文摘

肿瘤坏死因子受体水平的各种细胞的免疫系统及其与基因多态性研究。确定膜结合肿瘤坏死因子的水平α受体外周血单核细胞(PBMCs)是由流式细胞术使用BD QuantiBRITE校准粒子。可溶性肿瘤坏死因子α受体(sTNFRs)水平测定基因分型结果ELISA和由PCR-RFLP决定。TT纯合个体在SNPG / T TNFRI (rs4149570)相比,表现出低水平的sTNFRI GG基因型携带者。纯合子的载体在SNP CC基因型G / C TNFRI (rs4149569)表达密度较低的膜结合TNFRI完整CD14⁺单核细胞相比与GC基因型个体。CD3频率的差异⁺和CD19⁺细胞表达TNFRII SNPA / TTNFRII(rs652625)健康人也决定。在SNP基因型CC−3609 c / TTNFRII(rs590368) CD14的比例较低有关⁺细胞表达TNFRII相比与CT基因型个体。类风湿性关节炎患者基因型的频率没有显著变化。降低频率组合TNFRI被确认GT + TNFRIICC。基因多态性的代表之一,细胞特定类型机制影响膜结合肿瘤坏死因子的表达水平α受体和肿瘤坏死因子α介导的信号。

1。介绍

肿瘤坏死因子(TNFα)是一种多效性的细胞因子,起着重要的作用在调节各种免疫功能包括炎症(1,2),细胞凋亡和坏死的规定3),诱导细胞毒性(4]。肿瘤坏死因子α能引起各种不同的免疫反应信号通过两种类型的膜结合受体,I型(CD120a TNFRSF1A)和II型(CD120b TNFRSF1B)受体,55和75 kDa的各自的分子量(5,6]。I型肿瘤坏死因子α受体(TNFRI)更广泛,并表示在所有细胞类型与II型TNFα受体(TNFRII)主要表达在免疫系统的细胞(6,7]。

TNFRI通过可溶性和膜结合(mTNF激活α肿瘤坏死因子-α(TNF的)形式α),而TNFRII主要由mTNF激活α(8]。大多数生物肿瘤坏死因子的影响α(细胞毒性和扩散等)实现通过TNFRI激活(6]。胞内TNFRI域,而TNFRII的胞内域,包含一个死域(DD)与TNF-mediated细胞毒性(9]。TNFRII是感应扩散的主要功能除了通过DD-independent凋亡诱导机制(10]。也存在两种可溶性肿瘤坏死因子α受体形式(11由蛋白质水解生成的膜结合受体(12,13)或可变剪接(14在TNF],发挥重要的作用α介导的生物活性(15]。可溶性肿瘤坏死因子α受体(sTNFR)不允许绑定膜结合受体从而抑制肿瘤坏死因子α生物活性(16]。

的TNFRI基因位于染色体12 p13 10个外显子组成(17,18),包含一个管家与多个转录启动子启动网站,塔塔高GC含量,缺少共识,CAAT框主题(19]。的TNFRII基因位于染色体1 p36还包含10个外显子(17,20.),一个TNFRII子也在GC含量高,但包含几个共识TATA盒图案(21]。

细胞因子产生何种影响的性质发展免疫反应都依赖于细胞的百分比表达膜结合受体和受体表达水平上的细胞(22]。细胞因子受体表达水平的差异可以影响受体基因多态性。单核苷酸多态性(SNPs)发生在基因上游启动子区域可能影响转录的过程(23- - - - - -25]。snp在mRNA稳定性上具有重要的影响和转化效率,可能会影响对许多常见疾病(25- - - - - -28]。

本研究的目的是建立在肿瘤坏死因子多态性之间的关联α基因和膜结合受体I型和II型TNFα受体表达水平在不同单核细胞数量和水平来确定sTNFRs在健康人的血清。

2。材料和方法

2.1。研究人群

全血样品从血液中获得采购站1号“新西伯利亚血液中心”和抽样进行了从人口(健康个体)之间的年龄19岁,55年从新西伯利亚市(西伯利亚西南部)。主要的排除标准在俄罗斯联邦标准的献血者。此外,类风湿性关节炎(RA)患者466例,包括在这项研究中,其中86.5%是女性,13.5%是男性,年龄在18岁到70岁。诊断是根据ACR验证标准。研究是依照执行世界医学协会的道德规范(赫尔辛基宣言》),并经当地伦理委员会批准的FSBI“临床免疫学研究所”。所有个人提供知情同意前进行了研究。

