文摘

YCP,作为一种天然海洋丝状真菌菌丝体的多糖Phoma herbarumYS4108,潜力巨大的抗肿瘤通过增强宿主的免疫反应,但对分子机制。在目前的研究中,我们主要关注的效果和机制YCP特定免疫介导的树突状细胞(dc)和T细胞。T细胞/直流activation-related因素包括干扰素(IFN)γinterleukin-12 (il - 12)和il - 4和ELISA检测。受体小鼠fluorescence-activated细胞分类是用来分析YCP-binding受体T细胞和DCs。rt - pcr分析是用来衡量MAGE-A3肿瘤特异性杀的效果。在我们的研究中,我们演示了YCP可以提供第二信号为T细胞活化,增殖和干扰素-γ生产通过绑定toll样受体- 2 (TLR)和地。YCP能有效地促进il - 12的分泌和表达的标记(CD80、CD86和MHC II)通过地在DCs上。加强抗原免疫对小鼠黑素瘤细胞通过T细胞的激活和增强YCP DCs的能力。数据支持,YCP可以表现出特定的免疫调节能力由T细胞和DCs。

1。介绍

T细胞结合严格的目标特异性和高效肿瘤治疗(1]。抗原递呈细胞(apc)激活T细胞通过两个信号机制:一是由T细胞受体(TCR)绑定到抗原肽的主要组织相容性复合体(MHC)分子和第二信号包括costimulatory分子相互作用costimulatory T细胞表面的受体,导致T细胞细胞因子的生产及其扩散(2]。树突状细胞(dc)被认为是最强大的装甲运兵车的独特能力,提供抗原T细胞和表达几个costimulatory分子(3]。

第二个信号所需的T细胞激活支持细胞生存,记忆发展,表面扩散,细胞因子的生产发现DCs报道如B7家族成员B7-1 (CD80)和B7-2 (CD86) [4,5]。绑定B7-1 / B7-2 CD28 costimulatory最强的信号由DCs提供全面激活T细胞,促进其增殖和分泌[- 26,7]。CD80和CD86已报告在诱发T细胞激活特定的功能和诱导细胞因子表达的微分模式支持1型或2型辅助(Th1、Th2)响应在绑定CD28 (2,8]。CD28-mediated刺激的主要结果在分子水平上是一个增加产量等细胞因子- 2对T细胞增殖,这是重要antiapoptosis [6]。

toll样受体(通常),作为一个家庭的模式识别受体(PRRs),高度表达了对直流和T细胞(9]。激活TLR导致DC成熟和促炎细胞因子的分泌,从而诱导T细胞抗肿瘤免疫反应(10]。许多多糖toll样受体激动剂作为佐剂和刺激DCs主要抗原T细胞和B细胞反应已报告(11- - - - - -13]。T细胞,预处理TLR4配体LPS增强生存和增加他们的抑制活性,而TLR4缺陷小鼠没有回应(14]。TLR和细胞MAPK信号通路利用成员的家庭。TLR激活这些途径影响随后TCR-mediated信号事件(15,16]。toll样受体激动剂可以诱导活化的CD4细胞⁺T淋巴细胞、CD8⁺T淋巴细胞或细胞毒性T淋巴细胞(ctl) [17- - - - - -19]。这些发现提示,toll样受体激动剂可能会导致直流并提供所需信号的激活T细胞活化。

YCP (YCP盐城多糖的缩写)是纯化的菌丝体Phoma herbarumYS4108繁衍沉积物在盐城黄海地区,中国。的支柱α1,4-D-glucan的比例较低α1,6-linked glucopyranosyl和葡萄糖醛酸残留nonreducing终端,我们曾发现,它拥有一个伟大的抗肿瘤的潜力通过增强宿主免疫反应的20.,21]。然而,仍然需要进一步的研究来阐明YCP行动的分子机制。在这项研究中,我们主要关注的效果和机制YCP具体由DCs和T细胞免疫介导。

