文摘

背景。Interleukin-37 (IL-37),新描述IL-1family成员,是天生的一个基本抑制剂炎症和免疫反应,尤其是其同种型IL-37b。客观的。本研究评估IL-37b的表达和调控进行儿童过敏性鼻炎(AR)。方法。40名儿童与AR和25正常对照组都包括在内。IL-37b之间的关系和Th1/2血清中细胞因子的生产和鼻腔灌洗了酶联免疫吸附试验(ELISA)。外周血单核细胞(PBMCs)纯化IL-37b体外调控实验。鼻内mometasone糠酸盐是基于“增大化现实”技术的儿童和IL-37b变化一个月治疗后使用ELISA检测。结果。我们观察到显著降低IL-37b表达水平在血清和鼻腔灌洗与控制。IL-37b与Th2细胞因子负相关。我们的研究结果还表明,IL-37b下调Th2细胞因子表达的PBMCs这调制是通过增殖蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3-kinase PI3K通路。我们还发现,鼻内mometasone糠酸盐治疗能促进鼻IL-37b表达式。结论。IL-37b可能参与Th2细胞因子调节AR及其表达与鼻腔类固醇治疗的疗效。

1。介绍

变应性鼻炎(AR)是全球儿童常见病10 - 40%的发生(1,2]。它会影响生活和性能的儿童和它往往伴随着哮喘3]。T细胞2型(Th2)炎症伴有嗜酸性粒细胞浸润症病理变化特点是在基于“增大化现实”技术4,5]。浸润的T细胞、B细胞、浆细胞、嗜酸性粒细胞,嗜碱性粒细胞,中性粒细胞和激活基于“增大化现实”技术的出现引起的Th2细胞(6]。大多数研究病理生理机制的基于“增大化现实”技术的关注促炎细胞因子,而抗炎细胞因子尚未引起足够的关注。

Interleukin-37 (IL-37)是一种新近发现的抗炎细胞因子,可以绑定到IL-18-receptor (R)和IL-18-binding蛋白质(BP) (7,8]。IL-37可以分泌单核细胞,巨噬细胞,上皮细胞,等等9]。IL-37表达在正常和肿瘤组织在人类产生抗炎作用通过抑制先天免疫反应降低炎性细胞因子的生产(10]。IL-37有五个不同的亚型,其中IL-37b是最大的同种型,它被认为是抑制促炎细胞因子的生产和树突状细胞(DC)激活(8]。IL-37b在自身免疫性疾病最近特征。据报道,在类风湿性关节炎IL-37b表达升高,患者鸟型分支杆菌感染、动脉粥样硬化冠状动脉和颈动脉斑块,银屑病斑块和克罗恩病(10,11]。然而,IL-37b在变应性疾病中的作用不是特征。

在我们目前的研究中,我们试图确定IL-37b的表达在血清和鼻腔灌洗的基于“增大化现实”技术的影响儿童和IL-37b Th1/2细胞因子的生产和相关信号通路。

2。方法

2.1。病人

40名儿童(< 18岁)中加入了基于“增大化现实”技术的研究。诊断是建立在历史、临床检查、皮肤针刺试验,测量和特定的IgE,是按照过敏性鼻炎及其对哮喘的影响(咏叹调)指南(2010)12]。,儿童哮喘是哮喘诊断根据全球倡议(吉娜)标准(13]。25个孩子相似的年龄和性别无过敏性疾病史或喘息被选为对照组。那些慢性病(如营养不良、呼吸系统的解剖畸形、慢性肺病、心脏病、胃食管反流病,和囊性纤维化)和患有慢性吸毒的历史(例如,口腔或鼻腔糖皮质激素、抗癫痫药和免疫suppressives)被排除在研究之外。组织从下鼻甲九AR(13 - 17岁)儿童和八个控制(13 - 16岁)进行下鼻甲切除术由于严重的鼻塞引起的下鼻甲肥大取样检测。