2.2。测量血清肿瘤坏死因子α和可溶性类型I和II TNF水平α受体

肿瘤坏死因子α血清水平和可溶性第一种和第二种肿瘤坏死因子的水平α受体测定。可溶性受体含量测定采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒。具体地说,人类sTNF RI酶联免疫试剂盒和人类sTNF RII酶联免疫试剂盒(美国GA RayBiotech, Norcross)使用根据制造商的指示。肿瘤坏死因子α确定使用水平α-TNF-EIA-BEST (JSC Vector-Best、新西伯利亚、俄罗斯)。

2.3。隔离和外周血单核细胞(PBMCs)文化

PBMCs健康人的血液中分离的使用标准Ficoll-Urografin密度梯度方法(克/厘米³)[29日]。PBMCs培养在2×10的浓度⁶/毫升乘96孔板(TPP, Trasadingen,瑞士)缺失或出现脂多糖(LPS)大肠杆菌血清型055:B5 (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)200 ng / mL的最终浓度(30.]。在rpmi - 1640细胞培养介质含10%胎牛血清,2毫米谷酰胺,10毫米消息灵通的缓冲区,0.5毫米2-mercaptoethanol, 80年μg / mL庆大霉素和100μg / mL青霉素24 h公司5%₂和37°C。

2.4。肿瘤坏死因子测定膜结合α第一种和第二种受体水平

细胞的数量表达膜结合第一种和第二种TNF受体是由流式细胞术如前所述[31日]。藻红蛋白的抗体标记(PE):使用反TNF RI(研发系统,明尼阿波利斯,美国猫FAB225P数量,克隆16803.1,鼠标IgG1)和反TNF RII(研发系统,猫FAB226P数量,22235年克隆,鼠标IgG2A)。以下从eBioscience抗体(美国圣地亚哥,CA)被用于immunophenotyping PBMC的亚种:allophycocyanin (APC)标记anti-CD3(猫17 - 0037,克隆OKT3,鼠标),异硫氰酸荧光素(FITC)标记anti-CD14(猫11号- 0149年克隆61 d3,老鼠免疫球蛋白₁),phycoerythrin-cyanine 7 (PE-Cy7) anti-CD19(猫25号- 0199年克隆HIB19,老鼠免疫球蛋白₁)。

获取校准曲线和细胞表达相应标记的荧光强度转换为绝对受体数量,BD QuantiBRITE校准粒子(BD生物科学,圣何塞、钙、美国)。流仪分析使用BD FACSAria流式细胞分析仪(BD生物科学)。我们封闭的人群分析指标的基础上向前(FSC-A)和侧(SSC-A)散射位于淋巴细胞和单核细胞的区域。随后,我们选择亚种群(CD3⁺T淋巴细胞,CD19⁺B淋巴细胞CD14⁺单核细胞)的基础上标记的亚种群的存在。进一步,我们建立了一个间隔门控制直方图,这是获得与样品没有反TNFRI孵化和TNFRII抗体,并确定积极事件的百分比和平均荧光的细胞表达膜结合受体对PE /每一个亚种群统计直方图。

2.5。基因分型方法

基因组DNA分离从PBMCs收获健康个体使用phenol-chloroform提取方法。snp选择进行分析与受体表达水平的选择从NCBI dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)。SNP的启动子区域选择标准位置在第一种和第二种TNF受体基因和高较小的等位基因频率(加)并与病理学协会的存在。此外,snp检测转录因子结合位点的存在使用软件AliBaba2.1 (http://www.gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html)。

的基因多态性在TNFRI−609 g / T (rs4149570),TNFRI−1207 c / G (rs4149569),TNFRII−1709 a / T (rs652625),TNFRII−3609 c / T (rs590368)进行了聚合酶链反应(PCR)结合RFLP(限制片段长度多态性)分析。引物序列特定的snpTNFRI−609 g / T,TNFRI−1207 c / G,TNFRII−1709 a / T是前面描述的32,33]。特定的引物序列TNFRII−3609 c / T设计与NCBI的援助/ Primer-BLAST计划(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)。特定的引物TNFRI和TNFRII基因序列被BIOSAN合成(俄罗斯新西伯利亚)(表1)。