2。材料和方法

2.1。材料

YCP特征是孤立的,在我们实验室之前21]。所有主要抗体购自eBioscience(美国圣地亚哥,CA)和使用浓度在1和5之间μ克/毫升。1-Cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate (CDAP)从西格玛化工有限公司购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。重组小鼠il - 4和重组小鼠gm - csf从PeproTech购买(美国新泽西州落基山)。ELISA试剂盒测量小鼠干扰素-γ从研发系统、il - 4和il - 12是购买(明尼阿波利斯,美国)。Anti-mouse TLR2 (CD282)和Anti-mouse TLR4买来eBioscience(美国圣地亚哥,CA)。Pam3CSK4购买从圣克鲁斯(圣克鲁斯、钙、美国)。(3)- 4 5-Dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT), ophenylenediamine, fluoresceinamine(佛罗里达州)来自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。总RNA RNA简单装备购买从Tiangen生物技术(中国,北京)。合成第一链cDNA工具包是购自TransGen生物技术(中国,北京)。SYBR绿色购买应用生物系统公司(美国CA福斯特城)。试剂用于细胞培养买来Gibco(美国纽约大岛)。本研究中使用的所有其他试剂提供最高的质量。

2.2。实验动物

清洁级雄性C57BL / 6小鼠(6 - 8周大)在18到22岁的克重从扬州大学的比较医学中心和购买环境适应1星期前使用。B6.129 -/ JNju (TLR2 KO)和10 scnjnju C57BL / 6 - 8周(TLR4 KO)老鼠旧的模式动物研究中心提供的南京大学(南京、江苏、中国)。在整个研究中,啮齿动物实验室的动物喂养食物丸和自来水都有5个在每个塑料笼在通风良好的房间,在维护°C的湿度%和12/12 h光/暗周期。所有程序进行了严格按照中国法律的使用和护理实验室动物和被大学动物实验委员会批准。

2.3。隔离的T细胞

小鼠脾T细胞准备根据先前描述的方法(22)与轻微的修改。短暂,小鼠脾脏收获C57BL / 6小鼠近交和切碎的rpmi - 1640年中在室温下。使用NH由低渗的红细胞被溶解₄Cl和贴壁细胞是由镀在37°C 6 h。悬浮细胞群被收集并作为淋巴细胞数量和应用于尼龙纤维列(Wako,大阪,日本)。细胞悬液后彻底陷入了纤维床上,列在37°C 1 h孵化。T细胞是温柔地筛选了在不增加任何额外的压力和B细胞被刷新的列使用柱塞。T细胞的纯度为特征通过fluorescence-activated CD3细胞排序(流式细胞仪)分析表达式;CD3的比率⁺T细胞是大约90%。

2.4。绑定和竞争分析

YCP与佛罗里达州通过共轭CDAP-activation方法如前所述轻微修改(23]。,5毫克CDAP添加到水溶液中含有30毫克的YCP温和搅拌和pH值保持在9.0,2.5分钟。那时的CDAP-activated YCP混合2毫克的佛罗里达州(pH值调整到8.0)和孵化在室温下过夜。Fluoresceinamine-labeled YCP (fl-YCP)是分开的佛罗里达州过剩自由Amicon Ultra-15离心过滤装置(美国微孔,Billerica的)。佛罗里达州和YCP大量fl-YCP,分别量化通过测量吸光度在440 nm和phenol-sulfuric酸测定20.]。进行竞争分析,T细胞与媒介,孵化Pam3CSK4 (20 nM),有限合伙人(20 nM), Pam3CSK4 (20 nM) +有限合伙人(20 nM),和anti-mouse CD28 (5μg / mL) 1 h,其次是孵化与fl-YCP (100 - 1600 nM) 1 h。与PBS洗涤三次后,细胞被检查在FACSCalibur流式细胞分析仪(美国BD生物科学,圣何塞,CA)波长488纳米的激光激发和530海里排放过滤器。从至少100 000个细胞获得的数据和分析使用FlowJo程序(美国FreeStar、亚什兰或)。

