflammatory响应与中性粒细胞活化,随后促炎白介素分泌物(如il - 6),通常引发进一步的upregulation主要抗炎介质,如il - 10 (3]。时机,控制,和程度的mediator-associated急性期反应损伤似乎明显影响这些病人的进一步的临床过程。以前的mRNA表达我们组的研究可能已经调查特定的信使rna表达模式和激活信号通路在单核细胞主要的创伤。我们的一个先例全基因组芯片分析可以确定地图(增殖)激酶p38物(Janus激酶),和c-Jun发挥重要作用在创伤后早期创伤患者,可能联系的基因转录增加这些因素不利的结果(4,5]。在这种背景下,转录的蛋白质家族信号传感器和催化剂(STAT)和抑制细胞因子的信号(soc)进入感兴趣的焦点。通过对守恒的丝氨酸、酪氨酸残基磷酸化统计Janus激酶和MAP激酶被激活的6]。激活后STAT蛋白功能合理的传感器响应细胞细胞因子信号的压力和调节器通过调节基因表达通过易位细胞核(7]。STAT蛋白都含有一个转录transactivation域以及磷酸化域木菠萝和MAPKs为最大统计函数(都是巨大的6]。STAT蛋白的酪氨酸磷酸化反应发生在细胞因子受体通过Janus激酶(激酶),这是通常被称为JAK-STAT通路(8]。以下当前的意见,必须深入理解底层的复杂调控通路在创伤后细胞因子障碍的情况下,大多数细胞因子已被证明使用Janus激酶信号传感器和催化剂的转录途径(9]。显然,统计3是诱导il - 6,密切与il - 10,与人类肝脏的急性期反应以及维护脓毒症(10,11]。soc基因是他们最可观的目标之一;他们进一步抑制细胞因子受体信号通常在一个负面的反馈循环(9,12]。soc蛋白质也绑定到木菠萝;尤其是soc 1和soc 3被评估是强烈的木菠萝抑制剂。
本研究的目的是评估创伤后障碍先天免疫系统的一个特殊的关注统计/ soc蛋白质家族。我们检查了il - 10的mRNA表达谱,统计3,soc 1, soc 3多个钝伤后嗜中性粒细胞在创伤后早期和关联水平不同的临床情况。因此,患者分布到不同的子组的损伤严重程度和结果。
2。材料和方法
2.1。研究设计
多个钝伤后病人)年龄在18岁和70年承认我们的一级创伤中心创伤后90分钟内被纳入本研究。签署知情同意了从每个病人或他/她的法定代表人的时间;从路德维希马克西米利安大学获得伦理委员会批准,德国慕尼黑(参考号:012/00)。患者没能活下来后第一个24小时创伤和一个孤立的脑损伤患者被排除在外。血液样本再次入院后立刻被吸引,6、12、24、48和72小时后的创伤。受试者被分配到不同的组对后两个临床条件:损伤严重程度评估新的损伤严重度评分(我们的病人集体中间尼斯的41分截止)和结果(创伤后的生存90天)13]。各种临床资料如年龄、性别、损伤程度、损伤模式,和心血管功能参数记录。
2.2。样品收集
总量的30毫升的EDTA全血了。红细胞裂解是由添加42.5毫升的血液细胞裂解缓冲NH(155毫米4KHCO Cl, 10毫米30.1毫米EDTA, pH值7.2)为每个7.5毫升EDTA-anticoagulated全血。随后样本在450 g离心10分钟。实现定量红细胞清除的细胞球,两个额外的溶解和离心步骤进行。由此产生的细胞球被resuspended在500毫升的磷酸盐PBS / EDTA和粒细胞进一步稀释分离如下所述。
2.3。粒细胞和RNA分离孤立
粒细胞细胞分离使用magnetic-activated进行细胞分类(mac)方法,这是一个特别积极的免疫磁分离技术各种细胞根据其表面抗原。我们使用anti-CD15 antibody-coated微磁珠隔离嗜中性粒细胞,嗜中性粒细胞表达CD15抗原表面。嗜中性粒细胞粘附CD15抗体磁珠,从而可以积极地分开。在细节,细胞被稀释在800毫升的PBS / EDTA缓冲区和孵化200毫升anti-CD15 antibody-coated微磁珠(Miltenyi生物技术,赤褐色,CA) 15分钟在4°C。孵化后,音量调整到15毫升用PBS / EDTA缓冲区,和细胞颗粒状离心10分钟450 g。细胞颗粒在500毫升resuspended PBS / EDTA缓冲区,并添加到preequalized设计使用磁磁选柱细胞分离器Mini-MACS系统(Miltenyi生物技术)。列被三次。细胞悬液细胞溶解在2毫升RLT缓冲区(试剂盒、希尔登,德国)含有0.1% (v / v) beta-mercaptoethanol并储存在-80°C。细胞溶解的总RNA制备粒细胞进行使用RNeasy Midi设备根据供应商的指令(试剂盒、希尔登,德国)。核酸消化了DNase根据制造商的指导方针(RNase-free DNase设置;试剂盒、希尔登,德国)。孤立的浓度用分光光度法测定RNA (260 nm,光度适应计,埃普多夫,汉堡,德国)。作为总RNA的完整性对qPCR精度具有明显的影响,整体质量评估RNA制备的变性琼脂糖凝胶电泳。