2.2。血液和鼻腔灌洗样品制备和分析

静脉血样收集到Vacuette管和离心机在1000克15分钟4°C。血清样本存储在−80°C。这些样本用于酶联免疫吸附试验(ELISA)和qPCR测量。全血细胞计数测量了lh - 785系统(贝克曼库尔特,Mervue Galway,爱尔兰)。血清总IgE测量了电化学发光(ECLIA)方法使用一个elx - 800系统。

使用生理盐水鼻腔灌洗进行加热到37°C。在其他地方所描述的过程根据执行方法(14]。由于合作的儿童,28 AR和15控制收集样品。样本离心去除细胞碎片和整除的上层清液储存在−20°C在埃普多夫管,直到分析。总蛋白浓度测定与Bio-Rad蛋白质化验据布拉德福德(15]。

2.3。ELISA对蛋白质表达和ECLIA嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)蛋白表达

ELISA试剂盒用于测量IL-37b, il - 4, IL-13 IL-5,白介素、干扰素γ和il - 10(所有从研发系统,美国)血清中水平,鼻腔灌洗,上层的外周血单核细胞(PBMCs)。ECP水平检测到其他酶联免疫试剂盒(EIAab,武汉,中国),根据制造商的协议。检测化验的限制如下:IL-37b (125 pg / mL), il - 4 (1.56 pg / mL), IL-13 (93.8 pg / mL), IL-5 (7.8 pg / mL), il - 12 (2.5 pg / mL),干扰素-γ(12.5 pg / mL)和il - 10 (3.9 pg / mL)。

2.4。实时聚合酶链反应分析

如前所述(执行实时聚合酶链反应16]。粘膜组织的总RNA提取使用试剂盒试剂(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指示。逆转录(RT)是执行,2的互补脱氧核糖核酸合成μg总RNA的使用一个低聚糖(dT) 18个引物和M-MLV逆转录酶(豆类,Syuzou、志贺、日本)。信使rna表达决心使用ABI棱镜7300检测系统(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)和SYBR预混料Taq(豆类)。引物的序列如下:IL-37b,正向引物:5′-CTCCTGGGGGTCTCTAAAGG-3′,反向引物:5′-TACAATTGCAGGAGGTGCAG-3′;肌动蛋白,正向引物:5′-CAGAGCAAGAGAGGCATCCT-3′,反向引物:5′-GTTGAAGGTCTCAAACATGATC-3′;棱镜样本包含1SYBR绿色主人混合,1.5μL (5μ25 M引物,ng的合成cDNA 25μL体积。反应混合物加热到95°C 10分钟,其次是40周期在95°C的变性10年代,60年代在60°C和退火扩展。PCR反应都是在重复执行。融化曲线分析被用来控制放大特异性。复制为每个样本的平均值计算阈值(Ct)值表示为一个周期。确定每个目标基因的相对表达之间的差异(ΔCt)的Ct值的目标基因和Ct值肌动蛋白。褶皱的变化确定目标基因mRNA。

2.5。免疫组织化学染色(包含IHC)

免疫组织化学的幻灯片放在0.3% H₂O₂在室温下20分钟,以减少非特异性背景染色由内生氧化物酶引起的。再次与PBS额外清洗后,幻灯片中煮10毫米柠檬酸缓冲15分钟之后,在室温下冷却。IL-37b抗体(美国Abcam和创造性BioMart)、白介素(美国研发系统)、il - 4(研发系统、美国),il - 1(美国研发系统)和免疫球蛋白(控制、Dako、丹麦)孵化一夜之间在4°C免疫组织化学染色,分别。第二天,幻灯片用PBS和孵化与二次抗体共轭streptavidin-horseradish过氧化物酶(基因科技、上海、中国)在室温1小时。

洗后,轻拍(基因科技,中国上海)染色显微镜下进行。与蒸馏水冲洗后,与迈耶的苏木精复染色的部分(中山Goldenbridge,北京)进一步25秒,与一系列乙醇脱水(v / v, 90% - -100%),清除脂质与二甲苯(3次),安装和中性胶(中山Goldenbridge,北京)。控制非特异性染色总是执行与PBS但抗体,证明负二次抗体。