2.5。扩散分析

T细胞培养在96孔酶标2×10的密度⁶细胞/毫升rpmi - 1640中含有10%的边后卫,补充了60 mg / L青霉素和100 mg / L链霉素。细胞被使用介质或anti-mouse CD3 (5μ在4°C g / mL)一夜之间文化和刺激YCP (100 - 800 nM) 48 h有限公司₂孵化器或者anti-TLR2 (20 nM), anti-TLR4 (20 nM), anti-TLR2 (20 nM) + anti-TLR4 (20 nM)和介质在37°C 2 h之前添加YCP(400海里),紧随其后的是麻省理工(5毫克/毫升)为另一个4 h。甲瓒晶体由麻省理工的活细胞完全溶解在DMSO溶液10分钟。吸光度是确定在570 nm multiskan光谱(热费希尔科学,万塔,芬兰)和诱导细胞增殖的表达为扩散指数,计算除以一个570年刺激细胞一个570控制的细胞(22]。

2.6。生成和骨骨髓来源dc的成熟

骨髓是源自6-8-week-old雄性C57BL / 6小鼠。骨骨髓来源树突状细胞(BMDCs)是由培养7天的单核细胞RPMI 1640中,10%的边后卫,青霉素和链霉素1%,2毫米谷酰胺,100 ng / mL重组小鼠granulocyte-macrophage集落刺激因子(gm - csf) (PeproTech)和50 ng / mL重组小鼠il - 4 (PeproTech) [24]。每2天,50%的文化媒体与新媒体交换。DCs被PBS洗,沾anti-mouse CD11c FITC单克隆抗体(eBioscience、圣地亚哥、钙、美国)。

建立稳定的小鼠黑色素瘤细胞系,B16F10、使用(请郑教授亨捐赠的)。在rpmi - 1640细胞培养中含有10%的边后卫,补充了60 mg / L青霉素和100 mg / L链霉素。B16F10细胞resuspended 1×10的密度⁷细胞/毫升1.5毫升埃普多夫管与水浴30分钟40°C,然后排到−80°C冰箱20分钟,缓慢融化在37°C为20分钟。4冻融循环后,细胞在3000转离心20分钟。上层清液经过22μ米筛叫B16F10全吸收防腐抗原(B16Ag)。调整B16Ag 0.1毫克/毫升的浓度。DCs培养7天被B16Ag刺激48 h。DCs (mDCs或imDCs)被PBS洗,沾anti-mouse MHC II级体育和anti-mouse CD11c FITC单克隆抗体(eBioscience、圣地亚哥、钙、美国)。另一个实验中,DCs培养7天节中描述2。7被B16Ag刺激,YCP (100 - 800 nM) 48 h。DCs洗了PBS在不同时期(6 h, 12 h, 24小时和48 h)和彩色anti-mouse CD80 B7-1 FITC和anti-mouse CD86 (B7-2) PE单克隆抗体(eBioscience、圣地亚哥、钙、美国)。从最低20 000个细胞获得的数据和分析使用FlowJo程序。

2.7。ELISA

T细胞培养在96孔酶标2×10的密度⁶细胞/毫升使用介质或anti-mouse CD3 (5μ在4°C g / mL)一夜之间文化和刺激YCP (100 - 800 nM) 48 h有限公司₂孵化器或者anti-TLR2 (20 nM), anti-TLR4 (20 nM), anti-TLR2 (20 nM) + anti-TLR4 (20 nM)和介质在37°C 2 h之前添加YCP(400海里)。浮在表面的游离收集量化的干扰素-γ水平的商业ELISA包根据制造商的协议前面描述的(20.]。

B16F10 peptide-pulsed DCs培养在96孔酶标2×10的密度⁶细胞/毫升rpmi - 1640中含有10%的边后卫,补充了60 mg / L青霉素和100 mg / L链霉素。与YCP B16Ag-DCs (mdc)刺激(100 - 800 nM) 48 h有限公司₂孵化器或者anti-TLR2 (20 nM), anti-TLR4 (20 nM), anti-TLR2 (20 nM) + anti-TLR4 (20 nM)和介质在37°C 2 h之前添加YCP(400海里)。剥离了细胞收集上层清液il - 12水平的量化商业ELISA包根据制造商的协议前面描述的(20.]。