PCR进行了使用一个ptc - 200 DNA thermocycler (MJ研究Inc .)、水城,妈,美国)。20μL反应体积包含1 - 2单位TaqDNA聚合酶(SibEnzyme、新西伯利亚、俄罗斯),0.5μ每个引物的米,每个desoxynucleoside-triphosphate 0.25毫米和50 - 200 ng的基因组DNA。添加到DNA聚合酶反应缓冲区包含60毫米Tris-HCl (pH值8.5,25°C), 1.5毫米MgCl₂氯化钾,25毫米,10毫米2-mercaptoethanol,特里同x - 100年的0.1%。PCR条件如下:最初在95°C变性3分钟30周期紧随其后TNFRI−609 g / T和TNFRII−1709 a / T或35周期TNFRI−1207 c / G和TNFRII−3609 C / T 94°C的20年代;15秒61°C (TNFRI−609 g / T)或15秒58°C (TNFRI−1207 C / G)或64°C 15秒(TNFRII−1709 a / T)或63°C 15年代(TNFRII−3609 c / T);20年代72°C,最终在72°C扩展2分钟。

放大产品暴露在各自的限制性内切酶(5 - 10活动单位)在一个体积2.5 - 5μL (SibEnzyme)。限制放大产品的消化是一夜之间在65°C的温度TNFRI−609 g / T, 55°CTNFRI−1207 C / G, 37°CTNFRII−1709 a / T和TNFRII−3609 c / T。

限制产品被使用QIAxcel毛细管电泳分析系统(试剂盒、希尔登,德国)或2%琼脂糖凝胶电泳在140 - 150 V的电压为20 - 25分钟。QX DNA标记(试剂盒,瓦伦西亚,CA)和pUC19质粒消化Msp我(SibEnzyme)作为分子量标记。琼脂糖凝胶电泳可视化使用视频密度计ImageMaster VDS公司(法玛西亚生物技术)。

2.6。统计分析

数据表示为中间值和四分位范围。表型频率分布与哈迪温伯格平衡建立了使用测试。相关性分析采用斯皮尔曼等级相关的测试。相应的基因型与肿瘤坏死因子的关系α受体表达水平测试使用Kruskall-Wallis方差分析测试,Mann-Whitney测试和测试中值。一个≤0.05被认为是具有统计学意义的价值。

3所示。结果

3.1。血清肿瘤坏死因子α和可溶性类型I和II TNFα受体水平

的肿瘤坏死因子α和可溶性肿瘤坏死因子α第一种和第二种受体水平测定150例健康个体的血清。这些实验表明,血清可溶性肿瘤坏死因子的水平α受体II型(2449.9 [1915.1 - -3768.9]pg / mL)明显高于可溶性肿瘤坏死因子α受体I型(707.9 [497.8 - -939.9]pg / mL) ()。这分析还表明,血清水平的sTNFRI健康个体与血清肿瘤坏死因子呈正相关α水平(0.669 [0 - 1.9]pg / mL) (,)。肿瘤坏死因子的水平α负相关的绝对数量TNFRI CD3表示⁺T细胞和CD19⁺B细胞分别地,)。

3.2。测量膜结合类型I和II TNFα受体

我们观察到膜结合肿瘤坏死因子的表达水平的差异α某些亚种群的单核细胞受体,这可能暗示的不同效应的不同免疫活性的细胞对肿瘤坏死因子的反应α。这些潜在的不同的反应影响的百分比TNFR阳性细胞在肿瘤坏死因子的绝对数量α受体(表2)。受体表达水平的差异可能是由于不同单核细胞群表达差异或由于肿瘤坏死因子α受体基因多态性。

3.3。研究人口的基因型频率

肿瘤坏死因子α受体等位基因和基因型频率在1207 T和−−609 g / g / CTNFRI职位和/ T 1709−−3609 c / TTNFRII职位健康新西伯利亚的居民(表中进行了研究3)。所有四个多态性的基因型和等位基因频率符合HWE标准()。