的部分是盲目地检查和编码没有意识的临床数据。他们是可视化的奥林巴斯CX40显微镜(奥林巴斯欧罗巴GmbH,德国)。阳性细胞的数量(棕色细胞)计数在10高倍率(×200)和平均视觉领域。

2.6。PBMCs准备

PBMCs分开20毫升的肝素化全血从基于“增大化现实”技术的孩子。具体来说,细胞被Lymphoprep孤立(费森尤斯公司Kabi挪威,奥斯陆,挪威)密度梯度离心法从肝素化leucocyte-enriched巴菲外套。然后,PBMCs培养在2 * 10⁶/毫升24-well盘子培养基:RPMI 1640补充5%人类AB血清5更易/ L谷氨酰胺,青霉素,链霉素溶液(从英杰公司所有,血清从Sigma-Aldrich除外)。刺激是通过添加rhIL-37b执行(1 - 100 ng / mL)有或没有其他细胞因子(保利(我:C) (1 ng / mL) rhIL-4 (1 - 100 ng / mL) rhIL-5 (1 - 100 ng / mL) rhIL-13 (1 - 100 ng / mL) rhIL-12 (1 - 100 ng / mL) rhIFN -(1 - 100 ng / mL) rhIL-10 (1 - 100 ng / mL) SB203580 (10mol / L), LY294002 (10mol / L)。所有上述刺激器来自研发系统。

2.7。人类外周血嗜酸性粒细胞纯化和鉴定

外周血嗜酸性粒细胞得到的异位的捐助者(血嗜酸性粒细胞水平5 - 10%)MACS-negative immunomagnetic分离(如前所述17]。细胞的纯度是98 - 100%(木村染色)和生存能力大于98%(台盼蓝染色)。孤立的嗜酸性粒细胞停牌rpmi - 1640年补充heat-inactivated 10%胎牛血清(FCS), 2毫米谷酰胺,100 U /毫升青霉素,100克/毫升链霉素。嗜酸性粒细胞(500L, 10⁵/毫升)治疗有或没有rh-IL-37 (1 - 100 ng / mL)和eotaxin (1 ng / mL)。ECP蛋白质变化Unicap系统探测到。

2.8。鼻内Mometasone糠酸盐治疗

基于“增大化现实”技术的孩子接受了四周的鼻内mometasone糠酸盐(50μg每粉扑鼻孔两个鼻孔,每天一次)。治疗结束时,鼻子症状(流鼻水,打喷嚏和鼻塞),眼部症状(流和肿胀,发红,瘙痒)和肺部症状(呼吸困难、咳嗽、喘息、胸闷)被孩子们得分如下:0 =没有症状,1 =轻微症状,2 =中度症状,3 =严重症状。此外,血液和鼻腔灌洗样本收集和IL-37b蛋白表达的变化与ELSIA检测。

2.9。统计分析

所有数据都表示为均值±SD除了额外的注意。不同群体之间的统计学意义使用非参数Mann-Whitney决心测试。斯皮尔曼等级相关的测试是用于分析生物标志物的表达之间的相关性及临床阶段。被认为是显著性差异。

3所示。结果

3.1。人口和实验室研究的人口特征

本研究对65名儿童,其中40 AR,年龄16至187个月(平均年龄:月,男性22日),和25人是健康对照组的年龄介于15至184个月(平均年龄:个月,11名男性)。人口的人口特征和实验室参数表1。哮喘被发现AR儿童的25%。两组比较时,嗜碱细胞计数,嗜酸性粒细胞计数,血清总IgE,和ECP水平被发现是基于“增大化现实”技术没有哮喘组高于对照组,尤其在AR与哮喘组。