2.8。在体外激活的T细胞和抗原诱导反应mDCs

T细胞培养与mDCs 20的比例:1或没有mDCs 48 h效应细胞(2×10⁶细胞/毫升)。B16F10细胞的密度resuspended 2×10⁵细胞作为靶细胞/毫升。效应细胞和靶细胞被媒体或YCP cocultured和刺激(100 - 800 nM) 48 h。细胞收集实时rt - pcr数量。得到了上层清液和干扰素-的水平γ、il - 12、il - 4产品由ELISA测定(研发系统)根据制造商的协议中描述的部分2。7。细胞刺激通过介质和细胞刺激YCP(400海里)收集在不同时期(12 0 h, 6 h, h, 24 h, 48 h,和96 h)洗后PBS和沾anti-mouse CD3e PE-Cyanine5, anti-mouse CD4 FITC和anti-mouse CD8a PE单克隆抗体(eBioscience、圣地亚哥、钙、美国)。

2.9。实时定量rt - pcr

靶细胞的数量被MAGE-A3的信使rna定量测量。从细胞总RNA分离颗粒样品从Tiangen生物技术使用总RNA RNA简单工具(中国,北京)。RNA恢复(约2μg)是使用随机反向转录cDNA六聚物引物和合成第一链cDNA工具包TransGen生物技术(中国,北京)。B16F10细胞增殖是通过测量评估MAGE-A3使用ABI棱镜7500序列基因表达检测系统执行中存在已经详细描述(25]。简单地说,PCR是在10进行的μL使用20%的恢复cDNA作为模板,用2μM GAPDH(内部标准)引物(向前,5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′, 1.5μL;相反,5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′, 1.5μL)或1μM MAGE-A3特定引物(向前,5′-AGCTCTGCATCGTTTTGGGTT-3′, 1.5μL;相反,5′-GTTCCATTATCCGCTACATCTGAA-3′, 1.5μL)和5μL 2×SYBR绿色从应用生物系统公司(美国CA福斯特城)。循环参数20年代95°C,紧随其后的是40周期95°C 20年代和30年代60°C。融化曲线参数95°C 15年代,60年代60°C, 95°C 15秒。

2.10。在体外细胞模型研究YCP-Mediated特定免疫对小鼠黑素瘤细胞

四个细胞模型准备学习期间YCP提供的信号在体外特定的免疫反应。成熟dc (WT和TLR4 KO)和T细胞(WT和TLR4 KO) cocultured根据的比率1:10在DCs resuspended 2×10的密度⁵细胞/毫升48 h。混合细胞cocultured后被用作效应细胞(2.2×10⁶细胞/毫升),B16F10细胞resuspended密度为2.2×10⁵细胞/毫升作为靶细胞。效应细胞和靶细胞被媒体或YCP cocultured和刺激(400海里)48 h。靶细胞的数量是衡量实时定量rt - pcr(存在)节中描述2。9。得到了上层清液和干扰素-的水平γ、il - 12、il - 4产品由ELISA测定(研发系统)根据制造商的协议中描述的部分2。8。

2.11。统计分析

Prism 5.0计划(美国GraphPad软件,拉霍亚,CA)是用于统计分析。所有的结果都表示为平均值±标准偏差(SD)。每个值的意思是至少三个独立的实验。Mann-Whitney测试或克鲁斯卡尔-沃利斯检验之后,邓恩的事后测试来确定执行在适当的地方显著差异。

3所示。结果

3.1。YCP充当第二信号在细胞活化T细胞

脾T细胞被孤立的尼龙纤维纯度> 90%(数据未显示),然后用YCP培养或阳性对照为ConA 96孔板的预镀aCD3功能性抗体或PBS。T细胞增殖测定48 h后MTT试验。结果表明,YCP不能单独刺激T细胞。与预镀aCD3 YCP可能大大刺激T细胞增殖在剂量依赖性的方式(图1(一))。除了增殖效果,YCP对细胞因子的影响生产的T细胞是评估。天真的上层清液收集和YCP-stimulated细胞被ELISA检测。与预镀aCD3 YCP可能大大刺激T细胞产生干扰素-γ剂量依赖性的方式(图1 (b))。

