文摘

我们评估是否蛋白质限制胎儿生命改变食物摄入量和葡萄糖稳态在成年后通过干扰胰岛素信号转导通过促炎的机制在下丘脑和外围组织。老鼠被分为以下几点:对照组(C);康复组(R);和低蛋白(LP)组。相对食物摄入量大,血清中瘦素减少老鼠相比,LP和R C。促炎和POMC基因mRNA在R组下丘脑调节。下丘脑NPY mRNA表达更多,但一种蛋白激酶磷酸化是减少老鼠LP的C。在肌肉中,限制的一种蛋白激酶磷酸化是高于控制动物。HOMA-IR减少在R和C相比LP组。相比之下,Kitt公司在R是类似于C和老鼠都低于LP。因此,营养复苏并没有改变葡萄糖稳态但产生食欲过盛,可能是因为增加使食欲减退的神经肽表达中和下丘脑炎性过程。长期蛋白质剥夺了老鼠,食欲过盛最有可能导致增加orexigenic神经肽的表达,和葡萄糖维持体内平衡,至少部分的肌肉胰岛素敏感性增加。

1。介绍

流行病学和动物研究支持之间的关系不良胎儿生长和肥胖的后续发展,2型糖尿病和代谢综合征(1- - - - - -4]。这种发育编程被解释为“节俭的表型”假说,提出贫困胎儿营养会导致胎儿的重组,使后代体内的能量储存能力最大化条件下的营养不良一次子宫。然而,这种表型是不利的条件下,正常或存在过多的营养,从而促进肥胖(2,5]。

体重、食物摄取和代谢是由下丘脑,处理中心和外围信号。在下丘脑神经元位于弧(弓状核),PVN(室旁),和PF / LH (perifornical /外侧下丘脑)轴相互沟通,有几个外围因素的影响,包括瘦素和胰岛素(6]。这些激素在食物摄入量的影响发生在部分收敛于一组特定的神经元内弧(7,8),其中包含神经元数量表达orexigenic神经肽Y (NPY)和agouti-related肽(AgRP)和厌食的proopiomelanocortin (POMC)。增加NPY合成和分泌和减少POMC表达式及其裂解产品α-MSH [9肥胖)是各种模型的特征(10,11]。这些变化可能是由于扰动在生产和瘦素和胰岛素的释放。不合适或转移这些激素的浓度由于胎儿营养不良在神经发育和喂养途径分化的关键窗口可能永久结构的后果(12]。此外,增加下丘脑炎症也可能有助于增加对肥胖大鼠暴露于早期营养不良。它已经表明,低蛋白饮食在成年哺乳干扰先天免疫反应,印记永久改变细胞因子的生产。这些动物表现出高循环水平的肿瘤坏死因子(TNF) -α和增加TNF-αmRNA的表达在脾脏和肝脏13]。TNF-α引起下丘脑和外周胰岛素抵抗在啮齿动物(14- - - - - -16)和改变人类胰岛素敏感性和葡萄糖稳态(17,18]。肥胖老鼠的下丘脑炎症的抑制immunoneutralizing抗体TNFαtoll样受体(TLR) 4改善胰岛素信号转导在肝脏16]。在先前的研究19),我们证实成年老鼠在子宫内暴露于低蛋白饮食生活和泌乳,然后美联储定期饮食断奶后表现出食物摄取升高但没有表达肥胖表型或葡萄糖不耐受。有人提议之间的失配程度,预处理和产后环境是后续的主要决定因素的疾病(20.,21)和泌乳时期是一个关键时刻增加肥胖和胰岛素抵抗的风险,即使在教授动物(22]。因此,我们评估是否蛋白质限制胎儿生命改变食物摄入量和葡萄糖稳态在成年后通过干扰胰岛素信号转导在下丘脑和外围组织通过促炎的机制。