3.2。减少IL-37b mRNA和蛋白水平与Th1 / Th2 Treg细胞因子在基于“增大化现实”技术

血清在AR和地方IL-37b mRNA和蛋白表达显著低于正常对照组(,数据1(一)- - - - - -1 (d))。然而,当我们AR组细分成哮喘和nonasthma集团,我们发现两组之间没有IL-37b表达水平差。IL-37相比我们还表达AR孩子> 6岁和< 6年之间,未发现差异(数据没有显示)。我们的结果显示增强il - 4、IL-13 IL-5蛋白表达,特别是在儿童哮喘和降低il - 12,干扰素-γ鼻灌洗,血清中il - 10蛋白表达和AR儿童与对照组相比,数据2(一个)- - - - - -2(左))。鼻il - 4、IL-5 IL-13与当地IL-37b负相关(,数据3(一个)- - - - - -3 (c))。血清ECP IgE水平以及嗜酸性粒细胞计数被发现与血清IL-37b表达式(负相关,数据3 (g)- - - - - -3(我))。没有IL-37b和il - 12之间的关系,干扰素-γ发现,il - 10(数字3 (d)- - - - - -3 (f))。

3.3。减少IL-37b包含IHC AR的表达

在正常组织中,一些上皮细胞、间质细胞和腺体细胞阳性IL-37b和IL-37b免疫反应性显著增强在控制与基于“增大化现实”技术(数据样本4(一)和4 (b))。我们也可以发现il - 12(数字4 (c)和4 (d))、il - 4(数字4 (e)和4 (f))和il - 1(数字4 (g)和4 (h)),结果表明,基于“增大化现实”技术的il - 4和il - 1阳性细胞数量显著高于控制,而il - 12阳性细胞表现为相反的趋势(表2)。

3.4。IL-37b监管Th2细胞因子表达在PBMCs增殖蛋白激酶(MAPK)和Phosphatidylinositol3-Kinase PI3K通路

与不同浓度的刺激后rhIL-37b (1 - 100μg),我们发现的差别明显对这些Th2细胞因子(il - 4、IL-5 IL-13)以时间和剂量依赖的方式,这种效应被治疗后与SB203580 LY294002(数字5(一个)- - - - - -5 (f))。然而,我们的研究结果表明,IL-37b没有调节Th1细胞因子,il - 10的表达。调查的影响Th1 / Th2细胞因子/ Treg IL-37b表达式,我们使用rhIL-4, rhIL-13, rhIL-5 rhIL-12 rhIFN -γ,rhIL-10刺激PBMCs 24小时,发现Th2细胞因子(rhIL-4、rhIL-13 rhIL-5)减少IL-37b表达式(数字6(一)- - - - - -6 (c)),而Th1细胞因子(rhIL-12 rhIFN -对IL-37b表达式(数字)没有影响6 (e)和6 (f))。有趣的是,rhIL-10可以通过PBMCs上调IL-37b表达式(图6 (d))。

3.5。嗜酸性粒细胞IL-37b诱发ECP生产

与不同浓度的刺激后rhIL-37b (1 - 100 ng / mL),我们发现ECP水平差别明显对这些由嗜酸性粒细胞以时间和剂量依赖的方式(数字7(一)和7 (b))。

3.6。鼻内Mometasone糠酸盐治疗会使当地IL-37b表达式

四周后的鼻内mometasone糠酸盐(50g每粉扑鼻孔两个鼻孔,每天一次),我们发现显著的缓解症状的基于“增大化现实”技术的孩子(表3)。鼻灌洗IL-37b蛋白表达明显增强治疗后,其表达与总症状评分(数据负相关8(一个)和8 (b))。

4所示。讨论

基于“增大化现实”技术是一种常见的儿童疾病,特点是持续的鼻粘膜的炎症,通常显示Th2倾斜嗜酸性和高水平的IL-5 IgE炎症。Th2细胞因子发挥重要作用在基于“增大化现实”技术的发展和恶化。目前,鼻内类固醇是基于“增大化现实”技术的一线治疗方案及其机制包括Th1 / Th2平衡调节和抑制炎性细胞因子。