获得的刺激与YCP T细胞表明YCP可能是一个有效的第二信号识别激活就像costimulatory分子的贡献在T细胞刺激能促进细胞增殖和产生干扰素-γ。

3.2。增强YCP对DCs的影响

DCs生成与gm - csf和il - 4未成熟dc表示数量的CD80、CD86和MHC II级分子充分成熟dc。确定monocyte-derived树突细胞的纯度,CD11c每天通过流式细胞仪检测。7天后代gm - csf和il - 4的表达CD11c已经显著提高到82.6%。然后跟着介质或B16F10Ag 48 h, CD11c的表达式分别为88.2%和89.3%(图2(一个))。确定dc的成熟,各种细胞表面表达的模式制造商编码MHC II, CD80 (B7-1)和CD86 (B7-2)被流式细胞仪检测。有更多成熟dc coexpressed MHC II级和CD11c刺激Ag)和YCP(图2 (b))。CD80和CD86 DCs在不同的时间(6 h, 12 h, 24小时和48小时)后刺激与媒介/ Ag / YCP + Ag /有限合伙人+ Ag)通过使用FlowJo程序(图进行了分析2 (c)- - - - - -2 (f))。刺激B16F10Ag, CD80和CD86的表达DCs显著增加到66.3%和54.1%在48 h与媒介集团。这样的刺激被推迟24 h后成熟。YCP协助CD80和CD86的表达的增强DCs表明YCP可以促进dc的成熟。

DCs培养7天的刺激与媒介/ Ag / YCP + Ag /有限合伙人+ Ag) 48 h。得到了上层清液和il - 12水平的作品被ELISA测定。YCP可能大大刺激DCs产生il - 12在剂量依赖性的方式(图2 (g))。刺激由DCs建议YCP YCP是一个激活的细胞表面分子(MHC II级、CD80和CD86)表达和il - 12在DCs生产。

3.3。toll样受体是YCP T细胞上的受体和DCs

通常控制发挥了直接作用的T细胞激活包括增殖、细胞因子分泌,upregulation激活标记,和终端分化。YCP B细胞上的受体,TLR2和TLR4的病例被报告在我们之前的研究中,基于这些发现,我们集中研究的功能相关性TLR2和TLR4 YCP-mediated TCR激活。Fluoresceinamine-labeled YCP (fl-YCP) (100 - 1600 nM)。T细胞是孵化Pam3CSK4(善意TLR2配体),有限合伙人(善意TLR4配体),和anti-mouse CD28 (CD28配体)为1 h,其次是fl-YCP (100 - 1600 nM) 1 h在竞争实验中分析了流式细胞术(图3(一个))。结果表明,YCP TLR2和TLR4可能的配体与Pam3CSK4竞争和有限合伙人。CD28不是YCP的绑定目标;换句话说,YCP T细胞激活是通过信号提供的TLR的信号B7-1 / B7-2: CD28途径。为了证明这个结论,我们阻止受体与特定的抗体。T细胞刺激与YCP anti-TLR2的存在或anti-TLR4然后受到扩散试验和总干扰素-γ量化。抗体TLR2和TLR4显著降低YCP的扩散效应和抑制干扰素的诱导γ生产的存在aCD3(功能性抗体)提供第一信号激活的细胞受体(数字3 (b)和3 (c))。anti-TLR2在场的情况下,T细胞增殖降低了12.1%。anti-TLR4在场的情况下,T细胞增殖降低了39.3%。anti-TLR2的存在,干扰素的生产γ是下降了13.1%。anti-TLR4的存在,干扰素的生产γ是下降了33.8%。

减少被发现在联合治疗与anti-TLR2 anti-TLR4协同作用的。因此,我们建议TLR2和TLR4可能与激活的细胞功能相关YCP作为第二个信号。

随着DCs的主要受体,通常已报告是重要的多糖疫苗约束力的目标。Anti-TLR4显著抑制白介素生产的感应(51.8%)。进一步证实这种说法,TLR2和TLR4的影响损失在YCP活动在DCs要么B6.129 -评估/ JNju (TLR2 KO)或C57BL / 10 scnjnju (TLR4 KO)老鼠。CD80和CD86减少的upregulations TLR2 KO(2.5%和1.4%)和TLR4 KO小鼠(8.5%和5.6%),尤其是在TLR4 KO小鼠(图3 (e))。这些发现提供了令人信服的证据,TLR4负责激活YCP DCs。