2。材料和方法

2.1。动物和饮食

所有涉及老鼠进行的实验程序按照指南的巴西社会科学的动物实验室(SBCAL)和经伦理委员会批准在马托格罗索州联邦大学的(协议号23108.051511 /以10 - 0)。男和处女女Wistar鼠(85 - 90天)从大学获得繁殖的殖民地。交配是通过住房女性与男性在一夜之间,证实了和怀孕检查阴道涂片检查精子的存在。怀孕女性随机分离和美联储从怀孕的第一天直到最后的哺乳等能量饮食包含6%的蛋白质(低蛋白饮食,LP)或17%的蛋白质(控制饮食)。LP饮食中的蛋白质是相同数量的碳水化合物所取代,如前所述[19]。自发的交付发生在怀孕22天,在3天的年龄,大窝减少到8幼崽每个每个母亲,确保标准的垃圾大小。出生后,男性被分为三组:(1)组成的对照组(C)老鼠生和喂奶怀孕期间通过大坝美联储控制饮食,哺乳期,断奶后;(2)恢复组(R)的后代组成的大坝美联储LP孕期饮食但美联储控制饮食在哺乳和断奶后;和(3)的后代组成的一群LP大坝美联储LP孕期和哺乳期饮食和断奶后。在实验期间,老鼠被喂食随意与各自的饮食,可以免费获得水。他们保持在标准光照条件下(12小时光暗循环):24°C。每周食物摄入量和体重记录,数据表示为绝对和相对价值。绝对的食物摄入量是指食物消耗10周的实验期间。评估相对的食物摄入量,食物摄入量是规范化的每100克体重十周的实验时间。在实验周期结束时,老鼠受到葡萄糖和胰岛素耐量试验。测试后,老鼠被斩首,并收集他们的血液进行生化和荷尔蒙分析下丘脑,肝脏和肌肉。

2.1.1。葡萄糖耐量试验

禁食12小时后,葡萄糖(200 g / L)是腹腔内接种一剂2克/公斤体重。血液样本来自一个切口在尾巴的尖端0,30、60、90和120分钟后葡萄糖政府确定血清葡萄糖浓度(Accu-Chek便携式血糖仪,罗氏诊断,德国)。葡萄糖响应葡萄糖耐量试验期间被估计下的总面积计算葡萄糖( 使用梯形方法)曲线(23]。

2.1.2。胰岛素耐量试验

禁食12小时后,胰岛素(常规)腹腔内接种剂量为1.5 U /公斤的体重。血样来自削减在尾巴的尖端0,5、10和15分钟后胰岛素政府确定血清葡萄糖浓度(Accu-Chek便携式血糖仪,罗氏诊断,德国)。葡萄糖反应在胰岛素耐量试验进行评估的不断消失的血浆葡萄糖( ),它从下降的斜率计算对数转换血糖介于0到15分钟(24)胰岛素管理后,当葡萄糖浓度线性下降。

2.2。器官重量和肝糖原含量

内侧剖腹手术后,附睾的白色脂肪和肝组织迅速删除,鲜重。肝脏整除立即被冻结在液氮和存储−80°C,以确定肝脂肪(25和糖原26)的内容。

2.3。生化和激素水平

血液样本被收集和离心机13.000 RPM 30分钟。血清是储存在−80°C的后续测量血清白蛋白浓度的比色法(27”来形容动物的营养状况。商业ELISA包被用来测量血清胰岛素(鼠/鼠标insulin-Cat。# EZRMI-13 K-Millipore)和瘦素(老鼠leptin-Cat。# ezrl - 83 K-Millipore)浓度。

2.4。RNA提取、实时PCR、PCR数组

下丘脑总RNA提取使用试剂盒试剂(美国生命科技,马里兰州),根据制造商的建议。琼脂糖凝胶电泳的RNA完整性检查。互补脱氧核糖核酸的合成进行了使用3μ克总RNA和高容量cDNA逆转录工具包(应用生物系统公司)。样本来自三个下丘脑从C R和LP组织进行了分析使用一个实时PCR数组(鼠炎性细胞因子受体RT²Profiler-SuperArray生物科学公司,弗雷德里克,医学博士,美国),它包含这个条件相关的84个基因+ 5看家基因。还包括控制对每个数组的基因组DNA污染,RNA质量,和普通PCR性能所示http://www.sabiosciences.com/rt_pcr_product/html/parn - 011 a.html。确认数据从PCR获得数组,一些基因被选中执行个体的实时PCR分析。因此,互补的最佳浓度和引物扩增得到的最大效率通过五点,双重的每个基因稀释曲线分析。每个PCR包含20 - 50 ng reverse-transcribed RNA和运行根据制造商的推荐使用TaqMan PCR反应混合液(应用生物系统公司)。Intron-skipping引物从应用生物系统公司(TNFαRn00562055_m1, NPY Rn00561681_m1,摘要意思βRn00580432_m1, POMC Rn00595020_m1)。Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH号码4352338 e)引物被用作控制。GAPDH表达无显著变化检测在不同的实验条件。实时PCR分析进行ABI 7500棱镜检测系统(应用生物系统公司)。1.7数据分析了使用该系统序列检测器(应用生物系统公司)。