2.4。实时定量PCR (qPCR)
8.2的整除μL标准为1μ克与禽成髓细胞瘤virus-reverse反向转录RNA转录酶(AMV-RT)和oligo-p (dT)15底漆后生产的指令(1日链cDNA合成装备,罗氏,曼海姆,德国)。变性后15分钟(Thermocycler 65°C),样本冰5分钟和孵化生产的混合液(11.8μL包括MgCl2、desoxynucleotid-mix oligo-p (dT)15底漆,lamv逆转录酶和核糖核酸酶抑制剂)。获得cDNA用水稀释1/25和10μL是用来放大。目标基因表达的定量分析是进行实时PCR的LightCycler使用光周期计快速启动DNA主人SYBR绿色我装备根据生产指令(罗氏,曼海姆,德国)。标准和引物设计的搜索LC(德国海德堡;LightCycler底漆集)。qPCR是由变性和聚合酶激活10分钟(95°C),放大的qPCR产品45-cycle一步PCR包括变性(95°C, s) /退火(68°C-58°C,−0 5°C /周期)/扩展(72°C, 16 s)为每一个圆。负面的结果控制样品(NTC)设置为基线水平。结果qPCR标准化这个基线水平,并为/ 50 ngRNA副本。特异性扩增产品被融化曲线分析结合琼脂糖凝胶电泳。对每个基因PCR准备效率标准曲线。标准曲线的斜率是qPCR效率; slope varied from −3.3 to −3.5 in our study.
2.5。统计分析
数据统计分析使用弗里德曼重复测量方差分析是比较几个依赖现场测试方法来测试关于时间点的显著差异(0 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h,和72 h)。在显著差异的情况下我们使用Student-Newman-Keuls测试(SNK测试)。使用非参数Mann-Whitney——子组进行测试U测试(U测试)。结果被宣布为平均值(意味着)平均数标准误差(SEM),被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。临床基线特征
20 polytraumatized患者(13男7女)呈现一个尼斯> 16分是参加本研究根据上述入选标准。病人的肆虐在18岁到70岁(平均±扫描电镜:年)的尼斯20到75点(意味着±SEM:)。4名患者(20%)死亡;16个病人(80%)幸存下来观察90天。
回顾中,我们把病人分成两组集体关于损害严重程度;我们使用的截断值41分中值显示尼斯在所有患者(组1:尼斯< 41岁;组2:,)。有9个病人尼斯少于41分;7人是男性;两个女性。平均年龄为45.5±4.0(平均±SEM)年;尼斯是27.1±2.1(平均±SEM)点。这一组两个病人死于创伤后90天内。有11个患者尼斯等于或超过41点;6男5女。平均年龄为37.3±3.5 (MW±SEM)年; mean NISS was 52.4 ± 2.4 (mean ± SEM) points. In a second step, we separated the collective into two groups (group A: survivors,;B组:nonsurvivors,)关于临床参数的结果(创伤后90天的生存)。16个病人存活(11男性和女性的平均年龄5(平均±SEM)年)。的意思是尼斯在这个subcollective(平均±SEM)点。四个病人死去的在这个时间框架(2男2女,平均年龄(平均±SEM)年)。意味着在这个群是尼斯(平均±SEM)点。临床数据的20名患者都浓缩在桌子上1。
3.2。il - 10 mRNA表达水平(图1)
我们的研究结果显示明显高于mRNA表达的il - 10水平在所有患者粒细胞前三天过程中经过多次创伤与初始值的住院检查。il - 10 mRNA表达明显高于在病人尼斯少于41分(组1)24日,48和72 h后创伤。两组(组1和2)显示显著提高il - 10 mRNA表达水平的检测时间点相比,入院时检测到的值(0 h)。幸存者之间没有明显差异(A组)和nonsurvivors (B组)。
(一)
(b)
(c)
3.3。统计(图3 mRNA表达水平2)