3.4。协会肿瘤坏死因子α受体基因多态性与膜结合受体的表达水平和血清TNF水平α和可溶性受体

我们没有观察到单核苷酸多态性之间的联系存在于TNF的赞助者地区α受体基因和血清TNF水平α和sTNFRII。在分析关于血清可溶性TNF浓度数据α受体和各自的基因型,我们观察到,T等位基因的纯合子个体位置−609 g / TTNFRI(rs4149570)可溶性TNF水平较低的α受体I型相比,个人与G等位基因(Mann-Whitney呈现测试、TT和GG;Kruskall-Wallis测试中,)(图1)。基因型频率在位置的比较−609 g / T也显著差异CD19的百分比⁺细胞表达膜结合TNFRI(中值测试,,)。

膜结合肿瘤坏死因子的表达水平之间的关系α受体I型和基因型建立了SNP−1207 g / CTNFRI(rs4149569)。纯合子CC基因型有统计学更频繁的组中CD14的密度较低⁺单核细胞表面表达TNFRI (Mann-Whitney测试、CC和GC;Kruskall-Wallis测试中,;中值测试,,)(图2)。我们还表明,基因型频率的SNP−1207 g / C与不同的刺激有关索引值(值测试,,)。刺激指数计算作为一个简单的比例绝对TNFRI CD14受体的数量⁺细胞在文化和LPS刺激。

在分析TNFRII基因型频率在SNP−1709 a / T (rs652625)我们观察到CD3的百分比的统计上的显著差异⁺和CD19⁺在健康个体细胞表达TNFRII(中值测试,χ²= 5.049,和,、职责)。

与CC基因型个体位置−3609 c / T (rs590368)TNFRII较低比例的完整CD14吗⁺细胞表达TNFRII相比,患者CT基因型(Mann-Whitney测试、CC和CT;Kruskall-Wallis测试中,)(图3)。

3.5。协会肿瘤坏死因子α受体基因多态性与类风湿性关节炎

等位基因和基因型的频率TNFRI启动子在609年和1207−−和TNFRII职位3609年和1709−−没有在统计上有显著差异的RA患者和健康人。然而,分析发现基因型的组合tnfri - 609 gt + tnfrii - 3609 cc。这种组合的频率的患者为10%,显著低于22%人口控制的集团(,)。这种组合的优势比基因型或者= 0,42 (CI95 = 0.25 - -0.71),和风湿性关节炎的相对风险运营商基因型低10%。这些基因型组合对比分析如表所示4。

我们已经检查了协会联合基因型肿瘤坏死因子受体的表达水平在健康献血者。个人的组合GT + CC的特点是增加了膜结合TNFRI CD19上完整的细胞亚群⁺B细胞和CD3⁺T淋巴细胞(图4)和CD3的百分比减少⁺T淋巴细胞CD14⁺单核细胞表达TNFRII(图5)。血清肿瘤坏死因子水平α组合的基因型有下降的趋势系列GG + CT-GT + CT-GT + CC。数据没有显示。

4所示。讨论

分析信号与肿瘤坏死因子相关机制α是必要的评估不仅本身及其可溶性细胞因子受体膜结合受体,赋予不同的生物效应。已经证明,健康个体表现的定量差异不仅表达这些受体细胞的百分比也表达受体的数量。可以推断,肿瘤坏死因子不同的细胞亚群会有不同的反应α根据受体密度表达式。可能细胞表达受体密度或者更大的细胞群表达更大比例的这些受体将增强TNF赋予的影响α(这些细胞)。出于这个原因,细胞肿瘤坏死因子表达的百分比α受体并不总是与受体的绝对数量。例如,比较TNFRI表达式的CD19 T和B淋巴细胞和单核细胞识别⁺B淋巴细胞表达TNFRI而是总人口的最低数量表达受体的密度最大。相比之下,CD3的比例更大⁺T淋巴细胞表达TNFRII最低密度的任何细胞类型检查。

先前的工作已经证明了细胞培养的有限合伙人24 h导致显著增强TNRII表达相比TNFRI CD14表达⁺单核细胞(30.]。报告中提出的数据支持这些观察;即更高比例的单核细胞培养的有限合伙人表示TNFRII(在更高的密度)相比TNFRI表达式(每个细胞和密度)证明了什么不同的肿瘤坏死因子的参与α受体对有限合伙人的行动。这些数据证实,有限合伙人显著影响TNFRII CD14表达⁺单核细胞从健康人。此外,比较新鲜孤立CD14(如果)⁺对Mock-stimulated单核细胞CD14⁺单核细胞培养24小时显示差异的阳性细胞百分比和膜结合肿瘤坏死因子的表达水平α受体可能与微环境的变化有关。