2.5。免疫印迹

对实验测量胰岛素信号通过一种蛋白激酶磷酸化,麻醉大鼠腹腔内的开了,动物丸注入生理盐水(100μ(-)或胰岛素(100 L)μL, 10−6米)静脉注射静脉静脉。肝、比目鱼肌和下丘脑标本45秒,90秒,15分钟,分别注射胰岛素后,立即由声波降解法均质(15秒)刚做好antiprotease鸡尾酒(10 L更易与咪唑,pH值8.0,4更易与L EDTA, 1更易/ L EGTA, 0.5 g / L抑肽素,2 g / L抑肽酶,2.5 mg / L亮抑酶肽,30 mg / L胰蛋白酶抑制剂,200μmol / L DL-dithiothreitol和200 mol / L phenylmethylsulfonyl氟化物)。声波降解法后,提取收集的整除,和总蛋白质含量是由蛋白质染色法测定工具包(Bio-Rad实验室、大力神、CA)。样本孵化5分钟在80°C 4 x集中Laemmli样品缓冲(1更易磷酸钠/ L, pH值7.8,0.1%溴酚蓝、50%甘油、10% SDS,巯基乙醇和2%),然后运行在10%聚丙烯酰胺凝胶在120 V 30分钟。的electrotransfer蛋白质硝化纤维素膜(Bio-Rad)进行了一个小时在120 V(常数)含有甲醇和SDS的缓冲区。在检查的效率转移到染色与朱红色年代,细胞膜被封锁在ttb 5%脱脂奶(10更易与三/ L, 150更易与生理盐水/ L, 0.5%渐变20)一夜之间在4°C。AKT和pAKT在细胞膜上发现了两个小时后在室温下孵化与初级抗体(AKT sc1618, pAKT sc7985-R,圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA)(稀释1:500年ttb含有3%干脱脂牛奶)。膜被孵化与二次特定的免疫球蛋白G抗体(稀释1:5000年ttb含有3%干脱脂奶)在室温下了两个小时。增强化学发光(SuperSignal西Pico,皮尔斯)后孵化与辣根peroxidase-conjugated二级抗体被用于检测放射自显影法。带强度量化了光学微(Scion形象,弗雷德里克博士)。

2.6。统计分析

手段和SEM的结果给出了老鼠的数量( )表示。Bartlett的方差的同质性测试最初是用来检查数据的符合假设的参数方差分析。必要时,方差数据进行对数转换为正确的异质性或nonnormality [28]。这些数据由单向方差分析进行了分析,其次是LSD测试组之间的个体差异。 值小于0.05被认为是表明统计上显著的差异。

3所示。结果

绝对的食物摄入量高R和C之间的相似的老鼠和在这两种组与LP ( )。表示每克体重时,食物摄入也显著大于LP老鼠比R大鼠( ),而后者食物摄入量明显高于C大鼠( )。虽然R老鼠更大最终体重和附睾的白色脂肪组织(EWAT)比LP老鼠重量( )在实验周期结束时,他们的体重仍明显低于C大鼠( )。R和C老鼠肝脏重量相似,在这两种情况下这些老鼠明显高于LP ( )。肝糖原内容类似于R和LP老鼠,两组表现出更强的肝糖原含量比C组( 和 、职责)。血清白蛋白浓度R和C之间的差别并不是老鼠,和这些值显著高于LP老鼠( )。基底血清葡萄糖水平不是三组大鼠之间的不同。基底血清胰岛素浓度比LP高R老鼠老鼠( 在R老鼠),但低于C大鼠( )。血清中瘦素浓度R和LP老鼠,没有差异,这些值明显低于C大鼠( )(表1)。