统计3表达水平增加在创伤后早期重要的峰值在创伤后6 h。考虑临床参数损伤严重程度和结果,统计3 mRNA水平更高的患者更少伤害严重程度(组1)比更严重受伤的病人(组2)。病人去世后的后续90天内创伤事件(B组),直接显示统计3表达较低(0 h)后创伤幸存者的subcollective相比(a组)。然而,仅表现倾向的表达水平无显著差异。
(一)
(b)
(c)
3.4。soc(图1 mRNA表达水平3)
关于时间的课程(6 - 72 h), soc的mRNA表达1相比显著降低mRNA表达创伤后初步确定(0 h)。soc 1没有明显差异表达谱后将病人分成不同的子组根据临床条件下损伤严重程度和结果。
(一)
(b)
(c)
3.5。soc(图3 mRNA表达水平4)
在观察到的72 h内多发伤后,soc的mRNA表达3高录取,其次是减少所有的病人。六个小时在创伤事件后,soc 3 mRNA表达明显高于患者(B组)去世后90天内创伤幸存者相比(A组)。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
重大创伤带来的发展严重的全身炎症反应和复杂的免疫障碍(14]。在这种背景下,重型细胞因子受体信号的变化可能引发严重的病理变化,尤其是在免疫和血液细胞。当前的意见后,各种细胞外蛋白,与细胞表面受体结合,能够引起这种变化通过改变他们的基因表达谱。因此,我们评估上mRNA的表达il - 10多个损伤的影响,统计3,soc 1, soc 3在中性粒细胞。主要发现在这个研究提出一个显著增加il - 10的mRNA表达多个钝伤后所有患者以及早期的一个非常重要的感应统计3 mRNA创伤后六个小时。此外,soc 1 mRNA表达水平显著下降的时间相比,soc 1水平衡量入学。关于幸存者的子群,soc 1 mRNA水平也显著降低创伤后观察期间(6 h - 72 h)相比,soc 1 mRNA表达入院时检测到。考虑soc 3 mRNA水平,我们的研究可能表现出显著相关性临床结果已经在创伤后6 h nonsurvivors soc水平3 mRNA的表达显著高于幸存者。
统计和soc,都可以发挥关键作用,以防炎症、创伤和烧伤,但尚未进行的多个创伤(9]。
4.1。il - 10 mRNA表达
我们可以显著增加的il - 10 mRNA表达多个钝伤后所有患者;这种动态polytraumatized患者创伤后il - 10的生产已经描述(15]。1组和2组比较,mRNA表达明显高于在患有中度损伤。这个结果与其他研究创伤病人集体。最少、il - 10 mRNA表达谱会与损伤的大小(15,16]。但是,il - 10的确切性质反应后创伤性损伤或冲击仍然是有争议的。一些研究表明,il - 10水平高是有害的调停创伤后免疫抑制,而其他人认为高il - 10水平是有益的(17]。潜在有益的底层机制包括减少促炎反应以优化组织修复和愈合的潜力影响自身带有的需要一个执行支持和抗炎介质之间的平衡。可能更高水平的抗炎il - 10 mRNA表达水平在受伤的病人(组1)可能反映生物体的成功尝试达成临时和平衡在这个subcollective创伤后全身炎症反应。因此,我们的研究结果支持这一概念,早期il - 10表达降低可能是重要的阻尼postinjury免疫改变。
4.2。统计3 mRNA表达
统计3 mRNA表达显示增加水平的创伤后早期重大创伤性事件后6小时的最高水平。早期诱导统计3 mRNA表达是按照已知的创伤后各种细胞因子的浓度增加,如白介素、多发伤患者(18]。激活胞质统计3迅速累积在原子核在il - 6刺激19,20.]。相关统计3 mRNA表达谱与损伤程度、我们的结果没有显示出显著的差异。趋势,但我们的研究结果显示更高的mRNA水平在严重受伤的病人(组1)。这个结果符合前面提到的il - 10 mRNA表达水平的结果。在这两种情况下,信使rna表达水平更高的病人呈现与尼斯少于41分;这个结果可能会是相同的方式。很有可能,统计3不同监管过度和无节制的促炎细胞因子创伤后反应更成功在这subcollective调停il - 10诱导抑制性效应。缺少的意义可能是一个原因,它是一个关键定义达标为了形式二分临床组。由于没有任何信息或建议ISS限制我们所知,我们选择了ISS值中位数(41分)区分中度和重度损伤。
4.3。soc 1 mRNA表达