目前,大多数研究发病机制的基于“增大化现实”技术的集中在炎性细胞因子与其抗炎细胞因子的生产。IL-37 (IL-1F7)是一个新近报道分子与抗炎效应(il - 1的家庭18]。IL-37表达式被发现在许多肿瘤细胞基质等结肠癌癌、导管和乳房癌和血液单核细胞,分化完全角化细胞在皮肤颗粒层,PBMC,树突状细胞(19,20.]。IL-37b具有强大的抗炎特性和许多研究阐明其精确的角色在自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA),炎症性肠病(IBD),格林-巴利综合征,和过敏性皮炎(美联社)(21,22]。然而,它的作用在呼吸道疾病没有报道。

作为IL-37b被认为是最重要的同种型IL-37,因此我们的研究着重于我们提供了第一个证据表明IL-37b表达式是负相关在AR增强Th2炎症。在正常鼻粘膜,我们发现IL-37b被上皮细胞表达,间质细胞和腺体细胞。然而,IL-37b表达AR是相对较弱。有趣的是,我们发现IL-37b表达并不影响哮喘患儿的年龄和状态。与我们的结果一致,Fujita et al。22]IL-37b表达AP及其检测结果表明,大多数AP患者表现为高IL-37水平,但一些严重的广告显示IL-37水平低。这些结果表明,IL-37扮演不同的角色在不同的疾病状态和IL-37亚型甚至可能代表不同的功能。此外,当MAPK和PI3K通路抑制剂添加到PBMCs,由IL-37b Th2细胞因子的抑制作用明显减少,表明MAPK和PI3K通路参与IL-37b Th2炎症介导的规定,这与先前的报道是一致的(23]。

在Imaeda的研究23),IL-37b发现抑制CXCL10, Th1-chemokine,暗示其潜在作用抑制Th1炎症。相反,我们的数据表明,Th1细胞因子和IL-37b没有联系。我们还发现IL-37b并不影响il - 10的表达。这些结果表明,IL-37 Th2细胞因子调节不是il - 10的依赖,这是不符合麦克纳米的研究(11)报道,IL-37亚型不仅抑制Th2细胞因子,而且诱导il - 10。然而,我们的数据显示,rhIL-10可以上调IL-37b表达式PBMCs及其机制需要进一步探索。

嗜酸性粒细胞通过调解上皮细胞损伤的效应分子的释放,如主要碱性蛋白和项目。嗜酸性粒细胞扮演关键角色的维护和发展,基于“增大化现实”技术通过促进气道功能障碍和组织重构。我们的结果显示血清ECP和IgE水平和嗜酸性粒细胞计数和血清IL-37b负相关。因此,我们纯化嗜酸性粒细胞,发现IL-37b可以抑制ECP表达式由嗜酸性粒细胞直接以时间和剂量依赖的方式。我们的研究结果提供了新的嗜酸性粒细胞监管机构基于“增大化现实”技术的发展。

最后,我们分析了IL-37b表达式后鼻腔类固醇治疗。我们发现治疗减少鼻IL-37b表达式和疾病症状,表明鼻内类固醇可以改善症状通过监管IL-37b表达式。然而,与我们的研究结果不一致,歌曲的研究(24表明,糖皮质激素可以下调IL-37b和其他细胞因子的表达在系统性红斑狼疮患者。这些差异表达IL-37b上述疾病建议IL-37b扮演不同角色在不同的背景。

5。结论

总之,我们展示了表达、分布、和监管的IL-37b AR儿童和演示的重要性减少IL-37b水平调节Th1 / Th2 Treg平衡和嗜酸性粒细胞的活化。我们的发现可能有利于设计一个潜在的战略的最佳预防和管理基于“增大化现实”技术的孩子。

利益冲突

作者宣称他们没有财务披露或利益冲突。

作者的贡献

Wenlong刘邓和李的贡献同样这项工作。

承认

这项研究由国家临床重点专科项目支持的基础。