表1
绝对和相对食物摄入,最终体重,附睾的白色脂肪组织(EWAT)体重、肝重、肝糖原含量、血清白蛋白、血清血糖、血清胰岛素、瘦素和血清浓度的控制(C),恢复(R),低蛋白(LP)的老鼠。值提出了均值±SEM老鼠每组。平均值与不同上标字母明显不同( < 0.05,LSD测试)。

的意思是总在区域 在回应一个腹腔内葡萄糖负荷是类似于R和C老鼠和老鼠都高于LP ( )(图1(一))。胰岛素抵抗,HOMA-IR计算的指数,减少R和C组相比LP组( )(图1 (b))。相比之下,葡萄糖消失率在腹腔内胰岛素耐量试验( )在大鼠相似观察C R,和这两个值低于LP老鼠的消失率( )(图1 (c))。

(一)
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图1
总区域葡萄糖(下 )曲线从腹腔内糖耐量测试(a),获得内稳态模型评估胰岛素抵抗指数(b) (HOMA-IR)和葡萄糖消失率( )(c)控制(c),恢复(R),低蛋白(LP)的老鼠。酒吧代表±SEM手段。平均值与不同上标字母明显不同( 、迷幻药测试)。

下丘脑(图2(一个))和肝(图2 (c))AKT内容被组织之间的免疫印迹没有明显不同。然而,注射胰岛素后,一种蛋白激酶磷酸化的增量在下丘脑(图2 (b))和肝脏(图2 (d))类似于R和C老鼠,这些组的值高于LP的值组( )。在肌肉,AKT内容(图2 (e))和一种蛋白激酶磷酸化的增量(图的大小2 (f))R和LP组之间是相似的,都是高于C组( 和 、职责)。

(一)
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图2
AKT内容和一种蛋白激酶磷酸化在下丘脑((a)和(b)),肝脏((c)和(d))和骨骼肌((e)和(f)) (c)的控制,恢复(R),低蛋白(LP)的老鼠。一种蛋白激酶磷酸化数据代表nonstimulated的百分比值。老鼠注射生理盐水(未显示)或胰岛素,和45年代,90年代,15分钟后,肝脏,骨骼肌后腿,下丘脑,分别切除和均质材料和方法部分中描述。数据意味着±SEM。平均值与不同上标字母明显不同( 、迷幻药测试)。

在下丘脑的84个基因进行PCR数组(鼠炎性细胞因子受体RT²Profiler-SuperArray生物科学公司,弗雷德里克,医学博士,美国),72个基因(85%)显示显著改变他们的表达水平R和LP组与C组相比。72个基因的改变,52(72%)至少2.5倍调节R组和59(82%)2.5倍下调LP组与C组(图3(一个))。实时PCR验证进行PCR的结果数组,选择和基因分析TNFα和ILβ。肿瘤坏死因子 表达式C之间的相似和LP组和小R组比C和LP组( )(图3 (b)),而ILβ没有三组之间的差异(图3 (c))。

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图3
褶皱变化基因调节下丘脑的实验治疗评估通过PCR数组(a)。TNFα(b)和il - 1β(c) mRNA表达的下丘脑控制(c),恢复(R),低蛋白(LP)的老鼠。数据意味着±SEM。平均值与不同上标字母明显不同( 、迷幻药测试)。

更大的下丘脑NPY mRNA表达检测LP的老鼠比C大鼠( )。NPY mRNA表达没有明显不同R老鼠和老鼠(图C或LP4(一))。R组显示更高POMC mRNA表达与LP和C组( 和 职责。)(图4 (b))。