3.4。YCP增强特异性免疫对小鼠黑素瘤细胞通过激活T细胞和提高DCs的能力

DCs培养7天被B16Ag刺激48 h。T细胞培养与mDCs比10:1 48 h效应细胞(约2×10⁶细胞/毫升)。B16F10细胞的密度resuspended 2×10⁵细胞作为靶细胞/毫升。效应细胞和靶细胞被媒体或YCP cocultured和刺激(100 - 800 nM) 48 h。靶细胞的数量被MAGE-A3的信使rna定量测量。YCP不能直接杀死靶细胞(没有效应细胞(图)4(一)),可以显著减少MAGE-A3的信使rna靶细胞与DCs的孵化和T细胞在剂量依赖性的方式(图4 (b))。结果表明,YCP增强靶细胞的破坏方式存在剂量依赖的相关性。

在孵化期间,CD4细胞的数量⁺T细胞、CD8⁺T细胞显著增加在96 h(图4 (c))。YCP的存在可以加强两个CD4这种现象⁺T细胞、CD8⁺T细胞得到改善(图4 (c))。CD4的比率⁺/ CD8⁺保持稳定在(中等)(YCP)这意味着T细胞维持生物体内平衡。干扰素-的水平γ、il - 12、il - 4产品由ELISA测定。干扰素的生产γ白介素来达到更高的水平和il - 4的生产是抑制到一个较低的水平(图4 (d))。结果表明,YCP提高细胞毒性和细胞因子的生产和促进活化的装甲运兵车和细胞介导的免疫反应。

3.5。具体的机制由YCP免疫力增强

TLR4是YCP直流和T细胞的受体,四个细胞组准备学习期间YCP提供的信号在体外特定的免疫反应如下所示(图4 (e)):(a)成熟dc (WT)和T细胞(WT), (b)成熟dc (TLR4 KO)和T细胞(WT), (c)成熟dc (WT)和T细胞(TLR4 KO),和(d)成熟dc (TLR4 KO)和T细胞(TLR4 KO)。

DCs来自不同组织培养7天被B16Ag刺激48 h。从不同的组T细胞培养与mDCs比10:1 48 h效应细胞(2.2×10⁶细胞/毫升)。B16F10细胞的密度resuspended 2×10⁵细胞作为靶细胞/毫升。效应细胞和靶细胞被媒体或YCP cocultured和刺激(400海里)48 h。的mRNA水平MAGE-A3靶细胞(图4 (f))和干扰素-的水平γ、il - 12、il - 4产品测量(图4 (g))。结果表明,YCP可以抑制il - 4的生产和诱导il - 12和干扰素的生产γ通过TLR4在T细胞,诱导il - 4的生产,白介素、干扰素-γ通过从这些TLR4在DCs在体外为研究YCP-mediated特定免疫细胞模型。增强靶细胞被杀死了T细胞的激活和DCs通过TLR4 YCP引起的。

4所示。讨论

许多含碳水化合物类的《结构已被证明对一个成功的免疫反应。在我们先前的研究YCP证明刺激激活的巨噬细胞和B细胞(20.,26,近年来一些多糖作为佐剂和刺激DC诱导T细胞反应已报告(11- - - - - -13]。然而,很少有人知道如何YCP的分子机制可以通过直流干扰特定免疫介导T细胞。因此,我们关注的是如何YCP对DCs和T细胞执行其功能。我们目前的研究表明,YCP-induced TLR激活可以诱导细胞活化功能抗体的存在aCD3 [27)这是“第一”的信号识别激活T细胞。提供“第一”的信号时,YCP也可以提高细胞受体激活。