考虑动态的soc 72 h mRNA表达模式在所有患者主要的创伤后,soc 1水平明显在创伤后的时间表达下调。我们也可以在三组状态明显降低,严重和严重受伤的病人以及幸存者显示减少的soc 1 mRNA表达而初始值。soc 1是与炎症的抑制调节先天免疫细胞和多发地细胞通过与Janus激酶的催化活性和预防(9,12]。因此,我们预期的upregulation soc蛋白质根据high-measured创伤后il - 10和统计3水平。但令人惊讶的是,soc 1 mRNA表达降低多发性损伤后在我们的样例。几项研究已经强调了重要的soc作为负反馈蛋白质限制chemokine-induced免疫细胞的迁移21,22]。可能,我们的结果可能会被理解为一个细胞因子信号的差别没有对这些失踪的mRNA upregulation soc 1。另一个假设的解释我们的发现可能是这一事实有可能差异对mRNA表达水平和蛋白表达水平。将生物活性蛋白质水平变化可能不会轻易和必然反映在信使rna基因表达水平。
4.4。soc 3 mRNA表达
在所有患者中,soc 3 mRNA表达显示入院时的最高水平。眉目传情等人表明,il - 10和soc 3 mRNA表达谱高架热损伤后在他们的样品12]。我们的数据状态相当超表达的il - 10以下重大创伤和另外一个非常高,soc 3的直接表达,其次是减少直到受伤后24小时。在我们的研究中,这种创伤后减少的soc 3 mRNA水平(6 - 72 h)是伴随着显著增加统计3 mRNA水平后直接创伤(6小时)和进一步无意义的增加(12 - 72 h)。通常,JAK-STAT-pathway诱发soc 3的表达,以关闭il - 6信号。我们的研究结果证明了一个反周期mRNA表达谱的动态统计3和soc 3。可能,我们的结果可以解释为一个失活提到的反馈回路在创伤后免疫障碍的一个子集。在这种背景下,“SOCS-3沉默”可能允许本构统计3信号。
值得注意的是,soc 3 mRNA表达显示不同的高水平nonsurvivors关于整个创伤后时期重要的超表达的soc 3 nonsurvivors创伤后六个小时。这些结果后,生产过剩的soc 3 nonsurvivors在我们的研究是与不良的结果。在一个小鼠模型soc 3缺陷似乎保护小鼠免受内毒素;显然,他们受益减少炎性细胞因子反应由于增强抗炎效果统计3 (23]。在我们的例子中,soc 3 mRNA表达降低可能是一个迹象有限有益immune-damping统计3和效果从而带来不良的结果。
4.5。病人
的性别、年龄、损伤程度、损伤机制和死亡率样本与其他报道组织(DGU TraumaRegister, 2012)。作为初始创伤后时期似乎预测发展的先生们和随后的临床结果,课程的生殖免疫事件在这个“小窗”需要连续考试捕获的底层复杂性创伤后免疫反应(24,25]。
4.6。方法
粒细胞的分离进行了使用anti-CD15 antibody-coated微磁珠(美国CA Miltenyi生物技术,奥本)按照制造商的指示。这个方法是复制的高纯度分离细胞分数(26]。不同的方法在文献中报道像后密度梯度离心已被证明导致更高的免疫细胞激活(27- - - - - -29日]。另一种负免疫磁分离技术生产高选择性细胞分离,但不幸的是只有小细胞复苏(相关30.]。核mRNA和cDNA制备方法和qPCR经常被执行和描述在文献中已知的和有效的方法31日,32]。在我们的研究中,我们调查了mRNA表达模式在嗜中性粒细胞,在先天免疫反应作为其关键作用严重受伤后经常被限制。50 - 60%他们的主要部分循环白细胞和影响创伤后免疫障碍导致器官功能障碍的创伤患者通过细胞因子信号(33]。
4.7。本研究的局限性
一个限制我们的研究,我们主要关注在一个细胞(中性粒细胞)mRNA表达谱。对于我们的呈现结果,评估信使rna基因表达水平可能表达有关生物功能有限,随着mRNA水平不一定与蛋白质水平。尤其是细胞因子il - 10等构成几个转录后的调控过程,很影响后蛋白质浓度水平。然而,优势在研究基因表达水平和概要文件的检测早期细胞内转录组的变化。进一步阐明整个这个途径的复杂性,蛋白质水平分析和调查在转译后的修改会给重要的进一步信息,目前正在进行中。
5。结论
我们提出一个串行顺序调查人类嗜中性粒细胞重大创伤患者评估mRNA的表达il - 10的概要文件,统计3,soc 1, soc 3。Posttraumatically,免疫紊乱伴随着il - 10和统计3 mRNA表达的显著增加(6小时),而soc 1 mRNA水平减少受伤后。创伤后我们可以进一步表明,死亡与更高的soc 3 mRNA水平已经在创伤后6 h。支持我们的结果进一步的调查集中在蛋白质水平的统计/ soc家庭的创伤后免疫失衡。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。