肿瘤坏死因子的相关性分析α可溶性受体导致冲突的观察。例如,脊柱et al。26)建立了肿瘤坏死因子之间的相关性α和sTNFRI水平但不是sTNFRII和四郎et al。34)建立了肿瘤坏死因子之间的相关性α和sTNFRII但没有建立肿瘤坏死因子之间的相关性α和sTNFRI水平。报告中提出的数据表明,血清TNFα水平呈正相关,sTNFRI健康人的血清水平。我们还表明,血清sTNFRI(弱)负相关与膜结合的密度TNFRI表达在细胞表面,表明proteolytically派生的膜结合受体有一定的联系。肿瘤坏死因子α水平也与膜结合的水平负相关TNFRI细胞上,支持先前的报道表明TNFα减少的信使rna编码TNFRI [35]。

水平的差异也可以影响肿瘤坏死因子受体表达α受体基因多态性。相当数量的单核苷酸多态性位于启动子区域TNF-TNFR总科一族可以影响基因表达的水平显著影响监管(36,37]。存在的某些等位基因启动子区域内的细胞因子受体基因可以影响基因转录率和mRNA稳定导致增加或减少合成蛋白质的水平。单核苷酸多态性分析本研究过程中位于TNFαI和II受体基因类型启动子区域,因此可能影响TNFRs表达水平。

几项研究已经检查了协会的多态性TNFRI−609 g / T (rs4149570)轨迹与各种疾病。例如,T等位基因是系统性红斑狼疮的红斑显著相关(38在非小细胞肺癌(中),不良的生存状况39),T细胞非霍奇金淋巴瘤(40];然而,这种多态性是预防口腔癌(41),降低结肠癌的风险(42和侵袭性肺曲霉病43]。金等。44)发现的TNFRI−609 g / T多态性与原发性肝细胞癌密切相关,T等位基因压抑TNFRI表达式。目前的研究表明,T等位基因的纯合子个体SNP−609 g / T位于TNFRI基因启动子呈现较低的血清可溶性I型TNF水平α受体。它已经表明,可溶性受体抑制肿瘤坏死因子的生物效应α(15];因此,当可溶性受体出现在低浓度间的竞争都是少的膜结合受体。降低的趋势也被证明绝对数量的膜结合TNFRI完整CD19⁺B细胞与TT基因型个体(Mann-Whitney测试、TT和GT)(图6)。考虑到可溶性肿瘤坏死因子αI型受体形成从膜结合蛋白水解乳沟TNF的副产品α受体(12,13),它可以得出相关的少量可溶性TNFRI TT基因型直接与膜TNFRI水平的表达水平下降有关。降低TNF的表达α受体似乎与G等位基因编码干扰素共识sequence-binding蛋白的结合位点(ICSBP,也称为IRF8或干扰素调节因子8),参与TNFRI-mediated激活的转录因子NF -B信号通路(43]。

Miyagawa et al。38)表明,SNPTNFRI−1207 g / C (rs4149569), C等位基因频率在系统性红斑狼疮红斑的患者明显低于对照组的频率。目前的研究表明,CC基因型携带者的位置−1207 g / CTNFRI基因提供CD14 TNFRI密度降低⁺单核细胞。它已被证实使用在线AliBaba2.1 (http://www.gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html)项目这个SNP (C等位基因的上下文中)是与缺乏相关的转录因子结合位点,G等位基因与转录因子结合位点C / EBPalpha(也称为CCAAT / enhancer-binding蛋白α),AP-2alpha(也称为TFAP2A)和Sp1。很可能TNFRI在细胞的差异表达的个体具有不同基因型与其中一个转录因子有关。