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图4
NPY (a)和POMC (b) mRNA表达的下丘脑控制(C),恢复(R),低蛋白(LP)的老鼠。数据意味着±SEM。平均值与不同上标字母明显不同( 、迷幻药测试)。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们表明,营养恢复只减毒与蛋白质营养不良相关的典型的食欲过盛。长期喂养的监管是由主循环激素瘦素和胰岛素(29日),总脂肪量(瘦素循环水平成正比30.,31日]。在这项研究中,低内脏脂肪含量与降低血清中瘦素水平恢复和低蛋白质的老鼠。预期的下丘脑NPY upregulation mRNA表达下丘脑POMC mRNA表达的差别,对这些为了应对低循环瘦素水平(32,33)在我们的低蛋白质的老鼠。虽然恢复组也表现出降低血清中瘦素的水平,这些动物显示下丘脑POMC mRNA过度,最有可能由于高恢复组的血清胰岛素水平较低蛋白组。胰岛素政府增加POMC mRNA的表达,同时降低NPY表达和防止食源性肥胖(34]。因此,这使食欲减退的神经肽的表达增加可能是导致食欲过盛的衰减。然而,高下丘脑TNFαmRNA表达这些动物表明下丘脑食欲过盛的炎症过程可能导致不完整的回归和发展的肥胖。

下丘脑的炎症会导致胰岛素抵抗,这可能在肥胖的发展中发挥作用和作为分子肥胖和2型糖尿病之间的联系(35- - - - - -37]。在目前的研究中,营养恢复调节,而低蛋白质饮食表达下调,促炎细胞因子mRNA的表达。磷脂酰肌醇3-kinase PI3K / AKT是一个重要的途径来控制能源体内平衡38),因为它负责抗炎反应,肝糖原的合成,调节刺激运输GLUT4在肌肉39]。因此,我们最初评估下丘脑AKT信号和验证恢复动物并没有显示在下丘脑损伤AKT蛋白表达或磷酸化。有趣的是,低蛋白的老鼠,没有表现出下丘脑炎症信号显示的一种蛋白激酶表达但减少一种蛋白激酶磷酸化。基底的一种蛋白激酶磷酸化没有组间差异(数据未显示),这是合理的减少低胰岛素血症导致一种蛋白激酶信号低蛋白的老鼠的下丘脑。

下丘脑炎症中发挥着重要作用的发展或进展高血糖的表型(40因为葡萄糖稳态是由brain-liver控制轴(16]。下一步是评价一种蛋白激酶信号在肝脏,而巧合的是,我们在下丘脑验证了同样的模式。肝胰岛素抵抗评估一种蛋白激酶磷酸化水平证实了高架HOMA-IR低蛋白质的老鼠。矛盾肝胰岛素抵抗和高糖原水平之间的联系可以解释为减少glucose-6-phosphatse活动通常观察到在动物营养不良41]。在低蛋白的老鼠,肝脏胰岛素抵抗是抵消了增强肌肉的一种蛋白激酶磷酸化和表达,导致外周胰岛素敏感性,反映在增加 价值。这种效应导致更好的葡萄糖耐量,从低 在ipGTT。居高不下的肌肉一种蛋白激酶磷酸化和表达式中观察到恢复动物可能会导致不完整的恢复体重和血清胰岛素水平。低体重与降低血清胰岛素水平显然有着相反的,补偿效应(42]。

总之,我们的结果与假设一致,蛋白质不足产生增加食物摄入营养部分恢复的恢复。维护的数据也提供了直接证据的葡萄糖稳态低蛋白和恢复了老鼠。在老鼠中恢复过来,摄食过量可能导致增加使食欲减退的神经肽表达中和下丘脑炎性过程。长期蛋白质剥夺了老鼠,摄食过量似乎是由增加orexigenic神经肽水平,和葡萄糖维持体内平衡,至少部分的肌肉胰岛素敏感性增加。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢Celso罗伯托·阿方索的优秀的技术援助。这项工作得到了巴西基础CNPq(慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府,格兰特:480659/2011-7),斗篷(Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量优越,格兰特:PROCAD 022/2007),和FAPEMAT (Fundacao德帕罗尽管做Estado de马托格罗索州,格兰特:282448/2010)。这项工作是一个论文的一部分由赫楞巴博萨法da Silva部分要求学院生物科学硕士学位的营养,UFMT。一个奖学金赫楞巴博萨法da Silva FAPEMAT提供的。