有限合伙人是用于其他研究来增强抗原驱动扩散在直流28,29日]。之前的功能成熟树突状细胞已被证明与水平的提高有关某些T细胞costimulatory分子(24,30.,31日]。骨骨髓来源树突状细胞gm - csf和il - 4展览中生成一个中间表型和成熟阶段在体外抗原递呈能力(24]。在我们的研究中,治疗水平有限合伙人可能导致增加的标记DCs在协议与以前的观测。此外,有限合伙人将修改B7 (B7-1和B7-2)表达单核细胞(31日]。YCP表明这可能增加CD80的表达,在DCs CD86和mhc ii,然后强烈增强T细胞激活。然后,激活T细胞可以产生干扰素-γ。此外,Th1-type细胞因子il - 12的分泌和干扰素-γ被YCP增加th2型细胞因子il - 4在减少吗在体外。诱导免疫反应的免疫佐剂的可取的特点。辅助细胞通过分泌淋巴因子放大本身。这个动作的YCP可以辅助增强细胞反应以及免疫系统对外来抗原的反应。类似的其他真菌的影响碳水化合物已经被几个现有的文献报道。王等人。32)发现Sarcodon imbricatus多糖(SIP)可以显著促进和干扰素- - 2的生产γ,这表明SIP可以积极调节免疫反应;与此同时SIP显著降低il - 4的内容负调控免疫反应。吉野et al。33)调查了香菇多糖对调制Th1、Th2反应的影响患者的消化系统癌症。香菇多糖治疗后,CD4细胞⁺干扰素-γ⁺淋巴细胞百分比显著增加,而CD4细胞⁺il - 4⁺淋巴细胞百分比显著下降,这表明香菇多糖可以提高Th1、Th2之间的平衡。灰树花多糖为D-fraction,隔绝(猪苓frondosa),可以减少Th2细胞因子il - 4的表达但显著增加Th1细胞因子的表达干扰素-γ在CD4⁺T细胞也增加IL-12p70产量,这表明D-fraction促进CD4细胞的分化成Th1细胞⁺T细胞(34]。CD4⁺T细胞通过分泌细胞因子刺激增强免疫反应细胞毒性T细胞反应(Th1细胞因子)或抗体反应(Th2细胞因子)35]。除了本研究的结果,我们之前的研究表明,YCP也能生成一个健壮的B细胞的抗体反应。黑色素瘤相关抗原(法师)被发现在黑色素瘤肿瘤相关抗原(taa)和一些蛋白质,如MAGE-1 MAGE-A3, MAGE-A10,被认为是检测和诊断黑色素瘤的目标(36]。MAGE-A3非癌症细胞中不表达,是非常具体的mRNA肿瘤标记,它可以被T细胞攻击B16F10细胞在一个高度特定的方式(37- - - - - -39]。YCP不能直接杀死黑素瘤细胞但可以显著降低靶细胞的数量与DCs的孵化和T细胞。

toll样受体激动剂,如Pam3CSK4,有限合伙人,促进特区和演示了T细胞激活和通常的接触感应直流和T细胞研究在过去的几年里40,41]。竞争性抑制TLR2和TLR4通过使用Pam3CSK4,有限合伙人与fl-YCP作为配体,表明潜在的YCP在T细胞受体。抗体阻断实验和实验提供了令人信服的证据表明TLR4基因缺陷负责激活在直流YCP TLR2和TLR4 YCP负责T细胞活化。

5。结论

总之,我们证明YCP作为T细胞激活的“第二个”信号促进T细胞增殖和干扰素-γ分泌通过TLR2和TLR4。YCP能有效促进il - 12的分泌和表达的标记(CD80、CD86和MHC II)通过TLR4在DCs上。数据支持,YCP是一个很好的候选肿瘤特异性免疫治疗以增强信号的抗原表达过程,抗原T细胞增殖,Th1细胞因子诱导肿瘤特异性死亡。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

陈歌,跑叮了同样的工作。

确认

这项工作得到了国家重大科技项目的中国创造重大新药(2012 zx09502001 - 004),国家自然科学基金委(81273496和81273496号),专门研究高等教育的博士项目基金(20130096120005)资助的一个项目优先级的学术程序开发江苏高等教育机构(PAPD)和江苏的创新科研团队基金。