许多研究已经建立了一个SNP之间的联系TNFRII−1709 a / T (rs652625)病理45,46]。Steenholdt et al。47确定一个等位基因的SNP−1709 A / TTNFRII基因会增加严重的输液反应的风险英夫利昔单抗在克罗恩病的病人。我们检查了等位变异的频率TNFRI和TNFRII类风湿性关节炎患者的基因,表明RA患者(控制)相比,明显不太可能出现TNFRI−609 gt +TNFRII−3609 cc基因型的组合。疾病的个体发展的倾向可能由TNF的表达调节的个体特征α及其受体细胞的免疫系统。目前的研究发现统计上显著的频率差异CD3的百分比⁺和CD19⁺细胞表达TNFRII在SNP个人携带AA基因型TNFRII−1709 a / T (rs652625)。个人C等位基因的纯合子的SNP−3609 C / T (rs590368)TNFRII较低比例的CD14基因⁺细胞表达TNFRII。使用AliBaba2.1我们演示了不同定义的结合位点−1709 a / TTNFRII等位基因。具体来说,转录因子没有绑定到由T等位基因编码序列和序列编码的一个等位基因导致钢管绑定(也称为转录因子NF-I)。肿瘤坏死因子的生物效应α结果与两种类型的膜结合受体的相互作用:TNFRI TNFRII。众所周知,同时表达TNFRI和TNFRII结果TRAF2的退化导致增加TNFRI-mediated细胞毒性(10,48]。这些数据表明,信号通过TNFRI TNFRII决定细胞生存。很可能的细胞群表达高水平的TNFRII将与较高的细胞凋亡有关。

因此,我们建立了snp T和−−609 g / 1207 g / CTNFRI基因启动子和/ T 1709−−3609 c / TTNFRII基因启动子与TNF的表达水平有关α指定这些受体多态性功能。协会的snp−1207 g / C / T 1709−,−3609 C / TTNFR基因启动子包围的TNF的表达水平α类型I和II受体缺乏与可溶性肿瘤坏死因子的水平α受体建立什么证明了存在不同的可溶性和膜结合受体表达的调控机制。协会的snp T和−−1207 c / 3609 c / T和CD14表达TNFRs⁺人口与表情CD3的缺失⁺和CD19⁺亚种群证明了这些snp的功能性角色分离单核细胞的亚种群。可能的机制来确定表达受体的特异性转录调控一系列因素(增强剂和阻遏蛋白)(49,50]。

有趣的结果的组合基因型分析。结合TNFRI−609 gt (rs4149569)和TNFRII−3609 cc很少在RA患者和与检测水平的提高TNFRI和TNFRII水平的降低免疫细胞。也许不同的肿瘤坏死因子受体类型I和II在细胞确定类风湿性关节炎患者的遗传变异的关系。然而,对于特定的输出,一个更广泛的研究是必要的。

5。结论

本研究确定了细胞的百分比差异表达肿瘤坏死因子α受体和PBMCs表达的膜结合受体的绝对数量。还建立了细胞的百分比表达TNFRs并不总是与受体的绝对数量。此外,我们认为,TNF的表达水平的差异α受体类型I和II可以联系在一起TNFRI和TNFRII基因多态性。关联的单核苷酸多态性位于肿瘤坏死因子的启动子区域α建立了I型和II型受体基因的表达水平的膜结合受体存在于亚种群的单核细胞和血清可溶性I型TNF水平α受体。这些观察表明TNFα受体基因的等位基因是影响差异的因素之一在膜结合受体的表达,这可能解释的差异由肿瘤坏死因子的影响α在不同的细胞群/亚种群。

缩写

CD:	集群的区别
ELISA:	酶联免疫吸附试验
免疫球蛋白:	免疫球蛋白G
有限合伙人:	脂多糖
小额信贷机构:	平均荧光强度
PBMC:	外周血单核细胞
聚合酶链反应:	聚合酶链反应
体育:	藻红蛋白
RFLP:	限制片段长度多态性
SNP:	单核苷酸多态性
TAE:	Tris-acetate-EDTA
肿瘤坏死因子α:	肿瘤坏死因子α
TNFR:	肿瘤坏死因子受体
sTNFR:	可溶性肿瘤坏死因子受体。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

本研究支持的联邦目标计划”优先领域的科技研究和发展复杂的俄罗斯2007 - 2013年”(合同编号。02.740.11.0707)。资金来源没有参与研究设计、数据收集、分析和解释数据,写报告的,或决定提交投稿。